全 文 ：收稿日期:2009-09-26; 修订日期:2010-05-12
作者简介:管兰芳(1985-) ，女(汉族) ，江西赣州人，现为浙江工商大学食
品与生物工程学院在读硕士研究生，学士学位，主要从事药用植物次级代
谢产物相关研究工作．
超声提取飞廉悬浮细胞总黄酮的工艺研究
管兰芳
(浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310035)
摘要:目的 研究超声提取飞廉悬浮细胞中总黄酮的最佳工艺。方法 以总黄酮含量为指标，利用正交实验设计考察提取
工艺的最佳组合。结果 最佳工艺为以 60%乙醇为提取剂，料液比 1∶ 20 (g /ml) ，提取温度为 60℃，提取时间 30 min。
结论 最佳提取条件下，飞廉细胞中的总黄酮含量为 8． 73 mg /g。
关键词:超声提取; 飞廉悬浮细胞; 总黄酮; 正交实验
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2010． 10． 133
中图分类号:R284． 2 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2010)10-2704-01
飞廉 Carduus crispus L，是飞廉属植物，为二年生或多年生草
本［1］，遍布全国各地，资源非常丰富。到目前为止已从飞廉属不
同植物中分离得到黄酮、木脂素、香豆素、生物碱、三菇、单菇、苯
丙素，以及幽醇等活性成分［2］，主要用于治疗风热感冒，头风晕
眩，风热痹痛，皮肤瘙痒，尿路感染，乳糜尿，尿血带下，跌打瘀肿，
疗疮肿毒，烫火伤等［3］。悬浮培养药用植物细胞可以代替药用
植株做为活性成分的提取材料，具有生长周期短，活性成分含量
稳定，可以人为控制，并且可以大规模培养的优点［4］。虽然飞廉
属植物具有很好的药用价值，但到目前为止，与之相关的研究报
道还很少见到，现有的几篇文献也集中在分析该属植物的主要化
学成分上［1 ～ 3］。前期实验发现，黄酮类物质为飞廉的主要活性成
分之一，具有很好的生物活性。为了更好地开发利用它的药用价
值，我们以总黄酮含量为考察指标，对飞廉悬浮细胞中总黄酮提
取工艺进行了优化。
1 材料与仪器
1． 1 原料 飞廉植株由杭州市药物种植场提供，飞廉愈伤组织由
浙江工商大学食品和生物工程学院细胞工程实验室诱导选育。
将愈伤细胞转接到 MS液体培养基上(MS + 1 × 10 －5 mol /L，NAA
+2 × 10 －6 mol /L，BA + 30g /L 蔗糖，pH5． 8，121℃灭菌 20 min) ，
于 25℃，110 r /min下黑暗振荡培养，接种量为 60 g /L，建立飞廉
悬浮细胞系。实验所用的飞廉悬浮细胞已经过多次继代培养，具
有比较稳定的形态特征和生长速率。
1． 2 试剂与仪器 芦丁对照品 (Sigma) ，UV － 2100 型紫外可见
分光光度仪(尤尼柯仪器有限公司) ，SHBⅢ循环水式多用真空泵
(郑州长城科工贸有限公司) ，电热鼓风干燥箱 101A － 2 型(上海
市实验仪器总厂) ，AB204 － N 电子分析天平(梅特勒． 托利多仪
器有限公司) ，THZ － D 台式恒温振荡器(太仓市实验设备厂) ，
SW － CJ － 1F型净化工作台(苏州净化设备厂) ，KQ3200DE 型数
控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
2 方法与结果
2． 1 分析方法
2． 1． 1 正交实验设计 根据预实验结果，选择乙醇浓度、料液
比、提取温度、提取时间为实验因素，采用 L9(3
4)正交表进行
实验，设计的因素水平见表 1，以飞廉细胞中总黄酮的含量作
为评价指标。
2． 1． 2 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品 5 mg，溶于 50
ml 60%的乙醇中，配成 0． 1 mg /mL 母液。取 0． 0，1． 0，2． 0，3． 0，
4． 0，5． 0 ml 母液于 10 ml 容量瓶中，补加 60%的乙醇溶液至 5
ml，混匀。加 5%的亚硝酸钠 0． 4 ml，混匀，放置 6 min，再加 10%
的硝酸铝 0． 4 ml，混匀，放置 6 min。加 4%的氢氧化钠 4 ml，最
后加 60%的乙醇至刻度线，放置 15 min后，510 nm处测其吸光度
值。测得其标准曲线为 Y = 0． 066 5X + 0． 000 7 (R = 0． 999 8) ，其
中 X为吸光度值，Y为单位体积黄酮含量。
表 1 因素水平
水平
A
乙醇浓度 (%)
B
料液比 /g∶ ml
C
提取温度 T /℃
D
提取时间 t /min
1 40 1:10 60 20
2 60 1:15 70 30
3 80 1:20 80 40
2． 1． 3 样品溶液的制备和测定 将培养了 12 d 的飞廉细胞抽滤
至不滴水后，放入 60℃ 干燥箱烘干约 36 h至恒重。将干细胞样
品研磨，取 0． 5 g干细胞粉，按正交表的设计条件进行超声提取，
提取次数为 2 次，提取液过滤，合并滤液最后定容至 25 ml，做为
待测液。取 1 ml待测液于 10 ml容量瓶中，按“2． 1． 2”的步骤依
次加入其它试剂，在 510 nm 处测得吸光值。按下式计算样品总
黄酮含量:X = C × V /m × V1 /V2。其中:X －为黄酮含量(mg /g) ，
以芦丁计;C －根据吸光度得到的样品总黄酮浓度(mg /ml) ;m －
处理样品的质量(g) ;V －测吸光度时所稀释的容量瓶体积，这里
为 10 ml;V1 －样品处理液的总体积(ml) ，这里为 25 ml;V2 －测
定时吸取样品处理液的体积(ml)。
2． 2 正交实验结果 正交实验结果极差越大，因素影响越大。由
表 2 可知，影响悬浮培养飞廉细胞中总黄酮提取的因素主次顺序
为:乙醇浓度(A) ＞料液比(B) ＞提取温度(C) ＞ 提取时间
(D) ，飞廉细胞中总黄酮超声提取的最佳工艺条件为:A2B3C1D2，
即乙醇浓度为 60%，料液比 1∶ 20，提取温度为 60℃，提取时间为
30 min。正交实验的方差分析(见表 3)结果显示，乙醇浓度对飞
廉细胞中总黄酮的提取有极显著性影响，料液比对黄酮提取也有
较大的影响，提取时间和温度在此实验范围内没有显著差异，对
测定结果的影响较小，与直观分析结果(见表 2)相吻合。
表 2 正交实验结果
实验
号
A
乙醇浓度
(%)
B
料液比
/ g·ml －1
C
提取温度
T /℃
D
提取时间
t /min
黄酮含量
C /mg·g － 1
1 1 1 1 1 5． 37
2 1 2 2 2 5． 78
3 1 3 3 3 6． 14
4 2 1 2 3 7． 86
5 2 2 3 1 8． 19
6 2 3 1 2 8． 73
7 3 1 3 2 7． 17
8 3 2 1 3 7． 87
9 3 3 2 1 7． 63
均值 1 5． 763 6． 8 7． 323 7． 063
均值 2 8． 26 7． 28 7． 09 7． 227
均值 3 7． 557 7． 5 7． 167 7． 29
极差 2． 497 0． 7 0． 233 0． 227
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时珍国医国药 2010 年第 21 卷第 10 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2010 VOL． 21 NO． 10
表 3 正交实验方差分析结果
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
乙醇浓度 9． 944 2 119． 09 6． 94 *
料液比 0． 769 2 9． 21 6． 94 *
提取温度 0． 085 2 1． 018 6． 94
提取时间 0． 082 2 0． 982 6． 94
误差 0． 17 4
* 表示影响显著;F0． 05(2，4) = 6． 94
3 结论
超声波提取法是近年来《中国药典》收载应用较多的一种样
品处理方法，具有提取效率高、处理时间短、操作简便等优点［5］。
本文首次报道了超声技术在飞廉悬浮细胞总黄酮提取中的应用，
并通过正交实验，优化了飞廉细胞中总黄酮的提取工艺，正交实
验结果表明超声提取飞廉细胞总黄酮的最佳工艺条件为:乙醇浓
度 60%，料液比 1∶ 20，提取温度 60℃，提取时间 30 min。在该最
佳超声提取工艺条件下，总黄酮含量达到 8． 73 mg /g。本研究为
更好地开发利用飞廉属植物中黄酮类化合物奠定了良好的基础。
参考文献:
［1］ 王玉华，温爱平，杨来秀，等．蒙药材飞廉的实验研究［J］．内蒙古医
学院学报，2009，31(3) :219．
［2］ 戴静秋．西北风毛菊、蒙古芯芭、丝毛飞廉三种药用植物化学成分
和生物活性的研究［D］．兰州:兰州大学，2002 :90．
［3］ 张庆英．生藤和飞廉化学成分及生物活性研究［D］． 北京:北京医
科大学，2000:85．
［4］ 黄璐琳，胡尚钦，杨 晓．药用植物生物工程研究进展Ⅰ．组织和细
胞培养研究［J］．中草药，2006，37(4) :488．
［5］ 牛立新，李章念，李红卷，等． 超声波提取卷丹鳞茎中总黄酮研究
［J］．中药材，2007，30(1) :852．
收稿日期:2010-02-01; 修订日期:2010-05-16
作者简介:高文荣(1972-) ，女(汉族) ，吉林延吉人，现任延边大学护理学
院高级讲师，硕士学位，主要从事细胞化学研究工作．
* 通讯作者简介:金香子(1954 －) ，女(朝鲜族) ，吉林延吉人，现任延
边大学基础医学院电子显微镜室教授，硕士学位，主要从事细胞培养
研究工作 ．
五味子水提液对 D －半乳糖所致
衰老神经细胞的保护作用
高文荣1，金香子2* ，李香丹2
(1． 延边大学护理学院，吉林 延吉 133000; 2． 延边大学基础医学院，吉林 延吉 133000)
摘要:目的 探讨五味子水提液对 D －半乳糖所致
衰老神经细胞的保护作用。方法 将原代培养的大鼠乳鼠大脑神经细胞培养 7 d 后，分为正常对照组、模型组(D － gal
组) ;实验组(8 g /L D － gal + 750 μg /ml五味子水提液，8 g /L D － gal + 500 μg /ml五味子水提液，8 g /L D － gal + 250 μg /
ml五味子水提液) ;药物对照组(8 g /L D － gal + 500 μg /ml 人参皂苷) ，作用 24 h 后，电镜观察各组细胞超微结构的变
化，细胞化学染色观察各组培养细胞内 Nissl 体和脂褐素(LPF)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、酸性磷酸酶(ACP)的活性变化。
结果 五味子水提液能恢复 D －半乳糖所致损伤的乳鼠大脑培养神经的超微结构，抑制 Nissl体的减少和 LPF的沉积，提
高神经细胞内 SDH活性及降低 ACP活性。结论 五味子水提液对 D －半乳糖所致衰老神经细胞的保护作用。
关键词:五味子; D －半乳糖; 神经细胞
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2010． 10． 134
中图分类号:R285． 5 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2010)10-2705-01
五味子为木兰科植物五味子 Schisandra chinensis(TurcZ)Bail
的干燥成熟果实，其果实入药，味酸性温，入肺、肾经，有敛肺、滋
肾、止汗、生津、止泻、涩精之功效［1］。中医临床常用于神经衰弱
等证，具有兴奋中枢神经系统、兴奋脊髓、提高大脑皮层的调节作
用［2 ～ 4］，本实验探讨了五味子水提液对大脑神经细胞的抗衰老作
用，为五味子的进一步开发应用提供了实验和理论依据。
1 材料与仪器
1． 1 动物 SD大鼠乳鼠(8 d 龄)双侧大脑半球，动物由延边大
学医学部实验动物科提供。
1． 2 药物 五味子水提液(由延边大学药学院提取制成) ，用 RP-
MI － 1640 培养基配成 750，500，250 μg /ml;人参皂苷(吉林省靖
宇县黄封参药业公司产品) ，用 RPMI － 1640 培养基配成 500 μg /
ml。RPMI － 1640 培养基(GIBAO 产品) ;胰蛋白酶(美国 DIFCO
产品) ;D －半乳糖(上海试剂二厂产品)。
1． 3 仪器 OLYMPUS倒置显微镜购自日本;JEM － 1200EX 型透
射电子显微镜购自日本;PD － 2000 真彩色病理细胞图像分析仪
购自北京天地百年科技公司。
2 方法
2． 1 原代单层神经细胞培养与分组 无菌条件下取 SD 大鼠乳
鼠(8 d龄)双侧大脑半球，用含 20%小牛血清的 RPMI － 1640 培
养基制成细胞悬液，以 1 × 106 /ml的密度接种。放置 37℃ CO2培
养箱中培养，培养至第 7 天，选生长良好的细胞随机分为 6 组。
正常组、模型组(加入 8g /L D － gal)、实验组(8 g /L D － gal + 750
五味子水提液，8 g /L D － gal + 500 μg /ml五味子水提液，8 g /L D
－ gal + 250 μg /ml五味子水提液) ;药物对照组(8 g /L D － gal +
500 μg /ml人参皂苷) ;作用 24 h后，进行实验观察。
2． 2 透射电镜观察 取生长良好的细胞，用 0． 25%胰蛋白酶消
化，以 2 000 r /min离心 15 min，收集细胞用 3%戊二醛和 1%锇酸
双重固定，梯度丙酮脱水，Epon815、812 混合树酯包埋，超薄切
片，电子染色，JEM － 1200EX型透射电子显微镜观察，拍照。
2． 3 细胞化学染色［5，6］ Nissl 体染色:采用甲苯胺蓝染色法;
LPF:采用 Glenner氏联合反应法;SDH:采用亚铁氰化钾法;ACP:
采用 Gomori法进行染色。
3 结果
3． 1 透射电镜观察 模型组细胞膜被破坏，核膜膜褶增多，各种
细胞器均有减少:粗面内质网脱颗粒;高尔基体结构被破坏;线粒
体膨胀呈空泡状，嵴断裂，胞质内可见大量脂滴沉积;实验组和药
物对照组的各种细胞器超微形态结构均得到明显恢复。结果见
图 1 ～ 2。
3． 2 细胞化学染色
3． 2． 1 Nissl 体染色 模型组胞质内蓝紫色 Nissl 体颗粒减少。
药物组和药物对照组的 Nissl 体与模型组比较，均有明显变化。
结果见图 3 ～ 4。
3． 2． 2 LPF染色 模型组 LPF明显增多，药物组和药物对照组的
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2010 VOL ． 21 NO． 10 时珍国医国药 2010 年第 21 卷第 10 期