全 文 ：第 51 卷 第 11 期
Vol． 51 No． 11
山 东 大 学 学 报 (医 学 版)
JOUＲNAL OF SHANDONG UNIVEＲSITY(HEALTH SCIENCES)
2013 年 11 月
Nov． 2013
收稿日期:2013-02-04
基金项目:广西壮族自治区教育厅桂教科研(201204LX316)。
通讯作者:罗艳红，E-mail:lyhmail2005@ 126． com
文章编号:1671 － 7554(2013)11 － 0042 － 04 DOI:10． 6040 / j． issn． 1671-7554． 2013． 11． 009
溪黄草对肝癌细胞 HepG2 增殖及凋亡的影响
陈源红1，曾怡1，罗艳红2
(右江民族医学院 1．微生物学与免疫学教研室;2． 检验学院，广西 百色 533000)
摘要:目的 探讨溪黄草对人肝癌 HepG2 细胞株增殖和凋亡的影响。方法 MTT 法检测溪黄草对肝癌 HepG2 细
胞增殖的抑制作用，流式细胞仪 Annexin V /PI 双染法检测对细胞凋亡的影响，ELISA 法检测 Bcl-2、Bax 蛋白表达
的情况。结果 不同浓度溪黄草能抑制肝癌细胞 HepG2 细胞的生长 ( P ＜ 0． 01) ，并具有浓度和时间依赖性。
0． 75 g /μL的溪黄草作用于 HepG2 细胞 3、6 h后，结果表明溪黄草能显著促进细胞凋亡，具有时间依赖性，与阴性
对照组比较有统计学差异( P ＜ 0． 05) 。0． 75 g /μL 溪黄草作用 HepG2 细胞 6 h 后，Bcl-2 蛋白表达降低，Bax 蛋白
表达增加，与阴性对照组比较，亦具有统计学差异( P ＜ 0． 05) 。结论 溪黄草能抑制 HepG2 细胞的体外增殖，且
抑制作用表现出时效关系，其机制可能与促进细胞凋亡、下调 Bcl-2 蛋白及上调 Bax 蛋白表达有关。
关键词:肝癌;溪黄草; 细胞增殖; 细胞凋亡
中图分类号:Ｒ735． 7 文献标志码:A
Effect of Ｒabdosia lophanthoides on the proliferation and
apoptosis in hepatoma carcinoma cell line HepG2
CHEN Yuan-hong1，ZENG Yi1，LUO Yan-hong2
(1． Department of Microbiology and Immunology;2． Department of Laboratory Medical Science，
Youjiang Medical School for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China)
Abstract:Objective To investigate the effect of Ｒabdosia lophanthoides on the proliferation and apoptosis in hepatoma
carcinoma cell line HepG2． Methods The effect of Ｒabdosia lophanthoides on the cell proliferation and cell apoptosis
was detected by the MTT method and flow cytometry． The expressions of Bax and Bcl-2 protein were detected by the
ELISA method． Ｒesults After incubation with different concentrations of Ｒabdosia lophanthoides，the growth of hepa-
toma carcinoma cell line HepG2 was significantly inhibited in a time-and dose-dependent manner(P ＜ 0． 01)． After the
cells were treated with 0． 75 g /μL Ｒabdosia lophanthoides for 3 and 6 h，the apoptosis was induced． The apoptosis of
hepatoma carcinoma cell line HepG2 was significantly inhibited in a time-dependent manner． Compared with the nega-
tive control group，the cell apoptosis was induced significantly (P ＜ 0． 05)． After treated with 0． 75 g /μL Ｒabdosia
lophanthoides for 6 h，the expression of Bcl-2 protein decreased，and the expression of Bax protein increased． The differ-
ence had statistical significance (P ＜ 0． 05)． Conclusion Ｒabdosia lophanthoides can inhibit cell proliferation of hepa-
toma carcinoma cell line HepG2 in a time-and dose-dependent manner． The mechanism might relate to inducing cell ap-
optosis，decreasing the expression of Bcl-2 and increasing the expression of Bax．
Key words:Human hepatocellular carcinoma;Ｒabdosia lophanthoides;Proliferation;Apoptosis
溪黄草为 2010 年版《中华人民共和国药典》中
记载的唇形科植物线纹香茶菜 Ｒabdosia lophan-
thoides(Buch． -Ham． ex D． Don)Har 的干燥地上
部分［1］，有清热利湿、凉血散瘀之功效［2］。曾与其
他中药配伍用于治疗急性肝炎、急性胆囊炎、肠炎、
痢疾等消化系统疾病，同时有报道称其在抗肿瘤方
陈源红，等．溪黄草对肝癌细胞 HepG2 增殖及凋亡的影响 43
面也有效果。溪黄草对 CaES-17、Ｒb、Hela 细胞及
肺癌细胞 A549 与 GLC-82、胃癌、乳腺癌等多种细
胞均有抑制作用［3-7］。在体外的抗癌方面，韦金育
等［8］的抗癌实验表明，稀释浓度为 1 ∶100 时对肝癌
细胞呈现明显抑瘤作用 (70． 32%) ，稀释度为
1∶1 000时仍出现明显抑瘤作用(35． 51% )。据此认
为溪黄草有体外抗肝癌作用，但其抑瘤机制尚未清
楚，有必要作进一步探讨。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 实验药物 溪黄草购自广西壮族自治区百
色靖西县药市，经广西民族医药研究院鉴定，为唇形
科植物线纹香茶菜 Ｒabdosia lophanthoides(Buch．
-Ham． ex D． Don)Har的干燥地上部分，符合 2010
年版《中华人民共和国药典》的规定。
1． 1． 2 主要试剂 ＲPMI 1640 培养基，为 Bio
Whittaker Cambrex Company(Belgium)产品;四甲
基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二
甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、胰蛋白酶为
美国 Sigma公司产品;Bcl-2 及 Bax ELISA 试剂盒，
为上海劲马生物科技有限公司产品;Annexin
V-FITC /PI凋亡检测试剂盒为美国 Becton Dickinson
公司产品;胎牛血清，为浙江天杭生物科技有限公司
产品;人肝癌细胞株 HepG2，购自中国科学院昆明
细胞库。
1． 1． 3 主要实验设备 倒置显微镜(Leccia Micr-
osystems CMS GmbH) ，酶联免疫检测仪(德国
BertholdLB941) ，CO2 恒温培养箱 MCO-18AIC(日
本 SANYO) ，电热恒温水浴箱 WH． W21． CU600(上
海医疗器械七厂) ，流式细胞仪(美国 BD 公司)。
1． 2 方法
1． 2． 1 药物制备 100 g 溪黄草加入 10 倍体积蒸
馏水浸泡，先后煎煮 2 次，将煎煮的滤液进行减压蒸
馏浓缩至浓度为 0． 01 g /μL［9］，用 0． 22 μm 滤菌膜
过滤除菌，4 ℃冰箱保存备用。
1． 2． 2 细胞培养 人肝癌细胞株 HepG2 培养于含
10%胎牛血清、100 U /mL 青霉素和 0． 1 mg /mL 链
霉素的 ＲPMI 1640 培养液中，置 5% CO2、饱和湿
度、37 ℃培养箱中培养 24 h，传代后取对数生长期
细胞用于实验。
1． 2． 3 MTT 法检测溪黄草对肝癌 HepG2 细胞增
殖的影响 取对数生长期状态良好的 HepG2 细胞，
调整细胞浓度为 5 × 104 个 / mL，取该细胞悬液
100 μL接种于 96 孔细胞培养板，待细胞贴壁后 24 h
同步化，吸去原培养液，实验分为溪黄草组、5-氟尿
嘧啶(阳性对照)组、阴性对照组和空白对照组，每
孔 200 μL。阴性对照组加细胞悬液，不加药物;空
白对照组只加培养液，不加细胞和药物;溪黄草组设
3个药物梯度(0． 25、0． 5、0． 75 g /μL) ，每个浓度组设
3 个复孔，分别培养 24、48 h 后每孔加入 5 mg /mL
MTT 15 μL，继续培养 4 h，吸弃上清液，加入 150 μL
二甲基亚砜，恒温振荡箱中，37 ℃、100 r /min，振荡
10 min，使结晶物完全溶解。在酶联免疫检测仪
(A570)测量各孔的吸光度值，计算细胞生长抑制
率。HepG2 细胞抑制率(%)=(阴性对照组 A 值 －
实验组平均 A 值)/阴性对照组平均 A 值 × 100%。
1． 2． 4 流式细胞仪 Annexin V /PI 双染法检测溪黄
草对 HepG2 细胞凋亡的影响 根据 MTT 法检测结
果，设置阴性对照组、0． 75 g /μL 溪黄草组、5-氟尿
嘧啶(阳性对照)组。将对数生长期肝癌细胞株
HepG2 细胞用 0． 25% 胰蛋白酶消化后用 ＲPMI
1640 培养液制成 1 × 106 个 /瓶接种于 6 孔板，加入
溪黄草 3、6、12、24 h 后，收集细胞，加入 500 μL 的
Binding Buffer 悬浮细胞，加入 5 μL FITC Annexin
V 和 5 μL PI，轻微振荡，室温下(25 ℃)避光孵育
15 min，流式细胞仪检测。
1． 2． 5 ELISA 法检测 Bax、Bcl-2 蛋白表达的改变
调整 HepG2 细胞浓度为 1 × 106 个接种于 6 孔
板，根据流式细胞仪 Annexin V /PI 双染法结果，分
阴性对照组、0． 25 g /μL 的 5-氟尿嘧啶(阳性对照)
组及 0． 75 g /mL 溪黄草组，阴性对照组中加入等量
含 10%胎牛血清的 ＲPMI 1640 培养液。分别作用
6 h后取细胞培养上清液，4 ℃，12 000 r /m，离心
10 min后取 50 μL，按 Bax ELISA、Bcl-2 试剂盒说
明书操作，用酶标仪测各孔 490 nm 下的吸光度值。
1． 3 统计学处理 采用 SPSS 13． 0 统计软件，结果
均以 珋x ± s 表示，两组均数比较采用 t 检验，多组均
数间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)、
两两比较采用 SNK 法，P ＜ 0． 05 为差异有统计学
意义。
2 结 果
2． 1 溪黄草对 HepG2 细胞增殖的抑制作用 溪黄
草在浓度为 0． 25 ～ 0． 75 g /μL 能显著抑制肝癌细胞
HepG2 细胞的生长(P 均 ＜ 0． 01) ，并且具有浓度和
时间依赖性 。见表 1、图 1、图 2。
44 山 东 大 学 学 报 (医 学 版) 51 卷 11 期
表 1 不同浓度溪黄草对 HepG2 细胞抑制率的影响(珋x ± s)
组别
24 h
A 抑制率(%)
48 h
A 抑制率(%)
阴性对照组 0． 884 ± 0． 021 — 1． 048 ± 0． 021 —
5-氟尿嘧啶对照组 0． 572 ± 0． 015 35． 29 ± 1． 02* 0． 268 ± 0． 023 74． 43 ± 1． 25*
溪黄草(g /μL)
0． 75 0． 231 ± 0． 018 73． 90 ± 1． 15* 0． 157 ± 0． 015 85． 01 ± 1． 50*
0． 5 0． 271 ± 0． 023 69． 30 ± 1． 08* 0． 181 ± 0． 017 82． 70 ± 1． 53*
0． 25 0． 412 ± 0． 025 53． 40 ± 1． 03* 0． 314 ± 0． 019 70． 03 ± 1． 57*
*P ＜ 0． 01 vs 阴性对照组。
图 1 Ｒabdosia对 HepG2 细胞作用的时间效应
Fig． 1 The time effect of Ｒabdosia lophanthoides on HepG2
cells
图 2 Ｒabdosia对 HepG2 细胞作用的浓度效应
Fig． 2 The dose effect of Ｒabdosia lophanthoides on HepG2
cells
2． 2 溪黄草对 HepG2 细胞凋亡的作用 流式细胞
仪检测发现，0． 75 g /μL 的溪黄草作用于 HepG2 细
胞 3、6、12、24 h后，结果表明，在 3 ～ 6 h溪黄草能显
著促进细胞凋亡，HepG2 随着溪黄草作用时间的延
长，细胞凋亡率增加，但作用 12 h 后所测得的凋亡率
开始下降，24 h 不能测得，根据流式细胞术Annexin
Ⅴ /PI的原理，随着作用时间的增加，细胞坏死过
多，凋亡率不能有效测出。结果显示，检测凋亡的最
佳时间为溪黄草作用 6 h后。见表 2。
表 2 HepG2 细胞经溪黄草处理后各组凋亡率(珋x ± s，%)
组别 3 h 6 h 12 h 24 h
溪黄草组 20． 3 ± 2． 0* 66． 2 ± 1． 1＊＊14． 3 ± 1． 3* —
5-氟尿嘧啶对照组 7． 9 ± 1． 1 63． 2 ± 1． 5＊＊ 6． 2 ± 1． 5 —
阴性对照组 7． 7 ± 1． 3 9． 5 ± 1． 2 8． 9 ± 1． 2 9． 1 ± 1． 0
*P ＜ 0． 05，*P ＜ 0． 01 vs 阴性对照组。
2． 3 溪黄草对 HepG2 细胞内 Bcl-2、Bax 蛋白表达
的影响 HepG2 细胞经溪黄草处理 6 h 后，Bcl-2 蛋
白表达降低、Bax 蛋白表达增加，Bcl-2 /Bax 的比值
显著降低，与阴性对照组相比 P均 ＜ 0． 05。见表 3。
表 3 溪黄草对 HepG2 细胞内 Bcl-2、
Bax 蛋白表达的影响(珋x ± s)
组别 Bcl-2 Bax Bcl-2 /Bax
溪黄草组 31． 600 ± 0． 001* # 6． 251 ± 0． 002* # 5． 055* #
5-氟尿嘧啶对照组 32． 620 ± 0． 002 5． 283 ± 0． 003 6． 175
阴性对照组 32． 560 ± 0． 001 5． 255 ± 0． 001 6． 196
*P ＜0． 05 vs 阴性对照组;#P ＜0． 05 vs 5-氟尿嘧啶对照组。
3 讨 论
肝细胞癌(hepatoma carcinoma cell，HCC)是世
界最常见的恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤的第
3 位，手术治疗及放疗、化疗等非手术治疗方案都不
理想［10-11］，中医在 HCC 的治疗方面取得了一定成
就［12-13］。因此，从中药中寻找高效低毒的抗肿瘤新
药具有重要意义。本研究采用 MTT 法观察溪黄草
水提物对 HepG2 细胞体外生长的抑制作用。0． 25、
0． 5、0． 75 g /μL 溪黄草作用于 HepG2 细胞 24 h 的
抑制率分别为 53． 4%、69． 3%、73． 9%，上述相应浓
度溪黄草作用于 HepG2 细胞 48 h的抑制率为
70． 3%、82． 7%、85． 0%。本研究结果表明，溪黄草
在浓度为 0． 25 ～ 0． 75 g /μL 能显著抑制肝癌细胞
HepG2 细胞的生长(P ＜ 0． 01) ，并且具有明显的浓
度和时间依赖性。在抗肿瘤活性成分方面，本研究
所用药物为溪黄草水煮浓缩液，而 Wang 等［5］、Sun
陈源红，等．溪黄草对肝癌细胞 HepG2 增殖及凋亡的影响 45
等［6］研究报道其所含冬凌草甲素可诱导乳腺癌、胃
癌细胞凋亡;Liu等［7］研究显示，冬凌草乙素可导致
肺癌细胞凋亡;海广范等［3］研究表明，冬凌草乙素
可阻滞细胞进入 G2 /M 期，进而诱导 Ｒb 细胞株凋
亡;另有研究报道，冬凌草甲素、乙素和尾叶香茶菜
丙素(kamebakaurin)对 Hela 细胞具有显著的抑制
作用［4］，因此本研究的有效成分可能为冬凌草甲
素、乙素、kamebakaurin，上述成分可能联合起作用，
这有待进一步探讨。
为进一步阐明溪黄草抑制肝癌细胞 HepG2 细
胞生长的原因，本研究从细胞凋亡及其影响因素等
角度进行了深入的探析。用 0． 75 g /μL 的溪黄草作
用于 HepG2 细胞 3、6、12、24 h 后，流式细胞仪检测
结果表明，在 3 ～ 6 h 溪黄草能显著促进细胞凋亡，
HepG2 随着溪黄草作用时间的延长，细胞凋亡率增
加，与阴性对照组比较有统计学差异(P ＜ 0． 01) ，但
作用 12 h后所测得的凋亡率开始下降，24 h 不能测
得。根据流式细胞术 Annexin V /PI 的原理，坏死细
胞的细胞膜不完整，而凋亡细胞的细胞膜仍然完整，
因此，24 h后细胞大量凋亡致坏死使凋亡数据反而
下降甚至不能测出。
肿瘤的发生、发展与细胞凋亡密切相关，而诱导
肿瘤细胞凋亡在肿瘤治疗中具有重要作用。Bcl-2
家族蛋白在细胞凋亡中发挥重要作用，Bcl-2 家族蛋
白功能失调会导致线粒体膜的破坏，线粒体膜内蛋
白释放入胞质，干扰 Caspase 级联反应的激活，导致
细胞不能触发凋亡反应［14］。而 Bax 基因是一种促
进凋亡的基因，属 Bcl-2 同一家族，它过度表达可激
活细胞内 Ca2 +、Mg2 +依赖性核酸内切酶，启动细胞
凋亡基因产物 Bax 蛋白促进细胞凋亡，同时 Bax 蛋
白为细胞死亡调控蛋白，具有拮抗 Bcl-2 抑制凋亡
的作用［15］。研究显示，细胞发生凋亡与 Bax 基因水
平的过度表达和 Bax /Bcl-2 比率的增加相关，Bcl-2
与 Bax 蛋白表达水平的比率决定了异二体(Bcl-2 /
Bax)与同二聚体(Bax /Bax)的比值，当 Bax 同源二
聚体占优势时，细胞易于在诱导剂的作用下发生凋
亡［16-17］。本实验进一步研究发现，HepG2 细胞经
0． 75 g /μL溪黄草处理 6 h 后，Bax 蛋白表达增加、
Bcl-2 蛋白表达降低，Bcl-2 /Bax 比率下降，与阴性对
照组比较有统计学差异，因此可能为诱导肝癌细胞
株 HepG2 凋亡的机制之一。
综上所述，溪黄草可通过抑制 Bcl-2 蛋白的表
达水平，促进 Bax 蛋白的表达，从而诱导肝癌细胞
HepG2 的凋亡，抑制其增殖，为溪黄草成为新型的
抗肿瘤药物及临床应用提供实验数据。
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( 编辑: 张彩凤)