全 文 ：兰州 大学学报 (自然科学版 )
2 1 (生物学样 J l +) :6 9一 76。 8 9 15
六月雪蛋白水解酶的研究
1
.六月雪蛋白水解酶的分离提纯和性质研究
路英华 倪建华
摘
一 、 从大戟科植物六 月雪 (E u ph o rb i a
蛋 白水解酶。
要
M r a gin al a pu r`五) 茎杆乳 汁中分 离提纯 T六 月雪
二 、 用六 月雪乳 汁为原朴 , 做装丙 烯跳胺垂直板电泳 , 显示 乳 汁中蛋 白成份简单 , 易 于提纯
提 纯方 法用荀聚糖 G一1 50 凝 胶过滤 , 可提得三个成份 。 成份 I 有水 解蛋 白 质活性 . 用 酸 、 碱性
聚丙烯酸胺电泳鉴 定为一条区带。
三 、 用凝胶过滤法和 s . D . s . 聚丙炸酸胺凝胶电泳法浏 定水解酶的分子蚤为 1 26 00 0 。 z
四 、 进行 了对该酶动 力学性质研究 , 用酪蛋白 、 B A A 、 及 B A E E 为底物 , 分别 刚 定 此酶水
解肤键 、 酸胺键和脂健 的能力 , ’ 研究了各种 因素叶酶活 力的影响 , 如酶 浓 度 、 P H 、 温度 , 激 活
剂和抑制剂对酶活 力的影响 , 浏 定 了它水解 B A A 的 K m 值 .
木瓜蛋白酶 , 菠萝蛋白酶及无花果蛋白酶等一些植物蛋白水解酶都是从植物茎叶或果实
的乳汁中提取出来的 。 从某些植物分泌的乳汁中提取酶如同从动物的消化液提酶一样 , 由于
都是胞外酶 , 成份较单纯 , 易于提纯 。 早期 W . G . E l il s 〔 1 〕〔 2 〕等人 曾报 导 从 大 戟 科 植 物
E u p h o r b i a L a f卜y r i s和 E u p h 。 r b i a C e r i b e r a 乳汁中提得蛋白酶的粗制剂 , 但未见进一步
工作报导 。
本文报导从六月雪 ( E u p h o r b i a M a r g i n a l a P u r s h ) 中提纯了蛋白水解酶 , 并对其性
质进行了研究 。 六月雪又名银边翠 , 大戟科一年生草本植物 , 长成后植株高三尺左右 , 由于
在它的茎 叶部含有较丰富的乳汁 , 汁中蛋白水解酶的含量多 , 活性强 , 耐热 性 高 , 取 材 方
便 , 为此对该酶进行了分离提纯 , 经酸性 、 碱性聚丙烯胺凝胶 电泳 , 奖定为 一 条 区 带 。 此
外 , 对该酶做了性质研究 , 测定了它 的分子量 , 最适 P H及最适温度等 , 并测定了激活 剂 和
抑制剂对酶活性的影响 。
材 料 和 方 法
一 、 材料 采六月雪植株折茎 去叶 , 取其白色乳汁 , 在植物产乳期 , 用鲜乳做材料提取
酶为好 , 其它季节可用丙酮粉 (乳汁一份倾入冷丙酮三份制成 ) 或冷冻千燥粉 , 低温贮藏 ,
用前以0 . 05 M P H 7 . 8磷酸缓冲液抽提 。
二 、 方法
本文 1 9台6年 7月 13 日收到
DOI : 10. 13885 /j . i ssn. 0455 -2059. 1985. s1. 012
兰 州 大 学 学 报 9 1 8 5年 1 2月
1
.蛋白质浓度测定 :按 Lo wr y方法〔 3 〕或用紫外分光法在波长 2 80 nm处测光吸收 。
2
.酶活力测定 :
( 1 )测定水解蛋户质活力 :以酪蛋 白为底物 、 测定方法见仁 4〕 ,
( 2 ) 测定水解酞胺 的活力 : 以苯甲酞精氨酞胺 (B A A ) 为 底 物 , 5 m M B A A 溶于
。 . I M p H 7 . 8磷酸缓冲液中 , 加适量酶液 , 总体积为 1 毫升 , 25 ℃保温 3 小时 , 加 水。 . 5毫
升 , 用布三酮法测定释放的氨 。
( 3 ) 测定水解酷的活力 : 以苯甲酞精氨酸 乙酷 ( B A E E ) 为底物 , 测定方法见〔 4 〕
3
. 分子量测定 :
( 1 ) 凝胶过滤按 A n d r e w s c s 〕方法 。
( 2 ) 5
.
D
。
S聚丙烯酞胺垂直板电泳法〔幻
实 验 .结 果
一 、 六月雪蛋 白酶的提取 , 纯化及纯度鉴定
采六月雪乳汁 50 毫升 , 用 O . 05 M P H 7 . 8磷酸缓冲液稀释一倍后 冷 冻 , 化冻 后 加 热 至
60 ℃ 5 分钟迅速冷却 , 离心去沉淀 , 上清液用聚 乙二醇浓缩吸水一倍后 , ` 取 1 毫升上葡聚糖
凝胶柱 , (葡聚糖凝胶G一1 5。 , 柱小2 . 4 X 8 4厘米 ) 洗脱液 为。 . 01 M磷 酸 缓冲液 , p H 7 . 8内
含 0 . 1 5M N a C I , 用微量恒流泵打入 , 流速 40 毫升 /小时 , 洗脱液用紫外分光光度计测 2 80n m
光吸收值 , 可得三个吸收峰。
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}
. , 一
_
.
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.
_
. . -一一一 _ 管数2 0 4 0 , 6 0
图 1 六 月雪蛋白水介酶在 S eP l l a d e x G一 1 50 柱上的分 离图谱
经活力测定峰 I 、 l 有水解酪蛋白活力 , 峰 2 为杂蛋白 , 分别取有活力的峰 液 合 并 浓
缩 , 做聚丙烯酞胺凝胶电泳 , 无论在酸性 P H 4 。 5或碱性 P H S . 3缓冲液中电泳结果均 为 一 条
区带 。 说明已提得纯品 。
如用六月雪原乳汁 , 做聚丙烯酞胺电泳时有多条蛋 白质区带 , 但其主要成份为一对极为
靠近的蛋白区带 , 有酶活性 , 其余为数条分子量较小的蛋白区带 , 含量甚微 , 说明原乳汁中
蛋白成份简单 , 与动物消化液中之消化酶相同 , 为胞外酶 , 易于提纯 。
二 、 六月雪蛋白水解酶的分子量洲定
生物学辑刊 六月雪蛋白水解酶的研究
用凝胶过滤及 S D S 聚丙烯酞胺凝胶电泳法测定分子量 。 用葡聚糖凝胶G一 15 0装柱 , 柱
拟 . 4 x ; 2。厘米 , 取牛血清蛋白 、 核糖核酸酶 , `人血清白一蛋白 、 卵白蛋白 , 胰蛋白酶为标 准
蛋白质样品 , 分子量分别为 6 7 , 0 0 0 , 1 3 , 7 0 0 ; 6 8 , 40 0 ; 4 5 , 0 0 0 , 2 4 , 0 0 0 ; 洗 脱 液 为 o . o 1M
。 , , , 。 , ~ 加 、 一 、 。 . , 、 , 、 , 。 , , 、 , 。 ’ ~ , 二 -L , , , , , 冲 一 , , , `、 r , , , V e 一 V O 、
P H 7
`
8磷酸缓冲液 , 含 O . 15 M N a C I , 以每一样 品 的 V e/ V O值 或 K d值 . K d 二二共不匕 .- - - 甲 · 一 , ~ 一… 叭 , 同 - · 一尸二 ` ’ 协 一 ` , 一 ~ , ’ H H ” 切 ’ “ ` ’ 一 ~ ~ “ ` ~ 贬 “ 一 V I J对分子量对数作图 , 从直线中求得六月雪蛋白水解酶各洗脱峰的分子量 ( V 。为外水 体积 ,
iV 为内水体积 , v e为各种蛋白质的洗脱体积 , K d是指溶质在凝胶相和流动相之间的分配比
例 ) 。 测得第一峰 (成份 I ) 的分子量为 12 6 , 。 o。 , 第二峰 (成份 l 的分子 量 为 5 , 5 0 0。 , 第
三峰 (成份 l ) 的分子量为 7 , 8 0 , 其中第一和第三峰具有酶的活性 , 第一峰活性 最 强 , 下
列实验以成份 I 代表六月雪蛋白酶纯酶 。 ’ 、
表一 称 , 六月曾蛋白酶的几个成分分子最二 止少三二三川止扭一二毕- 一州一一毕井一月舟早鹦止一一哗一二` 干` `燮二` 共` 一竺竺一一卜一一里里生一一一 一 2 . 90 1 0 . 9 3 } 7 , 80 0
` o 8 M
图 2 六 月雪蛋 白酶 的分子量测 定
过 s e p h a d e x G一 1 50 柱 , 柱小2 . ` x 1 2 0厘 米。 标 准蛋白质 : 1 核格核酸游 : 2 肤 蛋白 阵 , 3 卵清蛋 白布 4 牛
血清白蛋白 ; 5 人血清白蛋白 ; 6 人丙 种球蛋 白 ; 六 月雪蛋白酶 成份 I , 洗耽液 为 含 O。 15 M N a cl 及 .0 0 2% N a N .
的 o 。 0 1M P H 7 。 8碑酸缓冲液 。
三 、 各种 因素对酶活力的影响
(一 ) 对底物酪蛋 白 , B A A , B A E E 的活 力测 定
对三种底物分别试验六月雪蛋自酶水解肤键 、 酸胺键 、 醋键的能力 。
兰 州 大 学 学 报 19 8 5年 12月
表二 , , 酶 对 不 同 底 物 的 水 解 活 力
酪 蛋 白 (` ) } B A A ( 2) ( K 。 值M ) 1 B A E E ( 3 ) o
.
D值
7
。
5 0
.
0 03 1
.
0
.
0 D8 6
( 1 ) 以酪蛋 白为底物 , 浓度为 1 % 溶于 0 . 05 M P H 7 . 8磷酸缓冲液中 , 底物 溶液 1 毫
升 , 加酶的磷酸缓冲液 1 毫升 (内含酶量 20 微克 ) , 40 ℃反 应 15 分钟 , 加 1 毫 升 15 % T C A
停止反应 。 滤液测波长为 2 8 0n m 时的吸收值 。
( 1 ) B A A 浓度为 10 n m在 0 . I M p H 7 . 8磷酸缓冲液中 , 加酶液 0 . 1毫 升总体 积为。 . 5毫
升 , 25 ℃保温 3 小时 , 加。 . 5毫升水 , 用布三酮法测定所释放的氨。
( 3 ) 以 B A E E为底物 , 浓度为 5 x 1 0一 略 M溶 于 30 % 甲醇 一 。 . 05 M p H 7 . S T r is 缓 冲
液 , 取底物 2 . 9毫升 , 酶液 。 . 1毫升 , 40 ℃反应 3 分钟 , 在波长 2 5“ n m铡光吸收值 。
(二 ) 酶衬几种不同蛋白底物的水解活 力 见表三
裹三 t . 酶对几种不同蛋白底物的水解活力二 …二 ’ }二 : o n m…· …冷念洽一令一一 ~黯一一令一星墨村三肚士卫犯七崖二说 明此酶对酪蛋 白的水介活力最高 。
(三 ) 酶 浓度对反应速度的影响
以原乳汁中未经处理的粗酶制剂和纯酶 , 作酶浓度对反应速度的影响见图 3 , 以酪蛋白
为底物 , 从图 3 可见用纯酶时 , 酶浓度和反应速度呈直线关系 , 如用粗酶则不呈直线关系 (图
中未画出 ) 。
表四 移 . 酶浓度对酶活的影响
原乳汁 ( 粗酶制剂 ) 23 毫克 /毫升 } 纯 酶 13 . 6 5毫克 /毫升
稀
酶
释 倍
浓 度
数
微克 /毫升
200 0 1 00 0 50 0 2 50 2 00 1 00 10 00 5 00 25 0 12 5 1 00 7 5
10 2 0 4 0 80 1 00 20 0 13
。
6 5 27
.
3 5 4
。
6 10 9 1 36 18 2
O
、
D值 68 0 n m 0 。 2 0 . 3 8 0 . 6T 0 。 9 8 1 。 1 0 1。 4 0 0。 1 2 0 。 23 0 。 4 5 0 . 9 2 1 . 14 1 . 5 2
生物学辑刊 六月雪蛋 白水解酶的研究
叫04倪
丽~ , . 1匆 钧 0 1幼 .即 酶浓度做叭开的.的加
图 3 酶 浓度对反应速度的影响
(四 ) 温度时酶活力 的影响
在不同温度下 , 酶在磷酸缓冲液 p H 7 . 8中 , 以酪蛋白为底物 , 作用 15 分 钟 , 分 别 测 定
酶活力 , 结果见下图 , 此酶对热较稳定 , 在上述作用条件下 , 酶的最适温度为 65 ℃ 。
裹五 ” 温 度 对 酶 活 力 的 影 响
2 0 3 0 4 O 50 60 6 5 7 0 8 0
C D值 6 8 0 n m
。 · ,。
1
。· 14 …。 · 19 …。一 …。一 …。一` …。一 …。一 …。一。 5
图 4 温度对酶活 力 的影响 , 底物 为酪蛋 白 , 作用时间 15 分钟 ,
酶 浓度 112 微克 /毫升
(五 ) p H对醉活 力的影响 ` - 一 ` ’ 份
酶在不同 P H值溶液中 , 以酪蛋白为底物 , . 45 ℃作用 15 分钟 , 分别测定酶活力 如 下图 :
兰 州 一 大 学 学 报 1 9 8 5年1 2月
八份刃
盯两叻
肠似川
苏 4 , 下 弓 , 协 仙
图 s p H甘酶活 力的影响 , 底物 为酪蛋 白 , 晦浓度为 1 2微克 /毫升
最适 p H 为 8 . 0一 9 . 0
表六 酶 活 力 的 影 响. 称 P H 对
4 …5 6 1 了 …8 { 9 …1。 …, ,
O D值 6 80 n m
(六 ) 酶的稳 定性
以原乳汁冰箱放置 ( 4 ℃ ) 一年 , 每两月测试活力其活力基本不变 , 说明此酶 相 当 稳
定 , 耐热性高 , 有利于提纯工作和性质试验的进行。
表七 酶 的 稳 定 性
放 置 月 数 ( 4 ℃ ) 2 1 4 6 ! 8 1 0 1 1 2
光 密 度 数 6 6 On m …。、一 1。一 0 . 4 6 0 . 4 5 0 . 4 3 0 。 44 0 。 4 2
姗 o2
4 . 「 - , 万- . . 铸 . 放置月教
图 6 ` 降 的 稳 定 性
生物学辑刊 六月雪蛋白水解酶的研究
( 七 ) 酶的激活和抑制
酶和抑制剂共同保温 , 加入底物溶液保温 30 分钟后停止反应测酶活力 。 抑制 情 一况如 下
表
表八 酶 的 滋 活 和 抑 制
最 终 浓 度 M
E D T A
、
1 x 10一 103
D F P 1 X 10一 10 1
P C M B 1 x 10一 2 2 , 7 (可被半胧氨酸介除抑制 )
半耽氨酸 5 X 10一 } 10。
` C H , C O N H :
}
Z x ,” 一 ,
}
{
` x `。一
1
】 , x l。一 !` ` 些竺 _ _ _ _ _ , _ 尸 _ L 二_ _ 。 _ _止至{) .……_ _ _ _ 二l _ . _ _ , , , _ _ 』 , _ 三吧_ _
二
_ `
_ _
.
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_
_
E D T A及 D F P对酶活力无抑制 , 说明此酶活性不需金属离 子 亦 非 丝 氨 酸 蛋 白酶 。
P C M B有明显抑制作用 , 可加半眯氨酸解除抑制。 1 C H Z C O N H : , I , 有抑制作 用 , 说 明
此酶很可能为一 琉基酶 。
讨 论
某些植物乳汁管所分泌的乳汁 , 含有菇烯类物质 ( 橡胶类物质 ) 、 蛋白质 、 碳水化合物
及挥发油等 , 其中有些是代谢的最终产物 , 有些是活性物质, 酶和激素等 , 六月雪乳汁中经
分析含橡胶类物质 5 % , 蛋自质12 %及微量糖类物质 , . 汁液有毒性 , 能使皮肤过 敏 起 泡 红
肿 , 误服引起呕吐 、 灼痛 , 具有强烈的蛋白水解酶活性 , 一般在鲜嫩组织中乳汁分泌多 , 衰
老组织中少 , 为什么在乳汁中含有高活性蛋 白酶 , 它的生理功能是什么 , 至今不清楚。
此酶的一个重要特点是稳定 , 采取后放入冰箱 , 数年活力变化甚少 , 放在 室温 , 活力下
降不多 , 便于保存 。 此酶的分子量较高 , 比一般动物蛋白水解高 , 有可能是几个亚基组成的
寡聚酶 , 在实验操作过程中解聚为它的单体成份 。
此酶有强烈的抑菌作用 , 对革蓝氏阳性菌及小白鼠肉瘤细胞 S : 。 。等有明显抑制 和 杀 伤
作用 , 于另篇文章总结报告 。
参 考 资 料
〔 1 〕 W 。 G 。 E 1 115 , F . G 。 L e n n o x , A u s t r a l i a n . J . S e i 。 4 , 1 8 7 1 ( 1 9 4 2 ) 。
7 6 兰 州 _大 学 学 报 · 1 9 8 5年 1 2月
B i
o e
h
e m
。
J
。
3 9
, 46 5 ( 1 9 4 5 )
〔 2 〕 M 。 C a s t a f i e d a , M 。 R 。 B a k a z a r , F 。 F 。 G a v a r o o n ; A n a l e s e s e u e e l a
n a e
l
. e i e n e
.
b i o l ( M e x ) 3
, 6 5 ( 1 9 4 3 )
〔 3 〕 0 . H . L o w r y , A . L . F a r r , N . G . R o s e b r o u g h ; J . B l o l . e h e m . 1 9 3 -
2 6 5 ( 1 9 5 1 )
〔 4 〕 屈贤铭 , 戚正武 ; 生物化学与生物物理学报 . 3 , 2 29 ( 1 9 6 3 )
〔 5 〕 P . A n d r e w s ; M e t h o d s o f B i o e h e m i e a l A n a l y s i s 1 8 , 1 ( 1 9 7 0 )
〔 6 〕 朱广廉 、 杨中汉 , 植物生理学通讯 . 2 , 4 3 ( 1 9 8 2 )
. 目目
S t u d y o n P r o t e o ly t i e E n z y m e o f E u P h o r b i a
M a r g i n a l a P u r s h
1
.
I s o l a t i o n a n d P r o p e r t i e s o f E u p b o r b i a M
a r g i n a l a
P r o t e i n a s e E n z y m e
L u Y 艺n g h u a N e g i n h“ a
A p r o t e o l v t i e e n z y m e w a s i s o l a t e d f r o m t h e l a t e x o f p l a n t M a r g i n a l a
s t e m
.
T h e e l
e a r s o l u t i o n o f t h
e l a t e x w a s a p p l i e d t o a e o l
u m n o f S e p h
a d e x
G一 1 5 0 , a n d t w o a e t i v e e o m p o n e n t s w e r e o b t a i n e d b y g e l f i l t r a t i o n . T h e
p u r i f i e d e n z y m e w a s i d e n t i f i e d t
o b e h o m o g e n e u s b y p o l v a e r y l a m i d e g e l e l e -
e t r o p h o r e s i s
.
T h e i r m o l e e u l a r w e i g h t w a s e a l e u l a t e d t o b e 1 2 6 0 0 0 o n d 7 8 0 0
b y g
e
l f i l t
r a t i o n
.
T h e e n z v m e a e t s o p t i m a l l y o n e a s e i n a t P H S 一 9 a n d 6 5℃ a n d a l s o
o 。 b e n z 。 y l一 l一 a r g i n i。 。 m sd 。 (色A A ) a n d b e n z 。 y l一 a r g i。 i。 。 t 、 y l 。 s t e r
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e o p t i m u m p H b
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.
D F P 1 0
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M a n d E D T A 1 0
一 s M h a v e n o s i g n i f i e a n t e f f e e t o n t il e e n z y m e
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l o r o m e r e u r i一 b e n z o t e ) 1 0 “ S M a n d H g e l : a n d t h e f o r m e r i n h i b i t i o n e a n b e
e l i m i n a t e d b y e y s t e i n e a e i d
.
5
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e n z y m e
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