全 文 ：半边旗活性成分 5F对 C26 结肠癌细胞 cAMP水平的影响
叶华1，2，吴琼2，3，郭蒙2，3，秦峥1，吕应年2，梁念慈2，郑学宝1，2
(1. 南方医科大学，广东 广州 510515;2. 广东医学院广东天然药物研究与开发重点实验室，广东 湛江 524023;
3. 广东医学院药理教研室，广东 湛江 524023)
摘 要:目的:探讨半边旗活性成分 Ent － 11α － hydroxy － 15 － oxo － kaur － 16 － en － 19 － oic － acid(5F)对 C26 结肠
癌细胞环磷酸腺苷(cAMP)水平的影响。方法:以不同时间、不同浓度 5F处理 C26 细胞，放免法测定 cAMP 含量。磷酸
二酯酶抑制剂 3 － Isobutyl － 1 － methylxanthine(IBMX)预先孵育后再与 5F联合应用，放免法检测 cAMP含量，MTT法检测
C26细胞活力。结果:5F可以显著增加 cAMP含量，具有时间和剂量依赖性;5F 对 cAMP 含量的作用不受 IBMX 影响，
IBMX可以增强 5F对 cAMP的促进作用和对 C26 细胞增殖的抑制作用。结论:5F 可能通过激活腺苷酸环化酶(AC)增
加 C26 细胞 cAMP含量，这可能是 5F抗肿瘤的作用机制之一，5F与 IBMX联合应用具有协同效应。
关键词:半边旗;5F;结肠癌;cAMP
中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1000 － 1719(2012)11 － 2150 － 03
Effects of 5F on cAMP Levels in C26 Color Cancer Cells
YE Hua1，2，WU Qiong2，3，GUO Meng2，3，QIN Zheng1，LU Ying-nian2，
LIANG Nian-ci2，ZHENG Xue-bao1，2
(1. Southern Medical University，Guangzhou 510515，Guangdong，China;
2. Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Natural Drugs，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023，
Guangdong，China;3. Department of Pharmacology，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023，Guangdong，China)
Abstract:Objective:To investigate the effect of ent-11α － hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid(5F) ，a compound isolated
from Pteris semipinnata L(PsL) ，on cAMP levels in C26 color cancer cells． Methods:C26 cells were treated with 5F(0 ～ 40μg /
mL)for different time periods． The cAMP levels were examined by radioimmunoassay． IBMX was used for pre-incubation and then
combined with 5F，cAMP levels were measured． Viability was examined using a MTT method． Results:5F increased cAMP levels
significantly，in a concentration and time dependent manner． The effect was not affected by IBMX． IBMX can enhance the role of 5F
on cAMP levels and the inhibition of C26 cell proliferation． Conclusion:5F may increase the cAMP content of C26 cells by activating
the adenylate cyclase(AC) ，which may be one of the anti-tumor mechanisms of 5F． 5F has a synergistic effect with IBMX．
Key words:Pteris semipinnata L;5F;color cancer;cAMP
收稿日期:2012 － 05 － 01
基金项目:国家自然科学基金 (3987099) ;国家 自 然 科 学 基 金
(30772701) ;湛江市科技攻关项目(2009C3104003) ;东莞市
科技计划项目(2008108101036)
作者简介:叶华(1980 －) ，女，广东湛江人，讲师，博士研究生，研究方
向:中药药理学研究。
通讯作者:郑学宝(1964 －) ，男，河南信阳人，教授，博士研究生导师，博
士，研究方向:中药及中药复方药理学研究工作。
半边旗(Pteris Semipinnata L)系凤尾蕨科植物，始
载于《岭南采药录》，为南方民间常用草药，用于治疗
菌痢、肝炎、肠炎、结膜炎等。我们发现半边旗的水提
物和醇提物均能有效抑制肿瘤细胞的生长，对小鼠移
植瘤有明显抑制作用［1 － 2］，并分离纯化出具有强抗肿
瘤活性的贝壳杉烷型二萜类化合物 5F［3 － 4］。目前已发
现半边旗提取物 5F对白血病、肺腺癌、鼻咽癌、肝癌、
胃癌和结肠癌细胞有明显抑制作用，对高转移卵巢癌
细胞有抗肿瘤转移作用，对小鼠 S180 肉瘤、淋巴肉瘤
及 HepA肝癌均有明显抑制作用［5 － 7］，但是确切的作用
机制还不清楚。本文通过研究 5F 对 C26 结肠癌细胞
cAMP含量的影响，探讨 5F对 C26 细胞的抑制作用与
cAMP水平的关系，为进一步明确 5F 的作用机制提供
实验依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
C26 细胞，北京协和医学院药理教研室惠赠。5F
干粉由广东天然药物研究与开发重点实验室提供，经
丙二醇溶解，蒸馏水稀释，除菌过滤后冷藏保存(丙二
醇最终浓度≤0. 012)。PMI － 1640 培养基干粉、丙二
醇、二甲基亚砜 DMSO、MTT、IBMX (Sigma 公司) ;新
生牛血清(Hyclone公司) ;青霉素及链霉素、胰蛋白酶
(Amresco 公司) ;3H － cAMP(中国原子能科学研究
院) ;闪烁液(Beckman公司)。
1. 2 方法
1. 2. 1 细胞培养 BALB /C 鼠源性结肠癌细胞系
C26 用含 10% 胎牛血清的 1640 培养基在 37℃、5%
CO2 条件下常规培养。当单层细胞长到70% ～80%融
合时，0. 25%胰蛋白酶消化，收集细胞，PBS 洗一次备
用。
1. 2. 2 放免法测定 cAMP 含量 收集对数生长期的
C26 细胞，100℃沸水浴 5min，加细胞裂解液于 4℃、
2500r /min离心 5min，取上清 100μL测定 cAMP浓度。
整个反应在冰浴下进行，反应总体积为 300μL。按顺
·0512· 辽宁中医杂志 2012 年第 39 卷第 11 期
DOI：10.13192/j.ljtcm.2012.11.45.yeh.061
序依次加入相应的 100μL 细胞样品、50μL 3H －
cAMP，混匀后加入 50μL结合蛋白，轻轻摇匀，冰上反
应 2h，加入活性炭吸附剂 100μL，混匀后迅速 4℃、
12000r /min离心 5min;取上清 200μL 加入闪烁杯，加
入 5mL闪烁液，3mL无水乙醇，充分混匀，室温震摇过
夜后，于液闪仪测定放射性强度(cpm)。每次测定均
设标准管(S)、总放射活性管(CT)、空白对照管(CO)
和本底管(B)。根据标准曲线求样品中 cAMP含量。
1. 2. 3 MTT法检测肿瘤细胞存活率 当 C26 生长面
积达细胞培养瓶底面积 80%时，以 0. 25%胰酶剥离细
胞，细胞计数并以培养液调整细胞浓度，接种细胞于
96 孔培养板，确定每孔含细胞 2000 个。细胞贴壁后
换液，各实验组添加 5F 并使其终浓度分别为 5、10、
20、40、80mg /L，阴性对照组则加相同体积培养液。实
验组每个剂量设 8 个平行孔，阴性对照组同样设 8 孔。
经 24h、48h、72h培养后，加 MTT 染液(MTT 终浓度为
0. 5mg /mL)并继续培养 4h，弃上清，每孔加 DM-
SO100μL，震荡 5min后以酶标仪检测波长 570nm处吸
光度，计算肿瘤细胞存活率。
1. 2. 4 统计学处理 采用 SPSS 13. 0 软件系统单因
素方差分析对实验数据进行统计学处理，P ＜ 0. 05 认
为差异有统计学意义。每个实验均重复 3 次以上。
2 结 果
2. 1 5F作用不同时间对 cAMP含量的影响
5F分别作用于 C26 细胞 5、10、20 和 30min，观察
cAMP 含量的变化。结果显示，随着作用时间逐渐延
长，cAMP 含量逐渐增加，20min 时最高，而空白组
cAMP含量没有明显变化(图 1)。
图 1 5F20μg /mL作用不同时间对 C26 细胞 cAMP含量的影响
2. 2 不同浓度 5F对 cAMP含量的影响
分别用 5、10、20、40μg /mL 5F 作用于 C26 细胞
20min，结果表明 5F 对 C26 细胞 cAMP 含量的影响具
有剂量依赖性，随着 5F 浓度增加，cAMP 含量逐渐增
加，5F10、20、40μg /mL剂量组与空白组相比有显著差
异(图 2)。
2. 3 5F、IBMX及两者联合应用对 cAMP的影响
0. 5mM IBMX 预先孵育 15min，然后再加入不同
浓度 5F 孵育 15min，显示 5F 和 IBMX 都可以增加
cAMP含量，而两者联合应用具有协同效应(图 3)。
2. 4 5F、IBMX及两者联合应用对 C26 细胞活力的影
响
0. 5 mM IBMX 预先孵育 15min，然后再加入不同
浓度 5F孵育 48h，观察 C26 细胞活力的变化。5F 和
IBMX都可以抑制 C26 结肠癌细胞增殖，而两者联合
应用具有协同效应(图 4)。
注:与空白组相比，＊＊P ＜ 0. 01。
图 2 不同浓度 5F作用 20min对 cAMP的影响
注:与空白组相比，＊＊P ＜ 0. 01;与 IBMX单独处理组相比，##P ＜ 0. 01。
图 3 5F与 IBMX联合应用 20min对 cAMP的影响
注:与空白组相比，＊＊P ＜ 0. 01;与 IBMX单独处理组相比，##P ＜ 0. 01。
图 4 5F与 IBMX联合应用 48h对 C26 细胞活力的影响
3 讨 论
一切生命现象，都表现为机体内细胞对胞外信息
的反应，并最终在胞内产生特定效应的一系列复杂的
信号传导和调控的过程。生命活动的维持、机体内环
境的稳定也有赖于这一系列信号转导和调节系统。
cAMP(3＇，5＇－环单磷酸腺苷)是细胞中一种非常重要
的第二信使分子，也是第一个被发现的第二信使分子，
具有广泛的生物效应。cAMP由 ATP在腺苷酸环化酶
的催化作用下转化而来的，在 cAMP 磷酸二酯酶
(cAMP － PDE)的催化作用下转化为 5＇－ AMP 而被消
除。在正常状态下，cAMP 的生成和消除处于一个动
态平衡状态下，使得细胞内的 cAMP水平保持稳定。
研究表明，cAMP 与肿瘤的发生发展有一定的关
系。肿瘤组织和血液中 cAMP含量一般低于正常细胞
水平［8］;不少抗肿瘤药可以提高肿瘤组织和血液的
cAMP含量［9］;cAMP 诱导剂、内外源性 cAMP 及其衍
生物如 8 － Br － cAMP 和 8 － CPT － cAMP 等均可以抑
制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡和分化［10 － 11］。我们的研
究发现，5F可以提高C26结肠癌细胞cAMP含量，并
·1512·辽宁中医杂志 2012 年第 39 卷第 11 期
具有明显的时间和剂量依赖关系，表明 5F 与 C26 细
胞膜上的特异受体结合后，可能通过 cAMP 信号通路
发挥抗肿瘤作用。为进一步明确 5F 提高 cAMP 浓度
的机制，我们用最大剂量的广谱磷酸二酯酶抑制剂 IB-
MX预先孵育，发现 IBMX 不仅没有消除 5F 对 cAMP
的促进作用，而且进一步提高了 cAMP 的含量。由此
提示，5F可能通过激活腺苷酸环化酶，而不是抑制磷
酸二酯酶来发挥作用的。
IBMX与 5F联合应用，还可以增强 5F 对 C26 细
胞增殖的抑制效应。cAMP 对细胞的调节作用是通过
激活蛋白激酶 A(protein kinase A，PKA)系统来实现
的。PKA被 cAMP激活后，能在 ATP 存在的情况下使
许多蛋白质特定的丝氨酸残基和(或)苏氨酸残基磷
酸化，从而调节细胞的物质代谢和基因表达。5F 与
IBMX 的协同效应产生的原因，我们推测可能是因为
两者均可以提高 cAMP 含量，当联合应用时，cAMP 水
平进一步提高，再通过 PKA等下游途径导致协同抑制
细胞增殖效应的出现。这一协同效应的发现也为我们
寻找减毒增效的药物组合，开发 5F的复方制剂提供了
实验依据。
收稿日期:2012 － 05 － 05
基金项目:上海市卫生局中医临床优势专科耳鸣专病建设项目
(2008SW0276)
作者简介:柳普照(1978 －) ，男，河南洛阳人，讲师，博士，研究方向:耳
鸣的基础与临床。
通讯作者:李明(1952 －) ，男，教授，研究方向:耳鸣的基础与临床，E-
mail:liming0168@ sina． com。
参考文献
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主观性耳鸣患者中医体质学临床特征研究
柳普照1，2，张剑宁1，杨光1，李明1
(1. 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院耳鼻咽喉科，上海 200437;
2. 河南中医学院第二附属医院耳鼻咽喉科，河南 郑州 450002)
摘 要:目的:从中医体质学角度探讨耳鸣发病机理，分析各型耳鸣患者体质特征。方法:按照体质研究要求建立纳
入标准，对 1164 例以耳鸣为第一主诉的患者，按照《中医体质分类与判定》标准录入和评价，给予心理声学和耳鸣严重程
度评估。结果:(1)1164 例耳鸣患者中，符合平和质 515 例(44. 24%) ，其中是平和质 292 例(25. 08%) ，基本是平和质
223 例(19. 16%)。偏颇体质 649 例(56. 76%) ，其中气虚质 171 例(14. 69%) ，阳虚质 342 例(29. 38%) ，阴虚质 53 例
(4. 55%) ，气郁质 42 例(3. 61%) ，血瘀质 20 例(1. 72%) ，痰湿质 10 例(0. 86%) ，湿热质 4 例(0. 34%) ，特稟质 7 例
(0. 61%)。(2)对应分析结果显示:间距型掩蔽曲线与气郁质相关性最大(距离为 0. 067417) ;汇聚型掩蔽曲线与是平
和质(距离为 0. 160331)、不能掩蔽型掩蔽曲线与气虚质(距离为 0. 182135)相关性最大。耳鸣严重程度 4 级患者与气郁
质(距离为 0. 211206)相关性最大。(3)耳鸣匹配频率在各类型体质的分布无统计学差异(P = 0. 11)。掩蔽后效应在各
类型体质的分布存在统计学差异(P = 0. 020)。结论:耳鸣患者以虚性体质(气虚质、阳虚质、阴虚质)最多，实性体质(痰
湿质、湿热质、血瘀质、气郁质)较少，说明耳鸣病机转化为虚实夹杂，以虚为主。耳鸣患者不同体质与耳鸣匹配状况、掩
蔽后效应试验及严重程度之间存在一定的关系。
关键词:主观性耳鸣;中医体质学;临床特征
中图分类号:R764． 45 文献标识码:A 文章编号:1000 － 1719(2012)11 － 2152 － 03
耳鸣是指在周围环境中无相应声源或电刺激存在
的情况下，患者自觉耳内或颅内有声音的一种主观症
状，常伴或不伴有听力下降，睡眠障碍、心烦、恼怒、注
意力无法集中、焦虑、抑郁等不良心理反应。严重者完
全无法工作，此类耳鸣在临床上常称为主观性耳鸣。
随着我国现代化进程的发展，人们工作、生活的压力日
益增加，加之环境噪声污染及人口老龄化等因素的影
响，耳鸣的发病率呈逐年升高的趋势，更为担心的是需
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