全 文 ：珍稀濒危药用植物金毛狗的孢子繁殖技术研究
张祖荣 1 ,张绍彬1, 2 (1.重庆文理学院生命科学系 ,重庆 402168;2.重庆高校园林花卉工程研究中心 ,重庆 402160)
摘要 [目的 ]研究药用植物金毛狗的孢子繁殖技术。 [方法] 从重庆缙云山采集金毛狗孢子 ,消毒后分别播种于未经消毒和经过消毒
处理的腐叶土、混合土和原生境土 3种培养土上 ,在保证水分条件的情况下 ,通过单因子试验 ,研究不同培养土 、温度(自然温度、昼夜变
温和昼夜恒温)和光照(自然光照、白天光照和昼夜光照)对金毛狗孢子繁殖的影响。 [结果 ]培养土以未经消毒的原生境土为最好 ,光
照条件以自然散射光照为最好 ,温度条件则以当地的自然温度为最好;原生境土作为移栽基质可获得较高的幼苗成活率 ,为 76.0%。无
论哪一种繁殖条件 ,金毛狗孢子繁殖从配子体到孢子体的转化率均很低 ,最高的仅有 12.8%。 [结论]从配子体的受精到孢子体的形成
是金毛狗整个孢子繁殖过程的关键。
关键词 金毛狗;孢子繁殖;培养条件;分组试验
中图分类号 S567.23+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2010)05-02330-03
PrimaryExplorationonSporeReproductionTechniquesofRareorEndangeredMedicinePlantCibotiumbarometz
ZHANGZu-rongetal (DepartmentofLifeScience, ChongqingUniversityofArtsandSciences, Chongqing402168)
Abstract [ Objective] ThestudyaimedtoresearchthesporereproductiontechniquesofrareorendangeredmedicineplantCibotiumbarometz
[ Method] ThesporesofC.barometzcolectedfromJinyunMountain, afterdisinfected, wereplantedon3kindsofcultivatingsoilsliketheroten
leafsoil, mixedsoilandoriginalsurroundingsoilwhichhadbeendisinfectedornot.Undertheconditionofenoughwater, theeffectsofdiferent
cultivatingsoils, temperature(naturaltemperature, changingtemperatureinthedayandnightandconstanttemperatureinthedayandnight)
andilumination(naturalilumination, dayilluminationandnightillumination)onthereproductionofC.barometzsporeswerestudiedthrough
thesinglefactortest.[ Result] Thenon-disinfectedoriginalsuroundingsoilwasthebestcultivatingsoil, thenaturaldispersioniluminationwas
thebestiluminationandthelocalnaturetemperaturewasthebesttemperature.Theoriginalsuroundingsoilasthetransplantedmatrixcouldget
thehighestsurvivalrateofseedlings, being76.0%.Nomaterwhichkindsofreproductiveconditionwasadopted, thetranslatingrateinthere-
productionofC.barometzsporesfromtheametophytestothesporophyteswasverylow, beingashighestasonly12.8%.[ Conclusion] The
processfromtheimpregnationofthegametophytestotheformofthesporophyteswasthekeytothewholesporereproductioncourseofC.
barometz.
Keywords Cibotiumbaromez;Sporebreeding;Cultivatingcondition;Groupingexperiments
基金项目 重庆市教委科研资助项目(kj071204);重庆文理学院《植物
学 》重点建设课程资助项目(重文理 07052)。
作者简介 张祖荣(1966-),男 ,重庆人 ,硕士 ,副教授 ,从事植物种植
类基础学科的教学与研究。
收稿日期 2009-11-23
金毛狗(Cibotiumbarometz)为蚌壳蕨科(Dicksoniaceae)
金毛狗属(Cibotium)的蕨类植物 [ 1] 。该种植物不仅是我国典
型的单科种植物 [ 2] ,更是历史悠久的药用植物 ,其根状茎可
长年采收入药 ,具有通血脉 、利关节 、壮筋骨等多种功效 [ 3] 。
由于其赖以生存的森林环境被严重破坏 ,加上人们对野生植
株进行私挖乱采 ,导致该野生资源已处于濒危状态 ,因此被
列入了国家二级保护植物和限制出口物种名录 [ 2] 。
尽管有关金毛狗的研究报道较多 ,但多集中在化学成分
分析 ,遗传多样性 、配子体发育研究和产品开发方面 [ 4-7] 。
为了进一步做好该物种的资源保护和合理利用工作 ,如何利
用人工手段来迅速增加其个体数量是当务之急 。根据前人
经验 [ 8] ,对蕨类植物的孢子进行人工繁殖 ,具有繁殖系数大 、
繁殖成本低 、变异性小等特点 ,是人工快速繁殖育苗的有效
途径。因此 ,笔者对金毛狗的孢子进行了人工繁殖试验 ,并
取得了初步成果。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 孢子的采集 。金毛狗的孢子采自重庆缙云山 ,孢子
的采集要在孢子囊充分成熟(此时孢子囊的颜色为黄绿色)
而又没有开裂时进行 ,最好采集羽状叶中下部的孢子 ,这一
部位的孢子发育最为成熟 [ 9] 。将背面有成熟孢子囊的羽片
剪下装入干净的白色纸袋 ,置于室内通风干燥处 ,使孢子自
然脱落。经过 7d左右 ,在装有孢子囊羽片的白色纸袋外面
轻轻拍打 ,使已经开裂的孢子囊内的孢子充分脱落出来 ,取
出羽片后将纸袋内的孢子倒在孔径为 0.2 mm的金属筛上过
筛 ,以去除其他杂质 ,过筛后的孢子用棕色广口瓶保存备用。
1.1.2 播种器皿。为了便于管理和降低成本 ,播种器皿选
用具有良好排水性能 、口径 12 cm的白色塑料花盆 ,播种前
清洗干净 ,并用沸水浸煮 3min左右进行消毒处理。
1.1.3 培养土。根据前人经验 [ 7] ,该试验选用了腐叶土 、混
合土(腐叶土 、田园土和河沙以体积比为 1∶1∶1均匀混合)以
及从金毛狗原生境地采来的表层土(以下简称原生境土)3
种培养土。将这 3种培养土晾干后用较细的土壤筛过筛 ,为
了进行对比 ,过筛后的每种播种基质平均分为 2部分 ,其中
一部分不作消毒处理 ,另一部分放入干燥箱中 ,在 120 ℃高
温下干燥 6 h左右进行消毒处理。
1.2 方法
1.2.1 孢子的消毒处理 。孢子在播种前进行消毒处理 ,以
避免有害微生物的污染。处理方法:用滤纸将称量好的每份
为 2 mg的孢子包成一小包 ,并用细线扎紧;将孢子小包先在
70%的酒精中浸泡 30s左右 ,此时还要用镊子将滤纸包中的
气泡赶净 ,使孢子表面完全被酒精浸润;然后将滤纸包放入
5%的 NaClO溶液中浸泡 5 ～ 10 min,捞出后用无菌水冲洗
4 ～5次;在无菌培养皿中打开纸包 ,用 10 ml的无菌水将滤
纸上的孢子全部冲入培养皿中形成无菌孢子悬浮液;将培养
皿中的孢子悬浮液倒入无菌三角烧瓶中 ,并用少量无菌水将
培养皿冲洗干净后全部倒入三角瓶中。
1.2.2 播种 。将干燥的播种基质装入花盆并平整表面后 ,
用盆浸法 [ 10]对其进行充分湿润 ,然后用经过灭菌处理的胶
头滴管将孢子悬浮液均匀地喷洒到培养土表面。为保证每
责任编辑 李菲菲 责任校对 卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(5):2330-2332, 2353
份孢子悬浮液都能全部彻底地播种到相应的培养土中 ,三角
瓶中的孢子悬浮液被播种完后 ,还要用无菌水冲洗 3遍 ,每
次冲洗下来的无菌水仍用原来的滴管将它们均匀地喷洒到
培养土表面 ,最后 ,所用滴管也要用无菌水清洗 3遍 ,清洗下
来的无菌水也要均匀地喷洒到培养土表面。
1.2.3 培养条件。从已有的研究成果来看 [ 8] ,蕨类植物在
进行孢子繁殖时 ,对水分条件的要求是十分一致的 ,但在温
度和光照方面 ,因不同的种类而差异较大。为探讨温度和光
照条件对金毛狗孢子繁殖的影响 ,该试验在保证水分条件的
基础上 ,对温度和光照条件采用了单因素 3水平的分组试验
方法 ,具体分组如图 1所示 。图 1中的 A代表经过消毒处理
的培养土 , B代表未经消毒的培养土 ,数字代表培养土盆数。
再有 ,由于金毛狗的原生境光照条件是林下荫蔽环境的散射
光照 ,所以该试验的自然光照是指模拟其原生境光照条件的
自然散射光照 ,而不是真正意义上的自然光照 ,其余的光照
条件为室内人工光照 ,光强为 4 000lx左右;自然变温也是指
与原生境温度条件差别不大的当地自然温度条件 ,昼夜变温
为白天 25 ℃、夜间 15 ℃,恒温为 25 ℃。
图 1 金毛狗孢子繁殖试验分组示意
Fig.1 SporebreedingexperimentgroupingsketchforCibotiumbaromezt
1.2.4 播种后的管理。培养土播种后立即按试验分组放入
相应的培养条件里进行培养和观察 ,对萌发的苔藓和杂草要
及时去除 ,出现霉菌时也要尽量清除。
1.2.5 幼苗移栽。当孢子体幼苗长出 4 ～ 5片真叶时即可
进行移栽 ,移栽基质的种类与培养土相同 ,但不进行干燥消
毒 。为了便于土壤水分和空气湿度的调控 ,移栽容器选用口
径 45 cm、净高 30cm的塑料花盆 ,盆内土厚 15 cm。幼苗移
栽后用透明塑料薄膜把盆口覆盖 ,并定时检查盆土和盆内空
气湿度 ,尽量使其保持在 60% ～ 85%。移栽 15 d后统计成
活率并观察生长状况。
1.3 数据处理 对可以进行量化统计的数据采用 SAS9.0
进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同培养土的繁殖效果 从表 1结果来看 , 3种培养土
都有一定的繁殖效果 ,但它们之间又存在明显差异。多重比
较(LSD法 ,下同)结果表明 , 3种培养土的配子体数量 、孢子
体数量和配子体到孢子体的转化率都存在极显著差异(均值
差 >LSD0.01 ,下同),其中又以原生境土最好 ,混合土次之 ,腐
叶土最差。这说明金毛狗的孢子繁殖对它们的原生境土具
有较强的依赖性 ,而且对土壤条件的要求也比较严格 ,这也
可能是导致它们的自然种群难以扩大的因素之一 。
表 1 金毛狗孢子在不同培养土上的繁殖效果
Table1 ReproductiveeffectofCibotiumbaromeztindiferentkindsofcultivatingsoil
培养土Cultivatingsoil 项目Item
配子体数量Numberofgametophytes
孢子体数量Numberofsporophytes
从配子体到孢子体的转化率∥%Transformingratefromgametophytetosporophyte
腐叶土 未消毒 Undisinfected 52.8 4.1 7.8
Decayedleavessoil 消毒 Disinfected 41.4 2.2 5.3
合计Total 94.2 6.3 -
混合土 未消毒 Undisinfected 76.6 6.9 9.0
Mixedsoil 消毒 Disinfected 61.5 4.2 6.8
合计Total 138.1 11.1 -
原生境土 未消毒 Undisinfected 98.8 10.2 10.3
Originalsoil 消毒 Disinfected 73.6 6.1 8.3
合计Total 172.4 16.3 -
注:表中数据为每盆培养土的平均值,下同。
Note:Datainthetablearemeanfromalthecultivatingsoil, thesameasbelow.
对同一培养土而言 ,经过消毒和未消毒的处理二者之间
的繁殖效果也存在明显差异 。t检验结果证明 ,二者之间的
配子体数量 、孢子体数量和配子体到孢子体的转化率都存在
极显著差异( t >t0.01(18)),未消毒的培养土明显好于经过消
毒处理的培养土 。这一结果和有些观点 [ 11]之间存在矛盾 ,
但也和有些研究者 [ 12]的试验结果相吻合。出现这一结果的
233138卷 5期 张祖荣等 珍稀濒危药用植物金毛狗的孢子繁殖技术研究
主要原因可能是以下 2个方面:一是土壤消毒在杀灭有害微
生物的同时也破坏了培养土壤里的酶类系统 ,从而降低了土
壤养分的有效性 ,这就严重影响了没有根系而只有假根的配
子体对土壤养分的吸收和利用。二是土壤消毒杀灭了所有
菌类 ,但在温暖潮湿而又不是无菌环境的培养条件下 ,各种
霉菌的出现在所难免 ,而霉菌的出现势必会严重影响金毛狗
孢子的整个繁殖过程;与之相反的是 ,在未消毒的培养土内 ,
由于长时间的相互适应 ,土壤内的各种微生物之间已经处于
相对平衡的状态 ,从而避免了霉菌的出现 ,因此反而比经过
消毒处理的培养土更有利于金毛狗孢子的繁殖 。
2.2 不同温度条件下的繁殖效果 从表 2结果来看 , 3种温
度条件的繁殖效果也存在明显差异 ,多重比较结果表明 ,它
们在配子体数量 、孢子体数量和配子体到孢子体的转化率 3
个方面都存在极显著差异 ,其中又以自然温度最好 ,昼夜变
温次之 ,昼夜恒温最差。这一结果说明 ,作为野生蕨类植物 ,
金毛狗在孢子繁殖的温度条件方面 ,已经对有规律变化的自
然温度形成了一定的依赖性 ,反而对没有变化的恒温适应起
来比较困难 ,这种影响在孢子体的形成和成活方面尤其明
显 ,表现为从配子体到孢子体的转化率非常低。
表 2 金毛狗孢子在不同温度条件下的繁殖效果
Table2 ReproductiveeffectofCibotiumbaromeztunderdifferenttem-
peratures
温度条件Temperature
配子体数量Numberofgametophytes
孢子体数量Numberofsporophytes
从配子体到孢子体的转化率∥%Transformingratefromgametophytetosporophyte
自然温度 88.6 8.6 9.7
Naturaltemperature
昼夜变温 74.7 5.9 7.9Changingtemperaturebetweendayandnight昼夜恒温 56.4 3.6 6.3Constanttemperaturebetweendayandnight
2.3 不同光照条件下的繁殖效果 表 3结果说明 , 3种光照
条件的繁殖效果也有差异 ,但多重比较结果表明 ,在配子体
数量 、孢子体数量和配子体到孢子体的转化率 3个方面 ,都
是除了自然光照和昼夜光照之间差异显著 (均值差 >
LSD0.05)外 ,其余均表现为差异不显著(均值差
照强度和光照时间的要求 ,金毛狗的孢子繁殖对光照的节律
变化并无严格要求。
2.4 不同移栽基质的幼苗移栽成活状况 表 4结果说明 ,
金毛狗幼苗对土壤的反应和孢子繁殖一样 ,也表现为对原生
境土较强的依赖性和对土壤条件的严格要求 ,但只要其他管
理能满足要求 ,腐叶土和混合土作为移栽基质也能获得较高
的成活率。
3 讨论
3.1 适当条件下金毛狗的孢子繁殖率较高 从该试验结果
来看 ,只要繁殖条件适当 ,金毛狗的孢子繁殖率还是较高的 。
因为 1株成熟金毛狗个体是能够产生大量孢子的 ,该试验所
用孢子数量只相当于 1株成熟植株所产孢子数量的 1/4左
右 ,在有些繁殖条件很不理想的情况下 ,仍然繁殖出了 400
多株孢子体幼苗。所以 ,只要繁殖条件适当 ,金毛狗的孢子
繁殖率完全可以达到经济适用的规模生产要求。
表 3 金毛狗孢子在不同光照条件下的繁殖效果
Table3 ReproductiveefectofCibotiumbaromeztunderdiferentlight
conditions
光照条件Light
配子体数量Numberofgametophytes
孢子体数量Numberofsporophytes
从配子体到孢子体的转化率∥%Transformingratefromgametophytetosporophyte
自然光照 81.1 7.2 8.9Naturallight
白天光照 78.5 6.4 8.1
Daylight
昼夜光照 74.9 5.4 7.2
Lightbetweendayandnight
表 4 不同移栽基质的幼苗移栽成活状况
Table4 Survivingstatusoftransplantedyoungplantsindifferent
transplantingmediums
移栽基质
Transplantingmedium
成活率∥%
Survivingrate
生长状况
Growthstatus
腐叶土 52.0 一般 Common
Decayedleavessoil
混合土 Mixedsoil 65.0 良好 Alright
原生境土 Originalsoil 76.0 很好 Verygood
3.2 在满足土壤条件和水分要求的情况下下金毛狗自然繁
殖是可以成功的 该试验结果说明 ,除水分条件外 ,金毛狗
的孢子繁殖条件都以自然条件为最好。因此 ,只要满足土壤
条件和水分要求 ,金毛狗孢子的自然繁殖也应该是可以成功
的。这样 ,笔者也可以据此推测 ,金毛狗孢子在自然状态下
繁殖率非常低下的主要原因应该是以下 2个方面:一是孢子
太轻太小 ,被风吹散后不易落到条件适宜的土壤上;二是随
着全球气候变暖和森林植被的破坏 ,金毛狗孢子繁殖所要求
的严格的水分条件很难得到满足。这样的发现也给人们探
索金毛狗的濒危机制提供了重要的信息 。
3.3 为方便管理和提高繁殖率 ,应在无菌条件下进行蕨类
植物的孢子繁殖 在该试验中 ,尽管未消毒培养土的繁殖效
果好于消毒培养土 ,但在未消毒培养土的孢子繁殖过程中出现
了较多其他植物幼苗 ,从而大大降低了培养土应有的孢子繁殖
率。如果采用消毒培养土在无菌条件下进行孢子繁殖 ,不仅可
以避免霉菌的危害 ,同时也能消除其他植物孢子或种子萌发的
影响 ,既方便了管理 ,又能在一定程度上提高孢子的繁殖率 ,如
果条件允许的话 ,应该是一个更为理想的繁殖途径。
3.4 从配子体到孢子体的转化率较低 ,受精作用很关键
从该试验结果可以明显看出 ,不管是哪一种繁殖条件 ,金毛
狗孢子繁殖从配子体到孢子体的转化率都很低下 ,最高也只
有 12.8%,这样的结果说明从配子体的受精到孢子体的形成
是金毛狗整个孢子繁殖的关键 ,也给人们研究其配子体的受
精机制提出了新的要求。
(下转第 2353页)
2332 安徽农业科学 2010年
将上述固定好的组织制作成石蜡切片 。以 HSP70单克
隆抗体为一抗进行免疫组化检测。具体步骤如下:①将上述
组织蜡块切片 、烤片 、脱蜡 、至水。热修复抗原:将切片浸入
浓度 0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH值 6.0),微波炉加热
至沸腾后断电 , 5 ～ 10 min冷却后 ,流水冲洗 5 min。 ②滴加
浓度 3%H2O2 ,室温放置 5 ～ 10 min以灭活内源性酶。流水
冲洗 5 min。③蒸馏水洗 3次 ,浓度 0.01 mol/LPBS洗涤 2
次 。④滴加浓度 5%BSA封闭液 ,室温放置 20 min。甩去多
余的液体。⑤滴加 1∶100的 HSP70一抗 , 37 ℃孵育 1 h。⑥
滴加 1∶100的生物素化羊抗鼠 IgG, 20 ～ 37 ℃反应 30 min。
用浓度 0.01 mol/L的 PBS洗 2 min,共 3次 。⑦滴加 SABC
试剂 , 20 ～ 37 ℃ 30min。用浓度 0.01mol/LPBS洗 5 min,共
4次。⑧DAB显色:滴加新鲜配制的 DAB与底物作用 5 ～ 10
min,水洗终止。⑨以苏木素轻度复染 ,脱水 ,透明 ,封片 。显
微镜观察 ,以显示黄色 、棕黄色或黄色 、棕黄色颗粒判断为阳
性 ,记录结果。
2 结果与分析
2.1 洛克沙胂暴露下班马鱼的急性毒性试验结果 试验
中 ,在连续记录的起始 8h内 ,不同浓度组中斑马鱼出现明显
不同的反应。在较低浓度组中 ,斑马鱼出现反应迟钝 、游动
迟缓 、沉底 、侧游等现象;在较高浓度组中 ,在起始的 4 h内斑
马鱼出现了身体失衡严重 、游速增快 、侧游等现象 ,随着暴露
时间的延长 ,斑马鱼开始变为反应迟钝 ,沉底。以镊子夹住
鱼尾柄无反应的为死亡 ,各组 96 h的死亡数见表 1。
由表 1数据计算得出 ,洛克沙胂对斑马鱼 96h的 LC50为
249.80 mg/L, Sx50为 0.031 3, LC50的 95%可信范围为 248.65
～250.95 mg/L。
2.2 斑马鱼免疫组织化学染色结果 由图 1可见 ,在受试
斑马鱼的性腺 、鳃 、肝脏中都有不同程度的阳性染色 ,其中
HSP70在鳃中强阳性表达 ,主要分布在鳃小片的基底膜 、鳃
弓和鳃丝上皮细胞及红细胞的胞质中;在性腺组织中 ,性腺
基质细胞的胞质中有强阳性黄色或黄色颗粒;在肝脏中也有
表达 ,主要在肝中央静脉 。
3 结论与讨论
试验结果表明 ,洛克沙胂对斑马鱼 96 h的LC50为 249.80
mg/L, Sx50为 0.031 3, LC50的 95%可信范围为 248.65 ～250.95
mg/L。参照鱼类急性毒性分级标准 [ 7] ,可知洛克沙胂对于斑
马鱼的毒性属于低毒范围。
鳃是斑马鱼的呼吸器官 ,最早接触污染物 ,对外来毒物
的刺激比较敏感 ,表达呈强阳性 , HSP70主要定位在鳃小片
的基底膜和黏液细胞 ,鳃弓上的动静脉血管呈弱阳性;肝脏
是鱼体内最大 、最主要的消化腺 ,又是主要的解毒器官 ,免疫
组化染色结果显示 ,肝小叶的中央静脉等血管处呈现强烈的
阳性染色 ,推测可能与不同血管的功能有关。HSP70主要分
布在肝细胞的胞浆和胞核中 ,尤以胞核中的阳性染色更强。
静脉主要起到血液贮存库的作用 , HSP70在静脉血管处强表
达可能与维持血液循环量有关;鱼类性腺成熟与繁殖的周期
性既受体内神经 、内分泌腺的调节控制 ,也受外界环境条件
的影响。斑马鱼性腺对于洛克沙胂的刺激也比较敏感 ,
HSP70呈强阳性表达 ,可以对性腺组织细胞起有力的保护
作用。
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(上接第 2332页)
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