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顶芽狗脊提取物抑菌活性的初步研究
欧阳蒲月1，2，杨 斌2，陈功锡2* ，王 晶2
(1. 广东食品药品职业学院，广东 广州 510520;2. 吉首大学 /植物资源保护与利用湖南省高校重点实验
室，湖南 吉首 416000)
摘要 目的:对湘西民间药用植物顶芽狗脊(Woodwaria unigemmata)提取物的抑菌活性物质进行研究，为开发
新型、安全、高效的临床用药提供依据。方法:用超声提取的方法得到顶芽脊四个部位的粗提物，并用采用不同溶
剂及不同极性萃取物对提取物进行萃取用来比较细菌活性大小，用含提取物滤纸片抑菌圈法测定细菌活性。结
果:(1)通过不同部位提取物的抑菌试验，发现只有叶柄和根茎含有抑菌活性物质。(2)顶芽狗脊提取物对金黄色
葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌的最低抑菌浓度分别为 0. 8 g /mL、0. 6 g /mL、1. 0 g /mL，最小杀菌浓度均为 2 g /mL，
但对酵母菌无效。(3)具有最佳抑菌效果的提取溶剂为偏碱性的 60%乙醇溶液。通过不同极性溶剂的抑菌试验
表明，抑菌活性物质易溶于石油醚、乙醚等非极性溶剂。(4)顶芽狗脊的抑菌活性物质可能为黄酮类物质，且呈酸
性、有表面活性，不含生物碱。该活性物质对酸、高温、紫外线稳定性良好，但在强碱条件下失活。结论:对几种菌
的敏感性由强到弱依次为:金葡菌 ＞大肠杆菌 ＞痢疾杆菌，对酵母菌无效;顶芽狗脊的抑菌活性物质可能为黄酮类
物质，且呈酸性、有表面活性，不含生物碱且稳定性良好，但顶芽狗脊的抑菌活性物质需要进一步的分析。
关键词 顶芽狗脊;提取物;抑菌活性;稳定性;化学成分
中图分类号:R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2012)01-0111-05
收稿日期:2011-05-26
基金项目:植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室开放项目(JZ200906)
作者简介:欧阳蒲月(1978-) ，女，硕士，讲师，主要从事药用植物学研究;Tel:13500012341，E-mail:ouyangpy@ gdyzy. edu. cn。
* 通讯作者:陈功锡，Tel:15874639263，E-mail:chengx@ jsu. edu. cn。
顶芽狗脊Woodwaria unigemmata(Makino)Nakai
属于乌毛蕨科狗脊属植物，别名顶芽狗脊、管仲、冷
卷子疙瘩(四川)等，主要分布于湖北、湖南、江西、
福建、广东、广西及台湾等地，其突出特征为叶轴顶
部羽片腋中着生一个有红棕色鳞片的大芽孢(故
名) ，叶片羽裂达 4 /5〔1〕。顶芽狗脊含有儿茶酚衍生
物、山柰酚、3，7-二鼠李糖苷、东北贯众素(dryocras-
sin)等多种黄酮类成分及鞣质、甾体、三萜等成分，
具有广泛的生理活性。国外报道顶芽狗脊的甲醇提
取物和水提取物对 HIV-1 蛋白酶有明显的抑制作
·111·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 35 卷第 1 期 2012 年 1 月
用，煎剂的 1∶ 8 稀释度对金黄色葡萄球菌均有抑制
作用〔1〕;对离体、在体子宫均呈抑制作用;对血浆、
全血有促凝作用，可以用于产后止血〔2〕。另有报道
顶芽狗脊对流感病毒有灭活作用，对呼吸道 4 种常
见细菌有抑制作用，故临床用于防治病毒性感冒、流
感及流行性脑膜炎。
顶芽狗脊在武陵山区广泛分布，民间使用顶芽
狗脊全株煎水或熏烟预防感冒，并用于治疗一些皮
肤炎症。本文对顶芽狗脊的抑菌活性进行初步研
究，并判断出抑菌活性物质的种类，以为顶芽狗脊的
传统药用价值以及后续研究建立科学根据。
1 材料与仪器
1. 1 细菌株 试验用菌均购自湖南省疾病预防控
制中心，分别为:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus au-
reus)、大肠杆菌(Escheichia coli)、痢疾杆菌(Shigella
dysenteroae)、酵母菌(Saccharomyces)。细菌在37 ℃
培养 24 h，酵母菌在30 ℃培养 72 h，转接 1 次，分别
用生理盐水配成 108 cfu /mL的菌悬液备用。
1. 2 药物与试剂 鲜采顶芽狗脊全株，室温阴干，
将有孢子的叶、纯营养叶、叶柄、根茎分离，45 ℃烘
干，分别粉碎过 100 目筛;95%乙醇、石油醚、乙醚、
乙酸乙酯、正丁醇、浓盐酸、硼酸、氨水、NaOH、琼脂、
牛肉膏、蛋白胨均为国产分析纯试剂，市售黄连素
(四川亚宝光泰药业有限公司)。
1. 3 主要仪器 旋转蒸发仪(RE540 Yamato)、pH
计(HM-205TOA)、冷冻干燥机(FD-1)、培养箱
(PW/10-002)、超净工作台(CCV-1311)、高压蒸汽
灭菌器(SM-52)、分析天平(AEG-220)。
2 方法
2. 1 抑菌活性物质的提取与分离
2. 1. 1 不同部位提取物:取不同部位材料 5 g，加
入 60%乙醇溶液 100 mL，先超声提取 30 min，然后
45 ℃水浴 30 min，趁热过滤，浓缩至 5 mL，使生药浓
度为 1 g /mL。
2. 1. 2 不同溶剂提取物:取试验“2. 1. 1”项中抑
菌效果最强部位材料 5 g，分别用蒸馏水、30%乙醇、
60%乙醇、90%乙醇、0. 1 mol /mL HCl-60%乙醇、0. 1
mol /mL NaOH-60%乙醇作溶剂，按上述方法提取。
2. 1. 3 不同溶剂萃取物:称取试验“2. 1. 1”项中
抑菌活性最强的部位 50 g，加入试验“1. 1. 2”最佳
提取溶液 500 mL，按上述方法提取，重复 1 次，合并
滤液，浓缩至 50 mL，使生药浓度为 1 g /mL。滤液依
次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取(每
次加有机溶剂 50 mL，混匀，静置 30 min，取上层液，
下层液再用以上萃取液重复萃取 2 次，合并萃取
液) ，得到石油醚萃取物、乙醚萃取物、乙酸乙酯萃
取物、正丁醇萃取物以及萃余物，浓缩萃取物，回收
溶剂，萃取物以甲醇定容至 50 mL，使生药浓度为 1
g /mL。
2. 2 抑菌活性测定
2. 2. 1 含药滤纸片准备:用打孔器将定性滤纸打
成直径为 5 mm的小圆片，置培养皿内高压灭菌后，
分别浸泡在不同供试药液中，备用。阴性对照浸泡
无菌水，阳性对照浸泡黄连素溶液。
2. 2. 2 接种:用移液器吸取 100 μL 稀释菌液滴
在直径为 9 cm的营养琼脂平皿中央，用玻璃刮铲将
菌液均匀地涂布于整个平板上，于培养箱内倒置培
养 10 ～ 15 min至培养基表面干燥后，分别将含药滤
纸片均匀地放置在接种了不同受试菌的培养基表
面，每皿放 4 片含药滤纸片，稍加按压使之紧贴培养
基。37 ℃培养箱内培养 24 h 后，取出平板，测量各
纸片周围抑菌圈直径。
2. 3 最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)
测定 取试验“2. 1”项中抑菌效果最佳萃取物稀释
成含生药浓度 4. 0、2. 0、1. 0、0. 8、0. 6、0. 4、0. 2、0. 1、
0. 05 g /mL的试液，取药液 0. 1 mL 加入到盛有 0. 8
mL的液体培养基中，接入 0. 1 mL 的菌悬液，摇匀，
置37 ℃摇床(200 r /min)培养 24 h。若液体培养基
完全清亮，表示无细菌生长，无细菌生长的最小浓度
为最小抑菌浓度。另设未加菌液为空白对照、黄连
素作阳性对照。将无细菌生长的液体培养基中取出
0. 1 mL涂布平板，置37 ℃温箱中培养 24 h观察有无
细菌生长。无细菌生长的最小浓度为最小杀菌浓度。
2. 4 稳定性试验
2. 4. 1 酸碱稳定性:7 份各 3 mL 萃取物的水溶
液，分别调 pH 值分别调至 2、4、6、8、10、12，另设一
份不作处理作为空白对照，容至 5 mL，K-B 纸片法
测试抑菌活性。
2. 4. 2 热稳定性:取等量提取物水溶液，置于不同
温度 70、85、100 ℃各处理 2、1 h，121 ℃ 处理 30
min，冷却至室温，K-B纸片法测试抑菌活性。
2. 4. 3 紫外线稳定性:各取 5 mL 乙醚萃取物，分
装于 10 cm培养皿中，置紫外灯(波长 256 nm，功率
6 W，样距 5 cm)下照射不同时间，K-B 纸片法测试
抑菌活性。
2. 5 抑菌活性物质的初步化学鉴定
2. 5. 1 黄酮显色法:盐酸-镁粉反应:取少量样品
溶于 1. 0 mL甲醇中，加入少许镁粉，震荡，滴加几滴
浓盐酸，1 ～ 2 min 内即显色。另设样品只加浓盐酸
的空白对照。
·211· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 35 卷第 1 期 2012 年 1 月
2. 5. 2 生物碱鉴定:加入碘化汞钾(HgI2·2KI)试
剂(与生物碱作用多生成黄色沉淀)、碘化铋钾(BiI3
·KI)试剂(与生物碱作用多生成黄褐色沉淀) ，观
察沉淀反应。
3 结果
3. 1 不同部位的抑菌活性 实验结果(表 1)表
明，顶芽狗脊的叶柄与根茎对金黄色葡萄球菌、大肠
杆菌、痢疾杆菌均有一定的抑制作用，对酵母菌无抑
制作用;而叶片对 4 种菌都无抑制作用。由此可见，
顶芽狗脊的抑菌活性物质仅存在于叶柄和根茎。
3. 2 不同溶剂提取物的抑菌活性 不同溶剂提取
所得到的提取物抑菌试验(表 2)表明，60%乙醇的
提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌的抑
制效果最强;30%乙醇的提取物次之;蒸馏水的更次
之;但是他们对酵母菌都没有抑制效果;90%乙醇则
对以上 4 种菌都没有抑制效果。由此推测，顶芽狗
脊的抑菌活性物质可能具有表面活性，乙醇浓度太
高或太低都不利于其溶解释出。
3. 3 酸碱对顶芽狗脊抑菌活性的影响 实验结果
(表 3)表明，碱性环境的提取物对 3 种细菌的抑制
效果大于中性环境提取物;酸性环境提取物的抑制
效果小于中性环境的提取物。由此可大致推测顶芽
狗脊中抑菌活性物质可能为一类显酸性的物质，碱
性环境有利于其溶解释出。
表 1 顶芽狗脊不同器官部位提取物对抑菌活性的影响比较
受试菌
抑菌圈 /mm
纯营养叶 有孢子的叶 叶柄 根茎 空白对照 黄连素
Staphylococcus aureus － － 11. 2 11. 2 － 10. 0
Escheichia coli － － 11. 3 11. 3 － 11. 3
Shigella dysenteroae － － 8. 8 11. 3 － 9. 0
Saccharomyces － － － － － －
表 2 不同溶剂提取顶芽狗脊根茎提取物对抑菌活性的影响比较
受试菌
抑菌圈 /mm
蒸馏水 30%乙醇 60%乙醇 90%乙醇 空白对照 黄连素
Staphylococcus aureus 7. 2 8. 3 11. 7 － － 10. 0
Escheichia coli 7. 2 9. 3 11. 5 － － 11. 3
Shigella dysenteroae 6. 2 9. 2 11. 2 － － 9. 0
Saccharomyces － － － － － －
表 3 酸碱对顶芽狗脊根茎提取物抑菌活性的影响比较
受试菌
抑菌圈 /mm
0. 1 mol /mL HCl-60%乙醇 0. 1 mol /mL NaOH-60%乙醇 空白对照 黄连素
Staphylococcus aureus 3 12. 3 － 10. 0
Escheichia coli 9. 3 11. 2 － 11. 3
Shigella dysenteroae 8. 2 13 － 9. 0
Saccharomyces － － － －
3. 4 不同溶剂萃取物的抑菌活性 乙醚萃取物对
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和痢疾杆菌的抑制效果
最好，远大于阳性对照药黄连素;石油醚萃取物对以
上 3 种菌也有一定抑制效果;乙酸乙酯萃取物、正丁
醇萃取物以及萃余物对以上 3 种菌均无抑制效果;
以上各级萃取物对酵母菌均无抑制效果(表 4)。表
明顶芽狗脊的抑菌活性物质易溶于非极性溶剂。乙
醚对减弱抑菌活性的贡献最大，石油醚次之，这 2 种
溶剂能够将抑菌活性物质萃取完全，故成分提取时
应选用这类非极性溶剂。
3. 5 最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC)
顶芽狗脊提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓
度为 0. 8 g /mL，对大肠杆菌的最小抑菌浓度为 0. 6
g /mL，对痢疾杆菌的最小抑菌浓度为 1 g /mL;对 3
种受试菌的最小杀菌浓度为均为 2 g /mL(表 5、6)。
3. 6 抑菌活性物质稳定性实验
3. 6. 1 酸碱稳定性:酸处理对顶芽狗脊提取物抑
菌活性影响较小;但强碱对其活性影响较大，当 pH
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值≥12 时，受试菌没有出现明显的生长抑制(表
7)。表明顶芽狗脊提取物在酸或弱碱环境下有较
好的稳定性，在强碱条件下可能发生了分子结构的
改变，从而失去抑菌活性。
3. 6. 2 热稳定性:结果表明热处理对其抑菌活性
没有明显影响，甚至能够经受121 ℃ 30 min 的处理
(表 8)。表明顶芽狗脊的抑菌活性物质有较稳定的
分子结构，热稳定性良好，实践上可用于需高温处理
的工艺流程。
3. 6. 3 紫外稳定性:紫外光处理后顶芽狗脊提取
物仍具较强抑菌活性(表 9) ，表明紫外光处理对其
抑菌活性无显著影响。表明其分子结构较稳定，活
性基团不易被破坏，这与本文“3. 6. 2”中得出的结
论相一致。
表 4 不同极性溶剂萃取顶芽狗脊根茎提取物抑菌活性的比较
受试菌
生药浓度 /
(g /mL)
抑菌圈 /mm
石油醚 乙醚 乙酸乙酯 正丁醇 萃余物 黄连素
Staphylococcus aureus 10 9. 2 20. 3 － － － 10
8 7. 7 19. 1 － － －
6 6. 8 11. 8 － － －
4 6. 3 11. 3 － － －
2 － 10. 3 － － －
Escheichia coli 10 9. 8 18. 7 － － － 11
8 8. 7 17. 3 － － －
6 7. 8 15. 3 － － －
4 6. 2 12. 2 － － －
2 6 10. 2 － － －
Shigella dysenteroae 10 7. 2 22. 3 － － － 9. 3
8 6. 8 19. 2 － － －
6 6. 2 17. 2 － － －
4 － 14. 8 － － －
2 － 12. 7 － － －
Saccharomyces 10 － － － － － －
8 － － － － －
6 － － － － －
4 － － － － －
2 － － － － －
表 5 顶芽狗脊根茎提取物乙醚部位最小抑菌浓度测定
受试菌
生药浓度 /(g /mL)
4 2 1 0. 8 0. 6 0. 4 0. 2 0. 1 0. 05
Saccharomyces － － － － + + + ++ ++
Escheichia coli － － － － － + ++ ++ ++
Shigella dysenteroae － － － + ++ ++ ++ ++ ++
表 6 顶芽狗脊根茎提取物乙醚部位最小杀菌浓度测定
受试菌
生药浓度 /(g /mL)
4 2 1 0. 8 0. 6 0. 4 0. 2 0. 1 0. 05
Saccharomyces － － + + ++ ++ ++ ++ ++
Escheichia coli － － + + ++ ++ ++ ++ ++
Shigella dysenteroae － － + + ++ ++ ++ ++ ++
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表 7 酸碱处理后顶芽狗脊根茎提取物的抑菌圈直径
受试菌
不同 pH值的抑菌圈 /mm
未处理 2 4 6 7 8 10 12
Saccharomyces 17. 5 16. 0 16. 5 17. 5 17. 0 17. 3 16. 0 －
Escheichia coli 17. 0 17. 5 16. 5 16. 0 17. 0 16. 5 15. 5 －
Shigella dysenteroae 17. 5 17. 0 17. 5 17. 8 17. 3 16. 0 15. 5 －
表 8 热处理后顶芽狗脊根茎提取物的抑菌圈直径
受试菌
热处理的抑菌圈 /mm
未处理
70 ℃
1 h
70 ℃
2 h
85 ℃
1 h
85 ℃
2 h
100 ℃
1 h
100 ℃
2 h
121 ℃
30 min
Saccharomyces 17. 5 17. 0 17. 0 17. 0 16. 0 16. 0 16. 5 16. 0
Escheichia coli 17. 0 17. 0 17. 5 16. 5 16. 5 16. 5 17. 0 17. 0
Shigella dysenteroae 17. 5 16. 5 17. 0 15. 5 17. 5 15. 5 15. 8 17. 0
表 9 紫外光处理后顶芽狗脊根茎提取物的抑菌圈直径
受试菌
不同紫外光处理的抑菌圈 /mm
未处理 1 d 2 d 3 d
Staphylococcus aureus 17. 5 18. 0 17. 5 17. 0
Escheichia coli 17. 5 18 17. 5 18. 5
Shigella dysenteroae 17. 0 17. 5 16. 5 18. 0
3. 7 顶芽狗脊抑菌活性成分的初步判定
3. 7. 1 盐酸-镁粉反应:反应显橙红色，空白对照
不显色，可排除花青素显色的干扰。表明顶芽狗脊
中抑菌活性物质中含有黄酮类化合物。
3. 7. 2 生物碱鉴定:加入生物碱试剂后均无明显
沉淀产生，表明顶芽狗脊的抑菌活性物质中不含生
物碱类化合物，此结论也正与本文“3. 3”项中的结
论相一致。
4 讨论
本研究对顶芽狗脊的营养叶、孢子叶、叶柄和根
茎等不同部位的乙醇提取物进行了抑菌试验，筛选
有效抑菌部位，并进一步用不同溶剂对有效抑菌部
分进行抑菌成分的提取和萃取，结果表明: (1)顶芽
狗脊的抑菌活性物质主要分布在根茎和叶柄，叶片
不论有无孢子囊群，都不含抑菌活性物质; (2)顶芽
狗脊的乙醇提取物具有最高的抑菌活性，对受试的
革兰氏阴性菌和阳性菌都有抑制和杀灭作用，且该
乙醇提取物在碱性途径下的抑菌活性大于酸性环
境;但所有提取物对酵母菌都没有抑制作用; (3)提
取物中的抑菌活性成分易溶于乙醚等非极性溶剂
中。
为进一步探讨顶芽狗脊的抑菌活性成分，本研
究还对其抑菌物质的稳定性和化学成分的初步探
索，结果表明其抑菌活性成分在高温和紫外光下都
具有较好的稳定性，显示了其药物开发的良好前景。
在化学成分研究方面，通过定性检查基本判断该抑
菌成分为黄酮类化合物，但还需要做进一步的详细
分析以确定化合物结构。
致谢:本研究得到了唐克华教授的大力支持和指导，特此致谢!
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