全 文 ：第 28卷第 4期 江 西 农 业 大 学 学 报 Vo.l 28, No. 4
2006年 8月 Acta Ag ricu lturae Unive rsitatis Jiangx iensis Aug. , 2006
文章编号:1000 - 2286(2006)04 - 0529 -05
罗勒 (Ocimum basilieum)原生质体的
分离和纯化
蔡汉权1, 2 ,赖钟雄 1* ,林珊珊 1
(1. 福建农林大学 园艺植物生物工程研究所 ,福建 福州 350002;2. 韩山师范学院 生物系 ,广东 潮州 521041)
摘要:以罗勒愈伤组织 、悬浮培养细胞 、无菌苗幼叶为材料 ,研究了罗勒原生质体的分离纯化方法及影响因素。结
果表明:材料的起始状态对原生质体分离的产量 、质量均有明显影响;以泥状愈伤组织为材料 ,其原生质体的产量
(以鲜重测)可达 1. 25×107个 /g,存活率大于 94%。该原生质体可进一步用于罗勒的原生质体培养与细胞融合。
关键词:罗勒;愈伤组织;悬浮细胞;无菌苗叶片;原生质体;分离与纯化
中图分类号:Q813. 1　　文献标识码:A
Isolation and Pur ification of Protoplasts inOcimum basilieum
CA IHan - quan
1, 2 , LA I Zhong - x iong1* , LIN Shan - shan1
　　(1. Institute ofHorticultu ra lB iotechnology, FAFU , Fuzhou 350002;2. Department o fB io logy, Hanshan
N orma lCo llege, Chaozhou 521041, China)
　　Abstract:The methods fo r isola tion of pro top lasts from the ca lli, suspesion ce lls and tubeplant leaves o f
Ocimum basilieum and the ifluentia l fac to rsw ere studied. The results show ed tha t the status o f the initialma te-
ria ls rem arkably a ffec ted the ou tput and quality of pro top lasts. The pro top last y ie ld amounted to 1. 25×107 g
and the livab lity w as up to 94% when the quagm ire calliw ere used as materials, and the protop lasts cou ld be
fu rther used fo r pro top last cultu re and cell fusion ofOcimum basilieum.
Key words:Ocimum basilieum;ca llus;ce ll suspension;tube - plant leaf;pro toplast;iso lation and pu ri-
fication
原生质体的分离和纯化 ,是植物原生质体融合和植株再生的基础 [ 1] 。要获得高产量和高质量的原
生质体 ,必须研究植物材料原生质体分离和纯化过程中的各种影响因素 ,如酶浓度及组合 [ 2] ,酶解时
间 [ 3] ,渗压剂浓度 [ 4] ,酶解方式 [ 5]等 ,同时 ,也与分离材料的类型和生理状态密切相关 [ 6, 7] 。罗勒的原生
质体分离和纯化的方法尚未见报。本研究探讨了罗勒原生质体分离纯化过程中的影响因素 ,建立了获
得高产量 、高质量的罗勒原生质体的方法 ,为原生质体培养及高效再生系统的建立奠定了基础。
1　材料与方法
1. 1　材料
用于分离原生质体的材料包括疏松愈伤组织 (简称 CA型 ,下同)、泥状愈伤组织 (简称 CB型 ,下
同 )、悬浮细胞和无菌苗幼叶。
收稿日期:2006 - 04 - 21
基金资助:农业部 948计划资助项目(991029)
作者简介:蔡汉权 ,男(1967 -),讲师 , 从事植物组织培养的教学和研究工作 , * 通讯作者:赖钟雄 , 男 , 博士 , 研究
员 , 博士生导师 , E -ma il:Laizx01@163. com。
　江 西 农 业 大 学 学 报 第 28卷
图 1　罗勒原生质体分离与纯化
F ig. 1　 Iso lation and pu rifica tion o f pro top lasts inO cim um basilieum
　　A. CB型愈伤组织涂片 , 示分散的小细胞团;B. 分散性良好的悬浮细胞;
C. 无菌苗幼叶分离的原生质体 ,含有大量叶绿体;D. 悬浮细胞分离纯化
后的原生质体。
1. 2　方法
1. 2. 1　起始材料的获得　参照蔡汉权 (2005)的取材和消毒方法 [ 8] ,用培养基 MS1:MS+6 -BA4 mg /L
(单位下同)+NAA0. 1作为启动培养基 ,诱导罗勒顶芽 、侧芽分化获得大量愈伤组织 ,在继代培养和分
化筛选中 ,从 DK 2和 DK3培养基上筛选出 CA型和 CB型愈伤组织 。 DK2 、DK 3培养基为:DK2:MS+2, 4
-D1 +KT0. 5;DK3:MS +2, 4 - D2 +KT0. 5。以上 3种培养基均附加蔗糖 30 g /L,球脂 6 g /L, pH 5. 8,
121 ℃下高压灭菌 20 m in,培养条件为(25±2)℃,光照强度 1 500 Lx,光周期 12 h /d。
悬浮细胞以 CB型愈伤组织为材料 ,在 DK 5:MS+2, 4 -D2 +KT0. 5 ,附加蔗糖 30 g /L,肌醇 100 mg /L
的液体培养基上振荡培养获得 ,具体方法见文献 [ 9] 。
无菌苗为蔡汉权 (2005)[ 8]建立的罗勒无菌苗 ,以其幼苗为材料 ,处理时将幼苗叶下表皮撕破 ,并将
叶片切成约 2 mm宽片段。
1. 2. 2　原生质体的分离和和纯化　原生质体的分离纯化采用酶解法和过滤 -离心法 [ 10] 。酶液一般由
CPW - 13M(13%甘露醇 )溶液配制 , pH5. 8 ,纤维素酶为日本的 O nozuka R - 10,果胶酶为 Serva公司产
品 ,一般过程如下 (酶液 、甘落醇浓度及酶解时间随不同试验而异 ,所有的用品经无菌消毒备用):
①在直径为 6 cm的培养皿上 ,用直径 0. 25 μm的滤头加入 CPW - 13M酶解液 5 mL。②将鲜重为
0. 5 g的各种材料(见 2. 1)放入酶解液中 ,封口后置于 28 ℃黑暗条件下静置 12 ～ 24 h酶解。期间用倒
置显微镜观察酶解情况。 ③酶解完成后用直径 40 μm尼龙网过滤 ,除去细胞团和愈伤组织。 ④滤液在
带刻度的离心管中离心 5 m in,转速为 500 r /m in,去除酶液 。⑤用 CPW - 13M缓冲液重悬沉淀的原生
质体 ,依此离心—重悬 3次 ,可将酶解得到的原生质体纯化。
1. 2. 3　原生质体分离纯化效果的测定　原生质体产量用血球计数板计数 [ 11] ,以每 g鲜重的起始材料
分离得到的原生质体个数(个 /g)来表示 。活力测定采用 Eveans B lue(0. 4%)染色法[ 11] ,以不着色的原
生质体数占总观察数的百分率 ,即存活率来表示。每次观察原生质体数为 100个 。细胞碎片是指酶解
完成时被离解或破裂的细胞壁或细胞器。
2　结果和分析
2. 1　起始材料的生理状态
经培养和筛选 ,用于分离原生质体的各种材料最佳的生理状态如下:
CA型疏松愈伤组织:黄色 、颗粒状 ,松散易于夹碎 ,细胞旺盛生长期为接种后 6 ～ 7 d。
CB型泥状愈伤组织:淡绿
色 、白色 ,泥状 、颗粒极小 ,其涂片
可见分散的小细胞团 (图 1 -A)
细胞旺盛生长期为接种后 6 ～
7 d。
悬浮细胞:分散性良好 ,由大
量生长迅速的小细胞团组成 (图
1 - B );悬浮细胞系直线生长期
为接种后 4 ～ 5 d。
无菌苗幼叶:罗勒无菌苗上
幼嫩的叶片 , 浅绿色 , 长度约
1. 5 cm。
除特别说明外 ,用于分离原
生质体材料为上述生理状态下的
材料。
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第 4期 蔡汉权等:罗勒(O cim um basilieum)原生质体的分离和纯化
表 2　酶解时间对罗勒 CB型愈伤组织原生质体分离的影响
Tab. 2　Effec ts of decom posing t ime on the isolation of
protop lasts from CB callus in Oc imum basilieum
酶解时间
t /h
产量 1)
/107 g - 1
存活率 1)
/% 细胞碎片
2)
4 0. 001 g 98. 0 a -
6 0. 04 f 98. 0 a -
8 0. 25 e 96. 8 b +
10 0. 53 d 96. 1 b +
12 0. 83 c 94. 6 c +
14 1. 24 a 94. 6 c +
16 1. 31 a 90. 3 d ++
18 1. 04 b 86. 1 e +++
　　注:1)按邓肯氏法测定差异显著性(P =0. 05), 有相同
字母表示差异不显著;2)“ -”表示几乎没有 , “ +”表示较
少 , “ ++”表示较多 , “ +++”表示很多。
表 3　罗勒 CB型愈伤组织不同培养时间对原生质体分离影响
Tab. 3　Effects of cu tur ing tim e on the isola tion of protop lasts
from CB callu s in Ocimum basilieum
培养时间
/d
产量 1)
/107 g - 1
存活率 1)
/% 细胞碎片
2)
4 0. 95 b 96. 1 a +
6 1. 25 a 95. 8 b +
8 1. 27 a 95. 3 b +
12 0. 83 b 78. 9 c +++
16* 0. 007 c 62. 3 d +++
　　注:1)按邓肯氏法测定差异显著性(P =0. 05), 有相同
字母表示差异不显著;2)“ +”表示较少 , “ +++”表示很
多;3)“*”材料表面开始褐变。
2. 2　原生质体的分离
2. 2. 1　酶类组合对原生质体分离的影响　以 CB型愈伤组织为材料 ,比较纤维素酶∶果胶酶的不同组
合对原生质体分离的影响 ,结果见表 1。
表 1　酶类组合对罗勒 CB型愈伤组织原生质体分离的影响
Tab. 1　E ffects of com b ination s of enzym es on the isolation of protop lasts from CB callu s in Ocimum basilieum
纤维素酶
/%
果胶酶
/%
酶解时间
t /h
产量 1)
107 g - 1
存活率 1)
/% 细胞碎片
2)
0. 2 0. 2 18 0. 8 a 96. 3 a +
0. 5 0. 5 14 1. 2 b 94. 6 a +
0. 8 0. 8 14 1. 4 b 94. 1 a ++
1. 5 1. 5 12 1. 2 b 83. 3 b +++
　　注:1)用邓肯氏法测定差异显著性(P =0. 05),有相同字母表示差异不显著;2)“ +”指较少 , “ ++”指较多 , “ ++
+”指很多。
表 1表明:CB型愈伤组织原生质体分离所需的酶浓度较低 ,在 0. 2% ～ 0. 8%范围内 ,随着酶液浓
度的升高 ,原生质体的产量增加 ,但细胞碎片增多 ,存活率也有所下降。当酶浓度较高 (1. 5%)时 ,细胞
碎片明显增多 ,存活率下降明显 ,这说明酶液在解离细胞壁的同时 ,高浓度酶液对原生质体也有一定的
毒害作用。
由此可见 ,酶类的组合对原生质体
分离有明显影响 ,适合罗勒 CB型愈伤
组织原生质体分离的酶组合为纤维素
酶∶果胶酶 =0. 5%∶0. 5%。
2. 2. 2　酶解时间对原生质体分离的影
响　以 CB型愈伤组织为材料 , 8组平行
试验按纤维素酶∶果胶酶 =0. 5%∶0. 5%,
28 ℃下静置酶解处理 ,酶解 4 h后 ,每
隔 2 h进行原生质体的纯化和统计比较
不同酶解时间对原生质体分离的影响 ,
结果见表 2。
从表 2可以看出 ,酶解时间对原生
质体的产量和质量有明显影响 ,酶解 4
～ 16 h内 ,随时间的延长原生质的产量
增加 , 16 h与 14 h比较增加不显著 ,
18 h后原生质体数量减少 ,细胞碎片明
显增加 ,这一方面说时 14 ～ 16 h的酶解
时间已接近克的 CB型愈伤组织的原生
质体的产量最高值。另一方面证明了长
时间(18 h以上)酶解对细胞的负面作
用 。
综合上述因素 ,罗勒 CB型愈伤组
织静置酶解的时间应以 14 h为宜 。
2. 2. 3　愈伤组织培养时间对原生质体
分离影响。用纤维素酶 ∶果胶酶 =
0. 5%∶0. 5%, 14 h静置酶解的处理方
法 ,比较 CB型愈伤组织不同培养时间
对原生质体分离的影响 ,结果见表 3。
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　江 西 农 业 大 学 学 报 第 28卷
表 4　不同甘露醇浓度对罗勒原生质体分离的影响
Tab. 4　E ffects of concen trations ofman itol on the isolation of
protop lasts inO cimum basilieum
甘露醇 /% 产量
1)
/107 g - 1
存活率 1)
/% 细胞碎片
2)
10 0. 83 b 91. 8 b ++
12 1. 21 a 95. 0 a +
13 1. 25 a 95. 2 a +
14 1. 20 a 95. 1 a +
15 0. 89 b 92. 3 b ++
　　注:1)用邓肯氏法测定差异显著性(P =0. 05), 有相同
字母表示差异不显著;2)“ +”指较少 , “ ++”指较多 , “ +
++”指很多。
表 5　罗勒不同分离材料对原生质体分离的影响
Tab. 5　Effec ts ofm aterials on the isolation of protop lasts inO cimum basilieum
分离材料 酶解时间
t /h
产量 1)
/107 g- 1
存活率 1)
/% 细胞碎片
2)
CA型愈伤组织 14 0. 92 b 94. 5 a ++
CB型愈伤组织 14 1. 25 a 94. 8 a +
悬浮细胞 12 1. 31 a 95. 1 a +
无菌苗幼叶 18 0. 04 c 94. 2 a +++
　　注:1)用邓肯氏法测定差异显著性(P =0. 05), 有相同字母表示差异不显
著;2)“ +”指较少 , “ ++”指较多 , “ +++”指很多。
　　表 3表明:愈伤组织的培养时间 ,影响了分离材料的生理状态 ,对原生质体分离也产生直接的影响;
继代培养后 6 ～ 8 d的 CB型愈伤组织 ,其细胞生长速度和活动力均处于较好的状态 ,细胞壁薄 、原生质
浓 ,因此是用于分离原生质体的良好材料 ,培养 12 d以上的材料不适于分离原生质体。
2. 2. 4　不同甘露醇浓度对原生质体分离的影响　以 CB型愈伤组织为材料 ,酶液按纤维素酶∶果胶酶
=0. 5%∶0. 5%比例用不同浓度的 CPW
-甘露醇溶液配制 , 14 h静置酶解 ,比
较甘露醇浓度对罗勒原生质体分离影
响 ,结果见表 4。
表 4表明:甘露醇浓度在 12% ～
14%间对原生质体的分离差别不明显;
10%浓度下原生质体产量和活力降低 ,
细胞碎片增多 ,可能是由于部分原生质
体吸胀破裂的缘故;15%较高浓度下与
10%浓度下有相似状况 ,说明长时间 、高
浓度的甘露醇对原生质体分离也是不利
的 。
2. 2. 5　不同分离材料对原生质体分离
的影响　取不同材料在 CPW - 13M的
酶液 (纤维素酶 ∶果胶
酶 =0. 5%∶0. 5%)中
静置酶解 , 在各种材料
原生质体释放量达到最
大的时间内分离纯化 ,
比较不同分离材料对原
生质体分离的影响 , 结
果见表 5。
表 5表明:悬浮细
胞分离原生质体的酶解
时间短 、数量多 ,说明了
悬浮细胞系的分散性良好 ,是原生质体分离的良好材料;CB型愈伤组织分离的原生质体数量与之接近 ,
这在已报道的原生质体分离中是少见的 ,这说明疏松性良好的愈伤组织也是分离原生质体的良好材料。
CA型愈伤组织 、无菌苗幼叶分离效果较差 ,其分离条件有待进一步探讨。无菌苗幼叶原生质体见图 1
-C。
2. 3　罗勒原生质体的纯化
酶解得到的原生质体用过滤—离心法纯化 [ 10] ,即 1. 2. 2中的步骤 3 ～ 5进行。结果表明:CA型 、CB
型愈伤的组织 、悬浮培养细胞用此方法纯化即可达到较好的效果:原生质体圆形 、分散性好 、杂质少 (图
1 -D)。无菌苗幼叶酶解后碎片多 ,大块细胞团仍较多 ,容易堵住网孔而使原生质体过滤不彻底 ,因此
酶解结束后应先用直径 65 μm的滤网先除去大块的碎片和未离解的细胞团 ,然后再用直径 40 μm的滤
网过滤 ,滤液按上述步骤即可将原生质体纯化 。纯化后的原生质体经培养后 ,能持续分裂 ,具有再生能
力 。
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第 4期 蔡汉权等:罗勒(O cim um basilieum)原生质体的分离和纯化
3　结论与讨论
3. 1　罗勒原生质分离的适宜条件
悬浮培养细胞常作为原生质体的分离材料 [ 7] ,本研究中悬浮细胞分离得到的原生质体最多 ,证明
了这一事实 ,但建立和保持悬浮细胞系操作麻烦 、易污染 。本研究中 CB型愈伤组织疏散性极好 ,易于
培养和长期继代保持 ,且分离的原生质体数量和质量接近于悬浮细胞 ,因此可作为罗勒原生质体分离的
首选材料。
综合上述各因素 ,我们认为罗勒原生质体分离的适宜条件为:用继代培养 6 ～ 7 d的 CB型愈伤组织
为材料 ,按每 0. 5 g愈伤组织加入 5 mL酶液的比例酶解 ,酶液用 CPW - 13M甘露醇溶液按纤维素酶∶
果胶酶 =0. 5%∶0. 5%配制 、pH 5. 8, 28 ℃黑暗静置 14 h即可获得数量 、质量均较好的原生质体。这些
原生质体可以用于进一步的原生质体的分离与融合 。
3. 2　原生质体纯化过程的技术关键
分离得到的原生质体失去细胞壁的保护作用 ,易于破裂 。纯化过程应减少振荡 、搅拌等物理因素的
冲击;悬浮原生质体的溶液中经常有絮状杂质 ,影响原生质体观察 、计数和活力测定 ,杂质多数来自于
CPW - 13M甘露醇溶液 ,因此用于悬浮原生质体的 CPW - 13M溶液应先离心沉淀或用 0. 25 μ滤头过
滤除去杂质 ,可以明显提高原生质体纯化的效果。
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