全 文 ：2017 年 1 月第 24 卷第 1期 中国中医药信息杂志 ·87·
非生物诱导子茉莉酸甲酯和水杨酸
对半夏悬浮细胞中生物碱代谢的影响
段永波，鲁放，崔婷婷，赵丰兰，滕井通，盛玮，张爱民，薛建平
淮北师范大学生命科学学院资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽 淮北 235000
摘要：目的 研究非生物诱导子茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）对半夏悬浮细胞系生物碱含量及相
关酶活性的影响。方法 以叶柄来源的愈伤组织建立半夏悬浮细胞系，调查不同培养时间、MeJA和 SA浓度
对细胞中生物碱含量的影响，并分析生物碱合成相关酶（IMP脱氢酶、sAMP合成酶）的活性。结果 悬浮培
养 21 d时，悬浮细胞干重（DW）为培养前 9倍，且生物碱总量为培养前 3倍。MeJA和 SA处理均能显著促进
生物碱在半夏悬浮细胞中累积。150 µmol/L MeJA处理组生物碱含量为对照组 3.6倍，达 4.7 mg/g DW；50 µmol/L
SA处理使悬浮细胞生物碱含量达到对照组的 2.5倍。100 µmol/L MeJA和 50 µmol/L SA处理使 IMP脱氢酶比
活力分别为对照组 3.0、3.7倍，150 µmol/L MeJA和 100 µmol/L SA处理使 sAMP合成酶比活力分别为对照组
2.6、4.4倍。结论 添加适量外源诱导子MeJA和 SA能促进半夏悬浮细胞中生物碱的累积。
关键词：半夏；悬浮细胞；生物碱；茉莉酸甲酯；水杨酸
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.021
中图分类号：R282.6 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2017)01-0087-04
Effects of Abiotic Elicitors MeJA and SA on Alkaloids Accumulation and Related
Enzymes Metabolism in Pinellia ternata Suspension Cell Cultures DUAN Yong-bo, LU Fang,
CUI Ting-ting, ZHAO Feng-lan, TENG Jing-tong, SHENG Wei, ZHANG Ai-min, XUE Jian-ping (Key Laboratory of
Resource Plant Biology of Anhui Province, College of Life Sciences, Huaibei Normal University, Huaibei 235000,
China)
Abstract: Objective To study the effects of abiotic elicitors methyl jasmonate (MeJA) and salicylic acid (SA)
on the alkaloids accumulation and related enzymes metabolism in Pinellia ternata suspension cell cultures.
Methods Using the leaf petioles-derived suspension cell cultures as the study object, the culture duration,
concentrations of MeJA and SA were determined to get the optimal alkaloids accumulation, and the activities of
metabolic enzymes IMP dehydrogenase and sAMP synthase were also measured. Results A 9-fold of dried biomass
and a 3-fold of alkaloids accumulation were observed in P. ternata suspension cell cultures after culture for 21 d. Both
MeJA and SA could significantly promote the accumulation of alkaloids in P. ternata suspension cells. 150 µmol/L
MeJA enhanced alkaloids content (4.7 mg/g DW) by 3.6 folds in comparison with control group, whereas 50 µmol/L
SA showed a 2.5-fold increase. Meanwhile, 100 µmol/L MeJA and 50 µmol/L SA promoted the increase in IMP
dehydrogenase activity by 3.0 and 3.7 fold respectively, and 150 µmol/L MeJA and 100 µmol/L SA showed the
increase by 2.6 and 4.4 fold respectively. Conclusion Proper adding exogenous MeJA and SA can promote the
accumulation of alkaloids in Pinellia ternata suspension cell cultures.
Key words: Pinellia ternata; suspension cell cultures; alkaloids; methyl jasmonate; salicylic acid

半夏 Pinellia ternata（Thunb.）Breit.为天南星科

基金项目：国家自然科学基金（31501368、81573518）；安徽
省自然科学基金（1408085MC58、1608085MC52）；安徽高校省
级自然科学研究项目（KJ2016B016、KJ2015ZD35）
通讯作者：薛建平，E-mail：xuejp@163.com
多年生草本植物，其药用功效最早记载于《神农本草
经》。半夏以块茎入药，具有燥湿化痰、止咳镇痛的
作用，已成为我国最常用的十大中药之一[1]。半夏富
含生物碱、β-谷甾醇、多糖、挥发性油等，其中生物
碱被视为其主要活性成分[2]。在半夏生物碱中，胡芦
巴碱含量常被作为半夏质量控制指示，肌苷则用作半
·88· Chinese Journal of Information on TCM Jan.2017 Vol.24 No.1
夏的鉴别性成分[3-4]。
作为大宗中药材，半夏年需求量达 500～600 万 kg，
而野生和人工栽培产量仅能满足 1/3，市场缺口很
大[5]。自然状态下，半夏极少进行有性生殖，主要通
过珠芽或块茎进行营养繁殖，繁殖系数低[6]。长期过
度采伐导致野生半夏资源濒于枯竭，而人工栽培依然
面临高温、干旱、病虫害以及人工成本等多方面因素
的影响，难以满足半夏药材的市场需求。
悬浮细胞可在人为控制条件下实现活性功能成
分的生产，为解决药用植物资源不足和成本控制提供
了新途径[7]。茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）
为重要的信号分子[8]，常被用于植物次生代谢途径研
究。本研究以半夏悬浮细胞系为研究对象，考察外源
MeJA 和 SA 对生物碱合成和相关代谢酶活性的影响，
以期为利用半夏悬浮细胞系生产生物碱提供依据。
1 仪器与试药
YXQ-LS-50A 立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅医
疗生物仪器股份有限公司；HJH-C2112C 超净工作台，
上海智城分析仪器制造有限公司；QHZ-98B 全温度光
照震荡培养箱，太仓市华美生化仪器厂；BSA224S
电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；752
紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；
GZX-9240MBE 电热恒温鼓风干燥箱，上海博迅医疗
生物仪器股份有限公司；KQ-500 超声波清洗器，昆
山市超声仪器有限公司。
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH 5.4）、氯仿及溴
麝草酚蓝标准溶液，购自生工生物工程（上海）股份
有限公司；6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、2,4-二氯苯氧乙
酸（2,4-D）、6-糠氨基嘌呤（KT）、茉莉酸甲酯（MeJA）、
水杨酸（SA）及盐酸麻黄碱等试剂均为 Sigma-Aldrich
产品。试验所用半夏植株采自淮北市龙脊山自然风景
区（E-116°23′，N-34°14′），经薛建平教授鉴定为宿半
夏 Pinellia ternata（Thunb.）Breit。
2 方法与结果
2.1 半夏悬浮细胞体系构建
半夏愈伤组织诱导培养基为 MS＋3%蔗糖＋
2.0 mg/L 6-BA＋2.0 mg/L 2,4-D＋2.0 mg/L KT＋
0.65%琼脂，pH 5.8；细胞悬浮培养基为 MS＋3%蔗
糖＋0.5 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L 2,4-D，pH 5.8[9]。愈伤
组织诱导培养条件为 25 ℃黑暗培养；悬浮细胞培养
条件为（23±1）℃，光照周期为 14 h/10 h 光暗交替，
光照强度为 3000 lx。
取半夏叶柄置于 0.1%氯化汞浸泡 6 min，无菌水
润洗 5 次后剪成约 1.0 cm 长段，接种至愈伤诱导培养
基，于 25 ℃黑暗培养。3 周后获得愈伤组织，将所
获愈伤组织继代培养 3～5 次。选取质地松脆的颗粒
状愈伤接种至液体培养基进行悬浮培养（100 r/min），
每 15 d 更换新培养基，直至获得稳定细胞系。将所获
细胞系在 8 ℃低温处理 24 h，然后于 25 ℃恢复培养
36 h 使细胞周期同步。之后在 23 ℃培养 9 d 使同步
化细胞进入对数生长期，获得半夏悬浮细胞系。
2.2 盐酸麻黄碱标准曲线的绘制
精密称取 10 mg 盐酸麻黄碱对照品溶解于氯仿
中，定容至 50 mL，摇匀，得 0.20 mg/mL 盐酸麻黄
碱对照品溶液。精密吸取 0、1、2、3、4、5 mL 至分
液漏斗内，添加蒸馏水补至 5 mL，分别精密加入 5 mL
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH 5.4）、10 mL 氯仿及
1 mL 溴麝草酚蓝标准溶液，充分振摇后静置 1 h，分
取氯仿层，水层再用氯仿重复萃取 2 次，每次 10 mL。
合并氯仿层，60 ℃水浴回收至干，用氯仿溶解，定
容至 10 mL[10]。于 414 nm 波长处分别测定其吸光度。
以盐酸麻黄碱浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为
纵坐标，求得标准曲线为 A＝0.062C－0.076 8，r2＝
0.996 0（n＝5）。
2.3 生物碱含量测定
整个培养周期持续 28 d，每隔 7 d 取样，所获样
品立即保存于-70 ℃冰箱供测试分析。将所收集悬浮
细胞样品于 50 ℃干燥后研磨成粉。准确称取 0.1 g
样品粉末置于 25 mL 具塞试管中，加浓氨水 0.5 mL
润湿，加氯仿 10 mL 后于 4 ℃冷浸 3 h；冰浴超声提
取 1 h 后过滤，残渣以 10 mL 氯仿分 3 次（4、3、3 mL）
洗涤；将滤液与洗液合并，回收氯仿至干，加入 10 mL
氯仿使其溶解并转移至 50 mL 分液漏斗中，精密加入
5 mL 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 5.4）和 1 mL 溴麝
香草酚蓝标准溶液，充分振摇后，静置 1 h。分取氯
仿层，水层再用氯仿同法萃取 2 次，每次 10 mL。合
并氯仿层，回收至干，残留物用氯仿溶解，置于 10 mL
容量瓶中，并用氯仿定容、摇匀，即得处理组溶液[11]。
取待测溶液 2.0 mL，用 DU730 Beckman Coulter 核酸
蛋白分析仪测其吸光度，代入盐酸麻黄碱标准曲线
中，计算生物碱的含量。
2.4 培养时间对悬浮细胞系生物量和生物碱含量的
影响
以半夏叶柄为外植体诱导愈伤组织，进行液体悬
浮培养，获得半夏悬浮细胞系。随着培养时间延长，
悬浮细胞干重总体呈现增长趋势，在 21 d 时细胞干重
为培养前 9 倍，之后有所下降（见图 1）；生物碱含量
在培养 7 d 内含量较低，到 14 d 时显著增加，21 d 时
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最高，达到 1.56 mg/g DW，之后生物碱含量开始降低
（见图 2）。当培养时间超过 28 d 后，悬浮细胞会逐
渐变为褐色，开始坏死。根据细胞生物量和生物碱含
量测定结果，选择 21 d 作为悬浮细胞培养时间。

图 1 培养时间对半夏悬浮细胞生长的影响

图 2 培养时间对半夏悬浮细胞生物碱含量的影响
2.5 茉莉酸甲酯和水杨酸对生物碱含量的影响
试验用 MeJA 和 SA 浓度均为 0、50、100、150、
200 µmol/L。MeJA 处理对半夏悬浮细胞系生物碱含
量有显著影响。除 50 µmol/L 处理外，所试其他 MeJA
浓度均显著促进半夏生物碱合成。以 150 µmol/L
MeJA 处理组最高，达到 4.7 mg/g DW。150 µmol/L
MeJA 处理组的生物碱含量为对照组的 3.6 倍。在 SA
处理中，50 和 100 µmol/L 可显著提高半夏悬浮细胞
系中生物碱的合成，更高浓度的 SA 则能促进生物碱
的累积。50 µmol/L SA 处理组生物碱含量最高，为对
照组的 2.5 倍。结果见图 3。

图 3 MeJA和 SA对半夏悬浮细胞生物碱含量的影响
2.6 茉莉酸甲酯和水杨酸对IMP脱氢酶和sAMP合成
酶活性的影响
在添加不同浓度 MeJA 或 SA 培养 21 d 后，测定
半夏悬浮细胞中 IMP 脱氢酶和 sAMP 合成酶活性。
取不同浓度外源激素的半夏悬浮培养细胞各 1.0 g 置
于预冷的研钵中，加提取介质在冰浴中研磨匀浆，
4 ℃、1000 r/min 离心 15 min，上清液为酶粗提取液。
将上述酶提取液加入相应的酶反应液，每隔 30 s 读取
吸光度值。酶活性以比活力表示，定义为 1 min内 1 mg
蛋白所能引起的吸光度值变化的 1000 倍[5]。
添加 MeJA 或 SA 均对 IMP 脱氢酶活性有显著影
响。50～150 µmol/L MeJA 为对照组 IMP 脱氢酶活性
2.6～3.1 倍，当 MeJA 浓度增加至 200 µmol/L 时，酶
活性有所下降；50 µmol/L SA 处理对 IMP 脱氢酶活性
影响最大，酶活性为对照组 3.7 倍，随浓度增加酶活
性逐渐下降。结果见图 4。
图 4 MeJA和 SA对半夏悬浮细胞 IMP脱氢酶活性的影响
对于 sAMP 合成酶，50 µmol/L MeJA 对酶活性无
显著影响（P＞0.05），而较高浓度的 MeJA 显著提高
酶活性（P＜0.05）。100、150、200 µmol/L MeJA 分
别为对照组 sAMP 合成酶活性 2.2、2.6、1.9 倍。在所
测试 SA 浓度中，50～200 µmol/L SA 均显著促进酶活
性的升高，最高值出现在 100 µmol/L SA 处理组，酶
活性为对照组 4.4 倍，之后随着 SA 浓度增加，酶活
性逐渐下降，但至 200 µmol/L 浓度时，sAMP 合成酶
活性依然显著高于对照组。结果见图 5。

图 5 MeJA和 SA对半夏悬浮细胞 sAMP合成酶活性的影响
3 讨论
生物碱为重要的次生代谢物，是许多药用植物的
主要活性成分。目前多种药用植物细胞内生物碱合成
及代谢规律逐步得以揭示，对于研究这些植物的药用
成分意义重大[12]。在诸多研究模式中，悬浮细胞系的
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0 7 14 21 28
细
胞
干
重
/g
时间/d
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
0 7 14 21 28
生
物
碱
含
量
/（
m
g/
g
D
W
）
时间/d
0.0
1.5
3.0
4.5
6.0
0 50 100 150 200
生
物
碱
含
量
/（
m
g/
g
D
W
）
浓度/（μmol/L）
MeJA
SA
0
5
10
15
20
25
0 50 100 150 200
IM
P
脱
氢
酶
活
性
浓度/（μmol/L）
MeJA
SA
0
5
10
15
20
25
0 50 100 150 200
sA
M
P合
成
酶
活
性
浓度/（μmol/L）
MeJA
SA
·90· Chinese Journal of Information on TCM Jan.2017 Vol.24 No.1
应用极为广泛[13-14]，因其可为药用成分的生产提供另
一途径，有助于解决药用植物产量的缺口，获得更高
质量的产品，同时保护野生资源。
本研究以叶柄来源的愈伤组织建立半夏悬浮细
胞系，考察不同培养时间、MeJA 和 SA 浓度对细胞中
生物碱含量的影响，并分析生物碱合成相关酶活性。
在悬浮培养 21 d 时，半夏悬浮细胞干重增加了 9
倍，悬浮细胞中生物碱总量为培养 0 d 时的 3 倍，与
Zhao J 等[15]报道长春花悬浮细胞培养增殖结果接近。
生物碱作为一种重要的次生代谢产物，其合成通常在
细胞培养后期进行。添加较低浓度 MeJA 或 SA 不会
影响半夏悬浮细胞的增殖，这在麻花艽悬浮细胞培养
中同样得到验证[16]。同时，培养 3 周左右通常需要更
换新鲜培养基，以补充营养成分并减少坏死细胞对培
养的影响。因此，确定悬浮细胞系培养时间为 21 d
用于不同诱导子对生物碱累积影响的研究。
MeJA 或 SA 作为重要的诱导子已用于萜类化合
物等生物碱的代谢研究[17]。本研究表明，MeJA 或 SA
处理均能显著促进生物碱在半夏悬浮细胞中累积。培
养 21 d 后，150 µmol/L MeJA 处理组生物碱含量为对
照组 3.6 倍，50 µmol/L SA 处理组悬浮细胞生物碱含
量达到对照组的 2.5 倍。同时测定了生物碱中嘌呤核
苷酸生物合成途径中的关键酶 IMP 脱氢酶和 sAMP
合成酶活性的变化情况。添加 MeJA 或 SA 均能显著
提高二者的酶活性。100 µmol/L MeJA、50 µmol/L SA
处理使 IMP 脱氢酶活性分别为对照组 3.0、3.7 倍，
150 µmol/L MeJA、100 µmol/L SA 处理使 sAMP 合
成酶活性分别为对照组 2.6、4.4 倍。比较生物碱累
积量及所测代谢酶活性变化情况发现，生物碱累积
与所测代谢酶活性变化趋势较一致，说明 IMP 脱氢酶
及 sAMP合成酶在半夏生物碱代谢中具有较为重要的
作用。
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（收稿日期：2016-01-31）
（修回日期：2016-03-02；编辑：陈静）