全 文 ：pressedm ice induced by Cy and white blood ce ll count
of m ice suppressed by cyta rab ine and cyc lophospha-
m ide ;FOD(15, 30 and 60 mg kg -1) increased pro-
life ra tion of T and B lymphocy tes and enhanced levels
of IL-2 and INF-γin serum in immunosuppressedm ice
induced by cyclophospham ide. Conclusion　FOD en-
hances the specific and non-specific immunity.
Key words:tota l flavones of oldenland ia diffusa w illd
(FOD);immunomdulato ry ;IL-2 ;INF-γ
半边旗提取物 5F体外对猪脑微管蛋白聚合的影响
刘　义1 ,吴育廉 2 ,邓亦峰 1 ,梁念慈1
(1. 广东天然药物研究与开发重点实验 , 广东 湛江　524023;2.湛江海洋大学现代生物化学实验中心 ,广东 湛江　524025)
中国图书分类号:R-332;R 282. 71;R 284.1;R 329.24;
R 329.25;R 329.28;R 341;R 730.52;R 979.1
文献标识码:A 文章编号:1001 -1978(2005)04 - 0447 -03
摘要:目的　研究半边旗提取物 5F对微管蛋白聚合的影响。
方法　在离体条件下 , 将受试化合物加入到微管蛋白聚合-
解聚反应体系中 , 于 37 ℃、 350 nm下检测反应体系吸光值
的变化。结果　5F能抑制反应体系吸光值升高 , 提示它对
微管蛋白聚合具有抑制作用并能抑制其解聚。结论　5F能
抑制体外微管蛋白聚合 , 从而可能是影响细胞的细胞周期及
诱导凋亡途径之一。
关键词:半边旗;5F;微管蛋白
　　微管 (m icrotubu le)是由 α、β-微管蛋白 ( tubu-
lin)异源二聚体及少量微管结合蛋白聚合而成的亚
稳定的动态结构 。在正常细胞内 ,微管蛋白形成微
管的过程是一个动态平衡的过程。微管存在于所有
真核细胞中 ,构成细胞的骨架 ,维持细胞形态和锚定
细胞器的位置 ,参与细胞收缩 、伪足运动及细胞内物
质运输 。细胞质中的微管在细胞分裂前期解聚组成
纺锤体 ,纺锤体在细胞的有丝分裂过程中对染色体
的移动及子核的分裂起着非常重要的作用 。
半边旗 (P teris sem ipinnata L. PsL)是一种民间
草药 ,属凤尾蕨科植物 ,性寒具疏解风寒 、化湿消味 、
消热解毒的功效 。近年来我实验室的研究表明半边
旗具有显著的体内外抗肿瘤作用 [ 1 ～ 3] ,对其作用机
制也已作了许多的研究 [ 4, 5] 。分离 、纯化后得到的
收稿日期:2004 - 06 - 18,修回日期:2004 - 09 - 06
基金项目:国家自然基金资助项目(No 39870900)
作者简介:刘　义 (1978 - ), 男 , 硕士 , Tel:86-759-2388405, E-m ail:
patrick liu@21 cn. com;
梁念慈(1941 -),男 , 教授 ,博士生导师 , 研究方向:生化
药理学
抗肿瘤活性成分为二萜类化合物 5 F、6 F、A。其中
5 F能将某些肿瘤细胞的细胞周期阻滞在 G 2 M/ 期
并能导致其凋亡。目前还未见 5 F影响微管蛋白的
研究报道 。
1　材料与方法
1. 1　受试化合物　5 F由本实验室提取 , DMSO助
溶 ,使用前按 1∶1 200稀释;秋水仙素 、紫杉醇购自
Sigma公司。
1. 2　试剂 　MES、GTP、EGTA购自 sigm a公司;丙
三醇 、MgC l2为国产分析纯。
1. 3　微管蛋白的分离纯化　参照文献[ 6, 7]提取微
管蛋白的方法略有改进 。把刚屠宰的成年猪脑 ,置
于冰上去除脑膜 、大血管并剪碎 ,用预冷的 MES缓
冲液 (MES 0.1 mo l L- 1 , EGTA 0.1 mmo l L - 1 ,
ATP 1.0mmo l L -1 ,MgC l2 0.1mo l L- 1 ,用 HC l调
pH值至 6.5)清洗两次 ,捣碎后制成匀浆。
将脑组织匀浆在 4℃、105 000×g条件下离心 1
h,取上清液 ,加入等体积的 MES聚合缓冲液 (MES
0.1 mo l L -1 , EGTA 1.0mmol L - 1 , ATP 1.0 mmo l
L - 1 , M gC l2 0.5mol L -1 ,丙三醇 8.0 mol L - 1 ,
用 HC l调 pH值至 6.5),置于 37 ℃水浴中保温 30
m in,期间微微摇动数次 ,再在 26 ℃、105 000×g条
件下离心 1 h,弃上清 ,用约 1 /10匀浆体积的预冷
MES缓冲液将沉淀物分散 ,置于冰水浴中 30 m in,
使沉淀物基本溶解。再将溶液按上述高 、低温离心
步骤重复进行 1次 ,将离心后获得的沉淀物 ,用少量
预冷的 MES缓冲液在冰水浴中溶解 ,得到微管蛋白
溶液 。
1. 4　微管蛋白含量的测定　按 Low ry s法测定微管
蛋白含量 。
1. 5　微管蛋白的鉴定　用浓度为 12%的分离胶
(pH 8.8), 7.5%的浓缩胶 (pH 6.7)进行 SDS-PAGE
447 中国药理学通报　ChinesePharmacologica l Bulletin　2005 Apr;21(4):447 ～ 9
电泳 , 0.05 %考马斯亮蓝 R 250染色 。
1. 6　微管蛋白聚合和解聚动态平衡反应　在冰浴
的比色杯中加入已纯化的微管蛋白 ,然后加入 GTP
(母液 5 μl),使其终浓度为 100 mmo l L -1。在 4
℃于 350 nm处迅速调零 ,放入 37℃水浴中恒温 ,每
间隔 3m in取出测其 A350值 ,根据所测得的吸光值
的变化绘制微管蛋白聚合曲线 。当聚合曲线逐渐上
升进入高坪期 ,说明微管蛋白聚合 -解聚反应趋于
平衡 ,待聚合反应基本结束后 (该段聚合 -解聚平
衡时期大约持续 20 m in),将比色杯放入冰水浴中
冰浴 20m in,这段时间内每间隔 3 m in测定 A350值 ,
解聚曲线逐渐下降进入低坪期后 ,解聚反应基本结
束 。
1. 7　5 F对微管蛋白聚合 -解聚活性的影响　在
上述微管蛋白聚合 -解聚的反应系统中实验组加入
不同浓度 5F药液 (5 μl),使其终浓度分别为 100、
75、50、25μmol L -1;阳性对照组分别加入秋水仙
素 、紫杉醇 ,使其终浓度分别为 4 μmo l L - 1和 2
μmo l L- 1;空白对照加入无菌三蒸水代替上述受
试化合物 ,按上述测量方法记录 A 350的连续变化 。
1. 8　结果评价　抑制率 (%)=(1 -实验组 A350 /
对照组 A 350)×100%
2　结果
2. 1　微管蛋白含量的测定与鉴定　Low ry′s法测定
微管蛋白含量为 8 g L -1 , SDS-PAGE电泳结果见
Fig 1。
F ig 1　E lectrophores is of tubulin purified from porc ine
bra in on a SDS polyacry lam ide gel
2. 2　微管蛋白聚合 -解聚反应平衡体系图　F ig 2
表现了微管蛋白聚合 -解聚反应平衡体系的动态变
化:在 37 ℃条件下聚合(0 ～ 20 m in);在 4℃条件下
解聚(40 ～ 60 m in),该图平台期反应了在聚合条件
下聚合 -解聚之间的动态平衡 。
2. 3　秋水仙素 、紫杉醇对微管蛋白聚合 -解聚反应
的影响　参照文献 [ 8, 9]提供的秋水仙素和紫杉醇对
微管蛋白聚合 -解聚反应的影响浓度 ,在本实验中
它们的终浓度分别采用 4 μmo l L- 1和 2 μmol
L
-1 ,其结果如 F ig 3所示。
F ig 2　D isperse graph of tubulin po lymerization a t 37℃
(0 ～ 20 m in)and tubulin depolym eriza tion at 4℃(40～ 60m in)
F ig 3　 The effects of co lch icine、 taxol on tubu lin
　　该图平台期反应了在聚合条件下聚合 -解聚之
间的动态平衡 。秋水仙素对微管蛋白聚合存在明显
的抑制效应 ,在 37℃恒温过程中抑制微管蛋白聚合
(0 ～ 40m in)。这与秋水仙素能结合于微管蛋白端
部从而抑制微管蛋白聚合作用的机制相一致;紫杉
醇在 37℃恒温条件促进微管蛋白聚合 (0 ～ 40
m in),在 4℃下抑制其解聚 (40 ～ 60 m in),这与其能
促使微管蛋白迅速聚集成微管并结合到微管上抑制
微管的解聚的机制相符合。
2. 4　5F对微管蛋白聚合 -解聚反应的影响 　从
Fig 4可看出 , 5F对微管蛋白的聚合有一定的抑制
作用 ,且与浓度相关。终浓度为 25、50、75、100 μmo l
L - 1的 5 F使微管蛋白的最大吸光值分别变为
0.144、0.116、0.092、0.038。抑制率分别为 8.3%、
25%、41.7%、75.6%。 100 μmo l L- 1的 5 F对微
448 中国药理学通报　Ch inese Pharm acological Bu lletin　2005 Apr;21(4)
管蛋白聚合的抑制作用与 2 μmo l L -1秋水仙素相
近 。
F ig 4　The effects of diverse doses o f 5 F on tubulin
3　讨论
微管和微管蛋白的相互作用是靶向性筛选抗肿
瘤化合物的重要模型之一。实验证明 ,大量的天然
和合成化合物能干扰微管蛋白的功能 。它们主要是
抑制微管蛋白聚合 ,使纺锤体不能形成 ,从而使细胞
分裂停止在有丝分裂中期 ,或是促进微管聚合 ,抑制
微管解聚而抑制细胞分裂 。
在细胞的有丝分裂过程中 ,细胞临近分裂前期
时细胞质中微管解聚成微管蛋白亚基 ,细胞进入有
丝分裂早中期后 ,纺锤体侵入细胞中心区 ,纺锤体微
管蛋白捕捉动粒 。当染色体排列在赤道上后 ,细胞
进入有丝分裂中期 ,纺锤体微管通过微管蛋白的聚
合与解聚牵引染色体向两极运动 ,到分裂后期纺锤
体微管解聚为微管蛋白 ,因此 ,作用于细胞有丝分裂
期的各个有关于微管的时相就可能使有丝分裂受阻
而导致细胞凋亡 。
本研究发现 ,作为半边旗提取物 5F在离体条件
下对猪脑微管蛋白聚合 -解聚体系存在着影响。它
能抑制微管蛋白的聚合 ,同时又能稳定已聚合的微
管蛋白使其在解聚条件下不发生解聚。这种作用不
同于紫杉醇只稳定聚合的微管蛋白 ,也不同于秋水
仙素只抑制微管蛋白的聚合不阻止已聚合的微管蛋
白在解聚条件下解聚。 5 F这种在体外对微管蛋白
聚合的影响可能是其引起肿瘤细胞凋亡途径之一 。
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E ffect of 5 F isolated from P teris Sem ipinnata L on
tubulin polym er ization in vitro
LIU Y i
1 ,WU Yu-lian2 , DENG Y i-feng1 , LIANG Lian-ci1
(1. Guangdong Key Labora tory for Research and Developm ent ofNatureDrugs, Zhanjiang　524023, China;
2. Modern B iochem istry E xperim enta l Center Zhan jiang O cean University, Zhanjiang　524025, China)
Abstract:A mi 　To study the e ffect o f 5F on tubulin
po lyme rization.Methed　5F w as added in to the tubu-
lin polymerization-depo lyme riza tion sy stem and the
changes o f absorp tion values at 350 nm , 37 ℃were re-
co rded. Results　5F decreased the abso rp tion va lues
of the reaction system. and marked ly inhibited not on ly
tubu lin po lymerization but also tubulin depo lymeriza-
tion. Conclusion　5F inhibits tubu lin polymerization
and depo lyme riza tion, and leads to cell cycle arrested,
and possibly induces apoptosis.
Key word:pteris sem ipinna ta L;5F;tubu lin
449 中国药理学通报　Ch inese Pharm acological Bu lletin　2005 Apr;21(4)