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珊瑚菜叶绿体基因TrnV-M序列的PCR扩增与分析



全 文 :珊瑚菜叶绿体基因 TrnV -M序列的 PCR扩增与分析
慕春歌 (鲁东大学资产处,山东烟台 264025)
摘要 [目的]对珊瑚菜 TrnV -M基因片段 PCR扩增条件进行优化和测序分析,为濒危物种珊瑚菜的种质资源保护和遗传多样性研究
提供理论依据。[方法]探索并优化珊瑚菜叶绿体基因片段 TrnV - M的 PCR扩增条件,并对扩增产物进行测序分析。[结果]珊瑚菜
TrnV -M基因片段的 PCR最佳反应体系:dNTPs 0. 50 μL,Buffer 2. 50 μL,TrnM 1. 25 μL,TrnV 1. 25 μL,DNA 1. 00 μL,rTaqE 0. 15 μL,
ddH2O 18. 35 μL,总体积25. 00 μL。最佳扩增程序:94 ℃预变性3. 0 min;94 ℃变性50 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min 25 s,38个循环;
72 ℃延伸 8 min。[结论]在最优体系下获得了清晰、稳定的目的条带,校正后条带长度约为 757 bp,通过 GenBank 的 BLAST 比对,确定
为 TrnV -M基因片段。
关键词 珊瑚菜;TrnV -M;PCR扩增;最佳反应体系
中图分类号 S188 + . 1;Q789 文献标识码 A 文章编号 0517 -6611(2016)33 -0135 -02
PCR Amplication and Analysis of Glehnia littoralis Using TrnV-M Gene Fragments
MU Chun-ge (Asset Department of Ludong University,Yantai,Shandong 264025)
Abstract [Objective]The aim was study PCR amplication and analysis of Glehnia littoralis using TrnV-M gene fragments,to provide a tech-
nical basis for germplasm resources protection and genetic diversity study of Glehnia littoralis. [Methods]The PCR amplification conditions for
TrnV-M gene fragments of Glehnia littoralis were explored and optimized,and the PCR products were sequenced. [Result]The optimized PCR
system was acquired as follows:dNTPs 0. 50 μL,Buffer 2. 5 μL,TrnM 1. 25 μL,TrnV 1. 25 μL,DNA 1. 00 μL,rTaqE 0. 15 μL,ddH2O
18. 35 μL,the total volume was 25 μL. The optimized thermal cycling profile was as follows:initial template denaturation at 94 ℃ for 3 min,
94 ℃ for 50 s,58 ℃ for 45 s,and 72 ℃ for 1 min 25 s,followed by 38 cycles,with a final extension of 72 ℃ for 8 min. [Conclusion]The
total alignment of TrnV-M sequences was 757 bp in length after sorting by hand.
Key words Glehnia littoralis;TrnV-M gene fragments;PCR amplification;Optimized PCR system
基金项目 山东省自然科学基金面上项目(ZR2010CM056)。
作者简介 慕春歌(1971 - ) ,男,山东栖霞人,实验师,从事植物学方面
的研究。
收稿日期 2016-10-28
单种属植物珊瑚菜(Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.)
为伞形科(Umbelliferae)珊瑚菜属(Glehnia)多年生草本植
物,主要分布在东亚地区的中国、韩国、日本 3 个国家海岸线
区域的沙滩以及北美地区的美国近海沙滩,在我国主要分布
在辽宁、山东、江苏、浙江、台湾、福建、广东和海南岛沿海海
岸[1]。珊瑚菜耐盐碱,生活环境以海滨沙滩为主,松软的砂
质土壤为其膨大的根部发育提供了保证,其根用作镇咳祛痰
药,为我国应用广泛的传统中药材[2 -5]。另外,珊瑚菜扎入
深层土壤的根系对于海岸固沙和盐碱土的改良具有重要意
义。近年来,随着海滨开发力度的增加,珊瑚菜原始生态环
境遭到严重破坏,野生资源急剧减少,分布面积越来越窄;同
时,人为采挖也加大了珊瑚菜野生居群的急剧减少,造成了
珊瑚菜很多原产地的消失。目前该物种已被列为国家Ⅱ级重
点保护野生植物[6],被称为植物界的“大熊猫”。
植物遗传多样性评估是研究濒危物种保护机制的重要
手段。近几年,利用分子手段研究珊瑚菜遗传多样性的报道
很多,大多采用等位酶、SRAP、ISSR等分子标记法[7 -9],采用
叶绿体基因序列进行标记的研究较少。叶绿体基因组 DNA
由于其属于单系遗传,不受网状进化、杂交等因素的影响,且
具有进化速率较快、相对保守等特点,一直作为良好的分子
标记被广泛应用于物种进化和遗传多样性的研究[10 -11]。叶
绿体基因片段 TrnV -M作为其中的一员近年来也被用于物
种进化的研究,如利用基因片段对肉苁蓉属系统位置的研
究[12 -13]和高山植物偏花报春居群遗传多样性方面的研
究[14 -15]。笔者对珊瑚菜 TrnV - M 基因片段 PCR 扩增条件
进行优化和测序分析,旨在为珊瑚菜物种遗传多样性研究提
供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料 试验所用珊瑚菜叶片均为野外采集并用硅胶干
燥保存。
1. 2 试剂 50 mol /L Tris - HCl(pH 8)、10 mmol /L EDTA
(pH 8)、0. 7 mol /L NaCl、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、
40 mmol /L β -巯基乙醇、氯仿 ∶ 异戊醇(24∶ 1)、无水乙醇、
75%(V /V)乙醇、异丙醇、溴化乙锭(EB)、琼脂糖、0. 5 × TBE
等。Taq DNA 聚合酶(TaKaRa 公司)、10 × PCR 缓冲液、
MgCl2、DMSO、dNTP 混合物、PCR 扩增引物、DL 2000 DNA
Marker、Loading buffer、胶回收试剂盒(上海生物工程有限公
司) ,双蒸水。
1. 3 器材 恒温水浴锅、PCR扩增仪(BIO - RAD)、电泳仪、
电泳槽、电子天平、制冰机、恒温摇床、高压灭菌锅、台式离心
机、凝胶成像仪、微量移液器、研钵、解剖刀、一次性手套、
0. 5、1. 5、2. 0 mL 离心管、Tip头、PCR小管、电冰箱、吸水纸、
微波炉、锥形瓶等。
1. 4 方法
1. 4. 1 总 DNA 的提取与检测。采用改进的 CTAB 法[16 -17]
提取珊瑚菜基因组 DNA,用 1. 0%琼脂糖凝胶进行电泳检测
(EB浓度为 0. 5 mg /mL) ,用凝胶成像仪进行条带观测,根据
条带亮度和有无拖尾情况,粗略估计该样品 DNA 的质量和
浓度。将检测合格的 DNA(浓度较大的 DNA用超纯水稀释
至约 20 ng /μL) ,置于 -20 ℃冰箱中备用。
1. 4. 2 TrnV - M 基因片段的扩增及检测。以 TrnV - M - F
(CCTGTAGGYTGNGCNCCYTT)、TrnV - M - R(AAACGAT-
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri. Sci. 2016,44(33):135 - 136,154 责任编辑 李占东 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2016.33.129
GTGGNAGNAARCA)为引物,在 25. 00 μL 反应体系中
(dNTPs 0. 50 μL,Buffer 2. 50 μL,TrnM 1. 25 μL,TrnV
1. 25 μL,DNA 1. 00 μL,rTaqE 0. 15 μL,ddH2O 18. 35 μL) ,通
过不同退火温度(48、50、52、54、56、58、60 ℃)的扩增程序,确
定最适扩增程序。PCR反应结束后,取 2 μL PCR 产物进行
琼脂糖凝胶电泳检测,在全自动数码凝胶成像仪上进行观察
并拍照,其余产物置于 4 ℃冰箱保存。
1. 4. 3 PCR扩增产物的纯化与测序。将成功扩增的条带进
行割胶纯化,纯化试剂盒购自上海生物工程有限公司,纯化
步骤参考试剂说明书。将 PCR 纯化产物送青岛华大基因公
司进行测序,测序结果提交 GenBank(GenBank 号正在申请
中) ,然后采用 BLAST功能在 GenBank 中进行同源性检测。
2 结果与分析
2. 1 DNA提取结果 采用 CTAB法提取的基因组 DNA 纯
化后,经 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测,条带清晰,且纯度较高,
可作为 PCR反应的模板(图 1)。
图 1 基因组 DNA的电泳图谱
Fig. 1 Electrophoretogram of genomic DNA
2. 2 PCR扩增结果 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳分析结
果见图 2。由图 2 可知,58 ℃下可见清晰条带,其他条件不
能获得目的基因片段,因此,确定最适扩增程序:94 ℃预变性
30 min;94 ℃变性 50 s,58 ℃退火 45 s,72 ℃延伸 1 min 25 s,
38次循环;72 ℃延伸 8 min。
图 2 58 ℃退火温度下 PCR扩增电泳图谱
Fig. 2 PCR electrophoretogram under 58 ℃annealing tempera-
ture
2. 3 PCR产物纯化和测序结果 取纯化后的 PCR 扩增产
物 2 μL进行电泳检测,结果见图 3。由图 3 可知,电泳条带
清晰,无杂带,纯化效果良好,纯化产物送华大基因公司进行
测序,获得基因序列长度校正后约为 757 bp,通过 GenBank
的 BLAST 比对,确定为 TrnV -M基因片段。
图 3 PCR产物纯化电泳图谱
Fig. 3 Electrophoretogram of PCR purified product
3 讨论
TrnV -M基因片段扩增成功的第一步是高质量基因组
DNA的获得,适宜的 PCR 条件也是成功扩增必不可少的。
该研究采用改进的 CTAB 法提取珊瑚菜基因组 DNA,以
TrnV -M - F、TrnV -M - R为引物,利用珊瑚菜基因组 DNA
为模板进行扩增,通过单因素试验研究 2 对引物的 PCR 扩
增条件,并对扩增产物进行纯化,最后送至基因公司测序,通
过核酸序列比对确定扩增结果的可靠性。影响 PCR 扩增效
果的因素较多,主要有模板 DNA 质量、引物的种类与用量、
DNA 聚合酶、Mg2 +、dNTPs、退火温度等。模板 DNA质量直
接影响扩增条带的纯度;引物和 DNA 聚合酶浓度影响扩增
体系的特异性;Mg2 +影响 PCR的多个方面,Mg2 +浓度过高会
引起非特异性扩增,而浓度过低会降低 Taq 酶活性,使反应
产物减少;dNTPs是 PCR 反应的原料,浓度过低会降低 PCR
产物产量,导致扩增条带模糊不清;浓度过高错配率大大增
加,且能与 Taq 酶竞争 Mg2 +,使体系中游离的 Mg2 +浓度降
低,进而影响扩增效果;退火温度则是 PCR反应体系的最后
关口,温度过高使得引物不容易退火,降低 PCR 产物产量;
温度过低会导致错配概率加大。以上各因素并非单独作用
而是共同影响 PCR 体系扩增效果,合理搭配可获得良好扩
增效果。
在最优体系的构建过程中,传统上是通过设定单因素试
验进行梯度筛选,近年来又发展了正交设计试验和均匀设计
试验。由于影响因素很多,逐级筛选需要多次试验才能完
成,往往需要大量人力物力。因此,如何尽快地找到最佳扩
增条件也是提高试验效率的一个重要步骤。考虑到 PCR 扩
增体系中各成分的含量允许在一定范围内浮动,且试剂公司
提供各试剂适用浓度范围,构建适合于大部分扩增条件的基
本体系相对容易,在此基础上,仅需要通过改变退火温度这
一个因素进行优化即可得到成功扩增的条件,该研究根据以
上优化原则,高效快速地建立了珊瑚菜 TrnV -M基因片段的
扩增条件。最佳扩增体系:dNTPs 0. 50 μL,Buffer 2. 50 μL,
(下转第 154页)
631 安徽农业科学 2016 年
以种子距杯面 1 cm为宜,用基质将种子盖好,淋透水,让种
子与基质充分接触。每次选出适于播种的种子后,将未露白
和胚根未达 0. 5 cm长的种子重新放入恒温室继续催芽。催
芽后期,少量仍未见露白的种子不再进行催芽,将其直接撒
播于常规大田苗床,撒播后盖上约 1 cm厚的河砂,再加盖薄
膜小拱棚。
以茎芽长出床面为发芽标准,在广西融水县的气候条件
下,采用沙床埋放轻基质育苗容器杯加盖小拱膜育苗法,将
胚根长≥0. 5 cm种子点播,20 d后有少量种子发芽,茎芽呈
绿色,子叶不展开。
将催芽32 d后仍未露白的种子直接撒播于常规大田,苗
床播种 28 d 后有种子发芽,播种 60 d 后发芽率为 31. 3%。
说明经催芽但末期未露白的种子播种后仍具有发芽力,但发
芽时间相对偏迟,发芽率也相对较低,育苗时应加以区别管
护,以确保苗木生长一致。
6 苗期管理
6. 1 肥水管理 桂北地区气温较低,点播后,育苗床应加盖
薄膜小拱棚保温保湿,并根据天气情况适时揭膜通气和淋水
保湿,气温稳定回升到 20 ℃时,可揭除盖膜。长出真叶后注
意追肥,采用床面撒施或对水淋施,肥料以三元复合肥为主,
氮素肥料(尿素)为辅。在床面湿润时进行撒施,施用量
225 kg /hm2,10 ~ 15 d施 1 次;淋施可对水 150 倍,床面淋施
6 ~7 L /m2 水肥,7 ~10 d 施 1 次。苗期及时清除杂草,避免
苗草争肥。
6. 2 病虫害防治 牛大力苗期对各种病害不敏感,育苗过
程中未见病害发生。但牛大力种子发芽后,苗茎约 2 mm时
易受地老虎为害,用 30%毒死蜱 1 000倍液淋施苗床有较好
的防治效果。另外,苗期叶片、嫩梢易受蚜虫为害,用 30%毒
死蜱 1 500 倍液 + 3%阿维菌素 1 500 倍液叶面喷雾效果
较好。
7 苗木出圃
出圃苗要求块根发达,生长良好,有羽状复叶,叶色浓
绿,健康无病斑。牛大力种子经恒温保湿催芽后,当胚根长
≥0. 5 cm时,采用轻基质无纺布育苗容器杯点播育苗,出圃
合格苗率达 87. 6%,出圃苗根系均明显穿透营养杯,块根深
扎苗床底部土壤,仅有少量须根缠绕在营养杯基质中。
牛大力为直根性植物,块根粗壮发达,须根细弱,这种特
性在苗期就有明显表现,如果采用容积较小的营养杯(袋)育
苗,苗木尚未出圃,主根就早已经穿杯(袋) ,而保留在营养杯
(袋)中的须根少且弱,因此牛大力采用小容积营养杯(袋)
育苗意义不大。
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36 -38.
(上接第 136 页)
TrnM 1. 25 μL,TrnV 1. 25 μL,DNA 1. 00 μL,rTaqE 0. 15 μL,
ddH2O 18. 35 μL,总体积 25. 00 μL;最适退火温度为58 ℃。
4 结论
该研究通过经验估计和退火温度梯度设计,简便快速地
建立了珊瑚菜 TrnV -M基因片段的最佳扩增条件,为珊瑚菜
的系统进化和遗传多样性研究奠定基础,还可为今后珊瑚菜
亲缘物种甚至其他物种该基因的获得提供参考。该方法的
优点是高效、简便、快捷,具有较强的实用价值;其缺点是需
要丰富的经验来预估相关影响因素的最适浓度,具有一定的
主观性和不确定性,在对 PCR扩增产物要求较高的研究中,
有必要对相关因素进行一定浓度梯度筛选。
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451 安徽农业科学 2016 年