全 文 ：珊瑚菜叶绿体基因 TrnV －M序列的 PCＲ扩增与分析
慕春歌 (鲁东大学资产处，山东烟台 264025)
摘要 ［目的］对珊瑚菜 TrnV －M基因片段 PCＲ扩增条件进行优化和测序分析，为濒危物种珊瑚菜的种质资源保护和遗传多样性研究
提供理论依据。［方法］探索并优化珊瑚菜叶绿体基因片段 TrnV － M的 PCＲ扩增条件，并对扩增产物进行测序分析。［结果］珊瑚菜
TrnV －M基因片段的 PCＲ最佳反应体系:dNTPs 0． 50 μL，Buffer 2． 50 μL，TrnM 1． 25 μL，TrnV 1． 25 μL，DNA 1． 00 μL，rTaqE 0． 15 μL，
ddH2O 18． 35 μL，总体积25． 00 μL。最佳扩增程序:94 ℃预变性3． 0 min;94 ℃变性50 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 25 s，38个循环;
72 ℃延伸 8 min。［结论］在最优体系下获得了清晰、稳定的目的条带，校正后条带长度约为 757 bp，通过 GenBank 的 BLAST 比对，确定
为 TrnV －M基因片段。
关键词 珊瑚菜;TrnV －M;PCＲ扩增;最佳反应体系
中图分类号 S188 + ． 1;Q789 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2016)33 －0135 －02
PCＲ Amplication and Analysis of Glehnia littoralis Using TrnV-M Gene Fragments
MU Chun-ge (Asset Department of Ludong University，Yantai，Shandong 264025)
Abstract ［Objective］The aim was study PCＲ amplication and analysis of Glehnia littoralis using TrnV-M gene fragments，to provide a tech-
nical basis for germplasm resources protection and genetic diversity study of Glehnia littoralis． ［Methods］The PCＲ amplification conditions for
TrnV-M gene fragments of Glehnia littoralis were explored and optimized，and the PCＲ products were sequenced． ［Ｒesult］The optimized PCＲ
system was acquired as follows:dNTPs 0． 50 μL，Buffer 2． 5 μL，TrnM 1． 25 μL，TrnV 1． 25 μL，DNA 1. 00 μL，rTaqE 0． 15 μL，ddH2O
18． 35 μL，the total volume was 25 μL． The optimized thermal cycling profile was as follows:initial template denaturation at 94 ℃ for 3 min，
94 ℃ for 50 s，58 ℃ for 45 s，and 72 ℃ for 1 min 25 s，followed by 38 cycles，with a final extension of 72 ℃ for 8 min． ［Conclusion］The
total alignment of TrnV-M sequences was 757 bp in length after sorting by hand．
Key words Glehnia littoralis;TrnV-M gene fragments;PCＲ amplification;Optimized PCＲ system
基金项目 山东省自然科学基金面上项目(ZＲ2010CM056)。
作者简介 慕春歌(1971 － ) ，男，山东栖霞人，实验师，从事植物学方面
的研究。
收稿日期 2016-10-28
单种属植物珊瑚菜(Glehnia littoralis F． Schmidt ex Miq．)
为伞形科(Umbelliferae)珊瑚菜属(Glehnia)多年生草本植
物，主要分布在东亚地区的中国、韩国、日本 3 个国家海岸线
区域的沙滩以及北美地区的美国近海沙滩，在我国主要分布
在辽宁、山东、江苏、浙江、台湾、福建、广东和海南岛沿海海
岸［1］。珊瑚菜耐盐碱，生活环境以海滨沙滩为主，松软的砂
质土壤为其膨大的根部发育提供了保证，其根用作镇咳祛痰
药，为我国应用广泛的传统中药材［2 －5］。另外，珊瑚菜扎入
深层土壤的根系对于海岸固沙和盐碱土的改良具有重要意
义。近年来，随着海滨开发力度的增加，珊瑚菜原始生态环
境遭到严重破坏，野生资源急剧减少，分布面积越来越窄;同
时，人为采挖也加大了珊瑚菜野生居群的急剧减少，造成了
珊瑚菜很多原产地的消失。目前该物种已被列为国家Ⅱ级重
点保护野生植物［6］，被称为植物界的“大熊猫”。
植物遗传多样性评估是研究濒危物种保护机制的重要
手段。近几年，利用分子手段研究珊瑚菜遗传多样性的报道
很多，大多采用等位酶、SＲAP、ISSＲ等分子标记法［7 －9］，采用
叶绿体基因序列进行标记的研究较少。叶绿体基因组 DNA
由于其属于单系遗传，不受网状进化、杂交等因素的影响，且
具有进化速率较快、相对保守等特点，一直作为良好的分子
标记被广泛应用于物种进化和遗传多样性的研究［10 －11］。叶
绿体基因片段 TrnV －M作为其中的一员近年来也被用于物
种进化的研究，如利用基因片段对肉苁蓉属系统位置的研
究［12 －13］和高山植物偏花报春居群遗传多样性方面的研
究［14 －15］。笔者对珊瑚菜 TrnV － M 基因片段 PCＲ 扩增条件
进行优化和测序分析，旨在为珊瑚菜物种遗传多样性研究提
供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料 试验所用珊瑚菜叶片均为野外采集并用硅胶干
燥保存。
1． 2 试剂 50 mol /L Tris － HCl(pH 8)、10 mmol /L EDTA
(pH 8)、0． 7 mol /L NaCl、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、
40 mmol /L β －巯基乙醇、氯仿 ∶ 异戊醇(24∶ 1)、无水乙醇、
75%(V /V)乙醇、异丙醇、溴化乙锭(EB)、琼脂糖、0． 5 × TBE
等。Taq DNA 聚合酶(TaKaＲa 公司)、10 × PCＲ 缓冲液、
MgCl2、DMSO、dNTP 混合物、PCＲ 扩增引物、DL 2000 DNA
Marker、Loading buffer、胶回收试剂盒(上海生物工程有限公
司) ，双蒸水。
1． 3 器材 恒温水浴锅、PCＲ扩增仪(BIO － ＲAD)、电泳仪、
电泳槽、电子天平、制冰机、恒温摇床、高压灭菌锅、台式离心
机、凝胶成像仪、微量移液器、研钵、解剖刀、一次性手套、
0． 5、1． 5、2． 0 mL 离心管、Tip头、PCＲ小管、电冰箱、吸水纸、
微波炉、锥形瓶等。
1． 4 方法
1． 4． 1 总 DNA 的提取与检测。采用改进的 CTAB 法［16 －17］
提取珊瑚菜基因组 DNA，用 1． 0%琼脂糖凝胶进行电泳检测
(EB浓度为 0． 5 mg /mL) ，用凝胶成像仪进行条带观测，根据
条带亮度和有无拖尾情况，粗略估计该样品 DNA 的质量和
浓度。将检测合格的 DNA(浓度较大的 DNA用超纯水稀释
至约 20 ng /μL) ，置于 －20 ℃冰箱中备用。
1． 4． 2 TrnV － M 基因片段的扩增及检测。以 TrnV － M － F
(CCTGTAGGYTGNGCNCCYTT)、TrnV － M － Ｒ(AAACGAT-
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2016，44(33):135 － 136，154 责任编辑 李占东 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2016.33.129
GTGGNAGNAAＲCA)为引物，在 25． 00 μL 反应体系中
(dNTPs 0． 50 μL，Buffer 2． 50 μL，TrnM 1． 25 μL，TrnV
1． 25 μL，DNA 1． 00 μL，rTaqE 0． 15 μL，ddH2O 18． 35 μL) ，通
过不同退火温度(48、50、52、54、56、58、60 ℃)的扩增程序，确
定最适扩增程序。PCＲ反应结束后，取 2 μL PCＲ 产物进行
琼脂糖凝胶电泳检测，在全自动数码凝胶成像仪上进行观察
并拍照，其余产物置于 4 ℃冰箱保存。
1． 4． 3 PCＲ扩增产物的纯化与测序。将成功扩增的条带进
行割胶纯化，纯化试剂盒购自上海生物工程有限公司，纯化
步骤参考试剂说明书。将 PCＲ 纯化产物送青岛华大基因公
司进行测序，测序结果提交 GenBank(GenBank 号正在申请
中) ，然后采用 BLAST功能在 GenBank 中进行同源性检测。
2 结果与分析
2． 1 DNA提取结果 采用 CTAB法提取的基因组 DNA 纯
化后，经 1． 0%琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰，且纯度较高，
可作为 PCＲ反应的模板(图 1)。
图 1 基因组 DNA的电泳图谱
Fig． 1 Electrophoretogram of genomic DNA
2． 2 PCＲ扩增结果 PCＲ 产物的琼脂糖凝胶电泳分析结
果见图 2。由图 2 可知，58 ℃下可见清晰条带，其他条件不
能获得目的基因片段，因此，确定最适扩增程序:94 ℃预变性
30 min;94 ℃变性 50 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min 25 s，
38次循环;72 ℃延伸 8 min。
图 2 58 ℃退火温度下 PCＲ扩增电泳图谱
Fig． 2 PCＲ electrophoretogram under 58 ℃annealing tempera-
ture
2． 3 PCＲ产物纯化和测序结果 取纯化后的 PCＲ 扩增产
物 2 μL进行电泳检测，结果见图 3。由图 3 可知，电泳条带
清晰，无杂带，纯化效果良好，纯化产物送华大基因公司进行
测序，获得基因序列长度校正后约为 757 bp，通过 GenBank
的 BLAST 比对，确定为 TrnV －M基因片段。
图 3 PCＲ产物纯化电泳图谱
Fig． 3 Electrophoretogram of PCＲ purified product
3 讨论
TrnV －M基因片段扩增成功的第一步是高质量基因组
DNA的获得，适宜的 PCＲ 条件也是成功扩增必不可少的。
该研究采用改进的 CTAB 法提取珊瑚菜基因组 DNA，以
TrnV －M － F、TrnV －M － Ｒ为引物，利用珊瑚菜基因组 DNA
为模板进行扩增，通过单因素试验研究 2 对引物的 PCＲ 扩
增条件，并对扩增产物进行纯化，最后送至基因公司测序，通
过核酸序列比对确定扩增结果的可靠性。影响 PCＲ 扩增效
果的因素较多，主要有模板 DNA 质量、引物的种类与用量、
DNA 聚合酶、Mg2 +、dNTPs、退火温度等。模板 DNA质量直
接影响扩增条带的纯度;引物和 DNA 聚合酶浓度影响扩增
体系的特异性;Mg2 +影响 PCＲ的多个方面，Mg2 +浓度过高会
引起非特异性扩增，而浓度过低会降低 Taq 酶活性，使反应
产物减少;dNTPs是 PCＲ 反应的原料，浓度过低会降低 PCＲ
产物产量，导致扩增条带模糊不清;浓度过高错配率大大增
加，且能与 Taq 酶竞争 Mg2 +，使体系中游离的 Mg2 +浓度降
低，进而影响扩增效果;退火温度则是 PCＲ反应体系的最后
关口，温度过高使得引物不容易退火，降低 PCＲ 产物产量;
温度过低会导致错配概率加大。以上各因素并非单独作用
而是共同影响 PCＲ 体系扩增效果，合理搭配可获得良好扩
增效果。
在最优体系的构建过程中，传统上是通过设定单因素试
验进行梯度筛选，近年来又发展了正交设计试验和均匀设计
试验。由于影响因素很多，逐级筛选需要多次试验才能完
成，往往需要大量人力物力。因此，如何尽快地找到最佳扩
增条件也是提高试验效率的一个重要步骤。考虑到 PCＲ 扩
增体系中各成分的含量允许在一定范围内浮动，且试剂公司
提供各试剂适用浓度范围，构建适合于大部分扩增条件的基
本体系相对容易，在此基础上，仅需要通过改变退火温度这
一个因素进行优化即可得到成功扩增的条件，该研究根据以
上优化原则，高效快速地建立了珊瑚菜 TrnV －M基因片段的
扩增条件。最佳扩增体系:dNTPs 0． 50 μL，Buffer 2． 50 μL，
(下转第 154页)
631 安徽农业科学 2016 年
以种子距杯面 1 cm为宜，用基质将种子盖好，淋透水，让种
子与基质充分接触。每次选出适于播种的种子后，将未露白
和胚根未达 0． 5 cm长的种子重新放入恒温室继续催芽。催
芽后期，少量仍未见露白的种子不再进行催芽，将其直接撒
播于常规大田苗床，撒播后盖上约 1 cm厚的河砂，再加盖薄
膜小拱棚。
以茎芽长出床面为发芽标准，在广西融水县的气候条件
下，采用沙床埋放轻基质育苗容器杯加盖小拱膜育苗法，将
胚根长≥0． 5 cm种子点播，20 d后有少量种子发芽，茎芽呈
绿色，子叶不展开。
将催芽32 d后仍未露白的种子直接撒播于常规大田，苗
床播种 28 d 后有种子发芽，播种 60 d 后发芽率为 31． 3%。
说明经催芽但末期未露白的种子播种后仍具有发芽力，但发
芽时间相对偏迟，发芽率也相对较低，育苗时应加以区别管
护，以确保苗木生长一致。
6 苗期管理
6． 1 肥水管理 桂北地区气温较低，点播后，育苗床应加盖
薄膜小拱棚保温保湿，并根据天气情况适时揭膜通气和淋水
保湿，气温稳定回升到 20 ℃时，可揭除盖膜。长出真叶后注
意追肥，采用床面撒施或对水淋施，肥料以三元复合肥为主，
氮素肥料(尿素)为辅。在床面湿润时进行撒施，施用量
225 kg /hm2，10 ～ 15 d施 1 次;淋施可对水 150 倍，床面淋施
6 ～7 L /m2 水肥，7 ～10 d 施 1 次。苗期及时清除杂草，避免
苗草争肥。
6． 2 病虫害防治 牛大力苗期对各种病害不敏感，育苗过
程中未见病害发生。但牛大力种子发芽后，苗茎约 2 mm时
易受地老虎为害，用 30%毒死蜱 1 000倍液淋施苗床有较好
的防治效果。另外，苗期叶片、嫩梢易受蚜虫为害，用 30%毒
死蜱 1 500 倍液 + 3%阿维菌素 1 500 倍液叶面喷雾效果
较好。
7 苗木出圃
出圃苗要求块根发达，生长良好，有羽状复叶，叶色浓
绿，健康无病斑。牛大力种子经恒温保湿催芽后，当胚根长
≥0． 5 cm时，采用轻基质无纺布育苗容器杯点播育苗，出圃
合格苗率达 87． 6%，出圃苗根系均明显穿透营养杯，块根深
扎苗床底部土壤，仅有少量须根缠绕在营养杯基质中。
牛大力为直根性植物，块根粗壮发达，须根细弱，这种特
性在苗期就有明显表现，如果采用容积较小的营养杯(袋)育
苗，苗木尚未出圃，主根就早已经穿杯(袋) ，而保留在营养杯
(袋)中的须根少且弱，因此牛大力采用小容积营养杯(袋)
育苗意义不大。
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36 －38．
(上接第 136 页)
TrnM 1． 25 μL，TrnV 1． 25 μL，DNA 1． 00 μL，rTaqE 0. 15 μL，
ddH2O 18． 35 μL，总体积 25． 00 μL;最适退火温度为58 ℃。
4 结论
该研究通过经验估计和退火温度梯度设计，简便快速地
建立了珊瑚菜 TrnV －M基因片段的最佳扩增条件，为珊瑚菜
的系统进化和遗传多样性研究奠定基础，还可为今后珊瑚菜
亲缘物种甚至其他物种该基因的获得提供参考。该方法的
优点是高效、简便、快捷，具有较强的实用价值;其缺点是需
要丰富的经验来预估相关影响因素的最适浓度，具有一定的
主观性和不确定性，在对 PCＲ扩增产物要求较高的研究中，
有必要对相关因素进行一定浓度梯度筛选。
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