全 文 ：半边旗二萜类化合物的液-质联用图谱鉴定
邓亦峰　梁念慈
(广东医学院 、广东省天然药物研究与开发重点实验室 ,广东湛江 524023)
　　摘要　用高效液相色谱-大气压化学电离源质谱联用的方法建立总离子流色谱图 , 以色谱保留时间和色谱峰
的质谱图为依据 , 对不同地区和不同采集时间的半边旗 LC-M S图谱中的主要色谱峰进行了对比分析和质谱鉴定。
色谱分析条件:色谱柱为 Diam onsil ODS、 4. 6 mm ×150mm , 流动相为 30%CH
3
CN-70% 2mm o l /L NH
4
AC、流速 1. 0
m l /m in, 进样 5μl;质谱分析条件:APCI负离子源 , 质谱扫描范围 m /z 50 ～ 700,扫描间隔 1 s。以对照品为参比 ,鉴定
出贝壳杉烷系二萜类化合物 4F、5F和 6F的色谱峰;根据色谱行为和质谱行为 ,推测出 6F的 16位饱和态化合物以
及 4F和 5F的甙。对不同地区和采集时间的半边旗 LC-M S指纹图谱中的主要色谱峰进行比较分析得出 , 广州市郊
和湛江地区以及在 11 ～ 12月采集的半边旗中 5F含量较高。本法简便 、快速 , 可为半边旗中二萜类抗癌化合物的
深入研究和新药资源的开发提供参考。
关键词　高效液相色谱-质谱联用;半边旗;二萜类化合物;鉴定
　　半边旗 (P teris sem ipinnata L.)为凤尾蕨科植
物 ,始载于《岭南采药录》,收载于《中药大词典》,民
间认为有解毒 、消肿及治疗蛇伤的功效 ,国外文献报
道其含二萜等化合物〔1〕 ,尚未被国家药品标准和地
方药材规范收载 。梁念慈等人发现半边旗中具有不
饱和 α、β-亚甲基环戊酮基团结构的贝壳杉烷型二
萜类化合物具有强烈的抗癌作用 ,继而分离鉴定出
二种有很强抗肿瘤活性的贝壳杉烷系二萜类化合物
5F(En t-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-olic acid)
和 6F (Ent-11 α-hydroxy-15-oxo-kau r-16-en-19-o l-
ide)〔2、3〕。半边旗的提取物及有效成份 5F和 6F已
获得国家发明专利(专利号 ZL95119380.5)。
由于半边旗贝壳杉烷系二萜类化合物中含有
5F对应的 16位双键饱和态化合物 4F(无抗肿瘤活
性 、无紫外吸收)这样的组份 ,采用通常的紫外检测
器不能完全反映提取物的整体化学成分。本实验采
用高效液相色谱 (HPLC)-大气压化学电离 (APC I)-
质谱(MS)联用方法建立半边旗二萜类化合物色谱
图 ,对广西南宁地区 、广东湛江地区和广州地区半边
旗中的几个贝壳杉烷系二萜类化学成分作了鉴定 ,
并探讨了它们的含量分布特点 。该项工作为半边旗
抗肿瘤药物的质量标准建立 ,新药资源的开发和深
入研究提供了实验依据。
1 　仪器与试药
岛津 LCM S-8000α型高效液相色谱-质谱联用
仪 (含在线脱气机 ,两台 LC-10AVP高压输液泵 , SPD-
10AVP紫外检测器 ,柱温箱 , APC I源接口 ,四极杆质
谱检测器)。
CH 3CN(HPLC级 ,美国 Fishe r公司);乙酸铵 、
分析纯;三重蒸馏水。
6F、5F、 4F对照品 (本院医用生化研究所提
供),由日本东京理科大学药学部和广东医学院医
用生化研究所鉴定;半边旗生药材由湛江海洋大学
杨燕君副教授鉴定 ,采集于广西南宁地区 、广东湛江
地区和广州市郊。
2　方法与结果
2.1 　色谱条件 　色谱柱为 D iamonsil C18 , 5μm
(4.6mm ×150mm);流动相 A为乙腈 ,流动相 B为 2
mmo l /L醋酸铵水溶液 , A∶B =30∶70;流速 1 m l /
m in,进样 5 μl。
2.2　质谱条件　APC I负离子源 ,电极温度 400℃,
电晕 (Corona)电压 - 4.0 kV ,离子传输电压 +55V、
温度 250℃,偏转电压 - 40V ,检测器电压 1.6 kV ,
喷雾氮气流速 2.5 L /m in,采用质谱扫描方式 , m /z
范围 50 ～ 700 ,扫描间隔 1 s。
2.3　样品制备 　取 1.00 g半边旗生药 (干燥 ,粉
碎 、过 40目筛 ),在 10 m l具塞试管中加入三氯甲烷
10.0 m l,室温下超声波提取 2m in,浸泡 12 h后再超
声提取 2 m in,以脱脂棉过滤 。分取滤液 1.0 m l入
1.5 m l Eppendorf离心管 ,室温下挥干三氯甲烷 ,然
后以 1.00 m l的 50%甲醇-水 (v /v)超声溶解残留
物 , 10000 r /m in离心 10m in,取上清液备用。
2.4　二萜类化合物的 HPLC-APC I-MS色谱图　上
述样品溶液进行 HPLC-APC I-MS分析 ,得到半边旗
提取物二萜类化合物的总离子流色谱图 , 如图 1。
色谱峰在 12.5m in之前全部出完 。
图 1　半边旗的总离子流图
278 中药材第 28卷第 4期 2005年 4月
2.5 　总离子流图解析　图 1中的 1、2、3、4、5、6号
峰的质谱图如图 2。
图 2　总离子流图中色谱峰的质谱图
　　图中 3、4、6号色谱峰均检测到 [M-H ] -1和 [M-
H2O-H ] -1准分子离子峰 ,它们的色谱保留时间和质
谱图分别与 6F、5F、4F对照品 (相对分子量质量分
别为 346、332、334)相一致 ,可确定它们的归属 。 5
号峰的质谱图也出现 [M-H ] -和 [M-H 2O-H ] -1准分
子离子峰 ,与 3号峰质谱图出现的 [M-H ] -1和 [M-
H2O-H ] -1准分子离子峰 m /z数值间均相差 2,且 5
号峰的色谱保留时间更大 ,同 5F与 4F之间的 [M-
H ] -1和 [M-H2O-H ] -1准分子离子峰对应峰关系相
同 , 5号峰可鉴定为 6F的 16位双键饱和态化合物。
图中 1号色谱峰的质谱图的基峰与 4号 5F色
谱峰的质谱图基峰相同 , 2号色谱峰的质谱图的基
峰与 6号 4F色谱峰的质谱图基峰相同 ,且都有相同
的 [M-H2O-H ] -1峰;在乙腈-醋酸铵水溶液流动相
中 , 1号色谱峰质谱图中 m /z 553与 5F的 M之间和
2号色谱质谱图中 m /z 555与 4F的 M之间均符合
[ (M +g lc)+AC] -1 =M +162+59关系 ,且 1号和 2
号色谱峰在反相液相色谱中保留时间相应地比 5F
和 4F短 ,推测 1号色谱峰为 5F的甙 、2号色谱峰为
4F的甙 。由于糖基在 APC I-MS中响应不佳 , 1号和
2号色谱峰的质谱图中未能观察到糖基的质谱峰 ,
我们将结合其它方法对该两组份作进一步鉴定 。
2.6 　不同产地和时间采集的半边旗二萜类化合物
总离子流图比较　按 2.1和 2.2方法对 11批不同
产地与不同时间采集的半边旗生药 (如表 1)进行
HPLC-APC I-MS分析 ,得到它们的总离子流色谱图 ,
如图 3。
图 3　11批半边旗生药的总离子流色谱图
　　对图 3进行对比分析可看出 ,广州市郊和湛江
地区的样品中 5F含量较高 ,南宁地区的 5F含量较
低;广州市郊的样品中含有 6F(其活性为 5F的 100
倍),南宁地区和湛江地区的样品中 6F含量甚微;
同一地区相比 , 11-12月的样品中 5F含量较高。
　表 1 　半边旗样品来源及编号
编号 来源 采集时间
1 南宁地区 1998-12
2 南宁地区 1999
3 湛江地区 1999-09
4 湛江地区 1999-11
5 湛江地区 1999-12
6 湛江地区 2000-05
7 湛江地区 2000-06
8 湛江地区 1999-08
9 广州市郊 2001-11
10 广州市郊 2001-12
11 广州市郊 2002-04
2.7　方法学考察　以广州市郊采集的半边旗生药
(10号)为供试品按本方法建立色谱图 ,以 5F峰面
积作为考察指标进行精密度 、稳定性和重现性试验:
平行测定 5份样品 , 5F峰面积的 RSD为 5.93%。
取其中一份样品连续进样 5次 , 5F峰面积的 RSD为
2.58%;同一份样品分别相隔 0、1、3 h检测 5F峰面
积 ,最大相对偏差为 4.16%。
279 中药材第 28卷第 4期 2005年 4月
3 　讨论
3.1 　样品制备　5F、6F和 4F微溶于甲苯 ,溶于氯
仿 ,在 101大孔吸附树脂吸附分离实验中它们可被
50%甲醇-水(v /v)洗脱。因此 ,选用三氯甲烷超声
提取半边旗生药 ,然后以 50%甲醇-水 (v /v)超声溶
解 ,所得到的指纹图谱较好地表征了 5F、6F等贝壳
杉烷型二萜类化合物 。
3.2 　检测方法选择　色谱鉴定应根据活性化合物
及其共有的化学成分的性质选择合适的检测方法 。
半边旗中活性化合物 6F、5F与相应 16位双键饱和
态化合物的极性相近 ,以紫外检测方法难以检出饱
和态化合物 。本实验采用通用检测方式 APC I-MS
与 HPLC联用的分析方法 ,实现了对贝壳杉烷型二
萜类化合物作精细分辨 ,结合与结构相关的分子量
信息和色谱行为 ,推测出 6F的 16位饱和态化合物
及 4F和 5F的甙 。HPLC-APC I-MS联用仪虽然较昂
贵 、稳定性不如紫外检测器 ,但不失为简捷 、快速的
分析鉴定手段 ,对新药资源的开发和深入研究帮助
很大 。
致谢:部分半边旗样品为苟占平老师采集。
参 考 文 献
1　M au rakam i T, TanakaN.Occurrence, struc ture and taxonom-
ic omp lications o f fern constituents. P rog Chem Organ ic Na t
P rod, 1988, 54∶1
2　张晓 ,等 .半边旗有效成分及抗肿瘤活性研究 . 中国药
学杂志 , 1997, 32(1)∶37
3　L i JH , e t a.l Effe cts of an titum or com pounds iso lated from
Pteris sem ipinnata L on DNA topo isome rase s and ce ll cyc le
o fHL-60 cells.Ac ta Pharm aco l Sin, 1999, 20(6)∶541
(200 - 10 -22收稿)
Investigation on the Chromatogram ofD iterpenoids in P teris sem ipinna ta byHPLC-APCI-MS
Deng Y ifeng, Liang N ianc i
(Key Labo ra to ry o fN atu ra l D rug s Resea rch and Deve lopm en t o f Guangdong, GuangdongM edica l Co llege, Zhanjiang 524023)
Abstrac t　To identify and compare them a in peaks o fH PLC-APC I-M S FP o f the dite rpenoids in P teris sem ipinnata colle cted from
diffe rent reg ion and tim e, a quadrupo le mass spectrom e te r coupled w ith atmosphe ric pressure chem ica l ioniza tion in te rface w as em-
p loyed a s a de tector fo rHPLC to e stablish to ta l ion chrom atog raphy.HPLC re tention tim e andMS spec trum we re used to iden tify com-
prehensive ly.4F, 5F and 6F w ere identified from the chrom atography com paring w ith the ir standards.The satura ted state of 6F and g ly-
coside o f 4F and 5F we re inferred.The con tent of 5F in sam ples co lle cted from reg ion of Guang zhou o r in Nov. and Dec.we re com para-
tive ly highe r.Th is me thod is h ighly effective and fast, which can be app lied to resea rch and deve lop fo r diterpenoids in P teris sem ipin-
nata L as new antitumo r d rug resource.
K ey words　H PLC-APC I-M S;P teris sem ipinnata;Diterpeno ids;Identify
《中药材》杂志征稿内容
1　药用植物栽培 ,包括野生药材变家种 , 引种药材和异地药材的引种驯化 , 道地药材的研究 , 培育优良品种 ,防治病虫害 ,改
革耕作制度 ,提高产量 、质量 ,组织培养 , 药用真菌的栽培及 GAP基地的建设等。
2　动物药研究 ,包括药用动物的饲养和管理 , 资源 、生态 、习性的调查与观察 ,野生变家养与异地引种品种的驯化 ,用新技术 、
新方法提高动物药的产量与质量 ,动物药的药理 、药化和临床实验等。
3　中药材鉴别 ,加工炮制和商品养护。
4　中药资源的合理开发和利用。
5　中药化学 ,药理与临床试验。
6　新技术 、新方法在中药材上的应用。
7　药材专业户 、药材经营部门谈生产 、经营管理经验 ,药材产销预测及市场动态等。
8　基础理论讲座 ,文献综述 , 专论 ,考证 , 译文 ,中药剂型改革 , 制剂 ,临床用药 , 药膳 ,经验以及报道中药店(房)的文章等。
280 中药材第 28卷第 4期 2005年 4月