全 文 ：＊基金项目:国家自然科学基金项目(3987099);粤港合作项目(GHP022/06)
半边旗 5F注射液中有效成分的含量测定方法＊
吕应年1 ,陈 功 2 ,吴科锋 1 ,梁念慈1
(1广东医学院 广东天然药物研究与开发重点实验室 ,湛江 524023;
2香港中文大学 威尔士亲王医院外科系 ,香港 沙田 999077)
[摘要 ] 目的:建立半边旗 5F(化学名为 11α-羟基-15-氧 -16-烯-对映贝壳杉烷 -19-酸)注射液中有效成分
的含量测定方法 。方法:采用高效液相色谱法测定主要成分 5F的含量 ,色谱柱为 HypersilC18(250mm×4.6
mm, 5μm),流动相为甲醇-水-冰醋酸(55∶45∶0.045),检测波长为 254nm,流速为 1.0mL·min-1 ,柱温为 35℃。
结果:高效液相色谱法测定 5F的含量在 30 ～ 240mg·L-1范围内线性关系良好(r=0.999 8),平均加样回收率为
99.8%。结论:本实验所建立的分析方法灵敏可靠 ,可作为半边旗 5F注射液中有效成分的定量分析方法。
[关键词 ] 半边旗;5F;注射液;定量分析
[中图分类号 ] R927.2;R979.1 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 1003-3734(2008)23-2048-03
Determinationof5FinPterissemipinnataLinjectionbyHPLC
L Ying-nian1 , CHENGong2 , WUKe-feng1 , LIANGNian-ci1
(1 GuangdongKeyLabforResearchandDevelopmentofNaturalDrugs, GuangdongMedicalColege,
Zhanjiang524023, China;2 DepartmentofSurgery, PrinceofWalesHospital, TheChinese
UniversityofHongkong, HongkongShatin999077 , China)
[ Abstract] Objective:Toestablishthequantitativeanalysisof5F(11α-Hydroxy-15-oxo-ent-kaur-16-en-19-
oic-acid)inPterissemipinnataL(PsL)injection.Methods:Thecontentof5FinPsLinjectionwasdeterminedby
HPLC.ThecolumnwasHypersilC18(250mm×4.6mm, 5μm), themobilephasewasthemixtureofmethane-wa-
ter-glacialaceticacid(55∶45∶0.045)withaflowrateof1.0mL·min-1 , thedetectivewavelengthwas254nm, and
thecolumntemperaturewasmaintainedat35℃.Results:Thelinearityfor5Fwasobtainedovertherangeof30 ～
240mg·L-1(r=0.999 8), theaveragerecoveryof5Fwas99.8%.Conclusion:Thisconvenient, sensitiveandre-
liablemethodcanbeusedasquantitativelanalysisof5FinPsLinjection.
[ Keywords] PterissemipinnataL;5F;injection;quantitiveanalysis
半边旗(PterissemipinnataL,缩写为 PsL)为凤
尾属蕨类植物 ,收载于 《中华药物大词典 》,广泛分
布于我国南方各省 ,民间常用于治疗蛇伤 、外伤出
血 、抗菌痢 、肠炎 、肝炎等 [ 1] 。本课题组在筛选抗肿
瘤植物药时发现 ,半边旗的乙醇及水提取物显示良
好的体内外抗肿瘤活性 [ 2-3] ,进一步分离纯化得到
一种贝壳杉烷型二萜化合物 ,命名为 11α-羟基 -15-
氧 -16-烯 -对映贝壳杉烷 -19-酸 (英文名称 11α-hy-
droxy-15-oxo-ent-kaur-16-en-19-oic-acid, 简称 5F),
化学结构见图 1。该物质具有刚性四环二萜结构 ,
其抗肿瘤活性可能与分子中 α、β -不饱和环戊酮结
构有关 。由于该物质疏水性强 ,难溶于水 ,影响了药
效发挥 ,为此本课题组进行制剂研究 ,增加药物的溶
解度 ,制成主要成分是 5F的半边旗注射液单方制
剂。药理学研究表明半边旗 5F注射液对 SPCA-1
和 K562瘤株有显著的体外抗肿瘤活性 ,对荷瘤小
鼠肝癌 HepA和 S180在体内也有抗肿瘤活性[ 4] ,有潜
力开发成临床用新药 。目前关于半边旗 5F注射液
的质量研究作者未见报道。本试验按照中药二类新
药的申报要求对半边旗 5F注射液的质量进行研究 ,
采用 HPLC法建立半边旗 5F注射液中主要成分的
含量测定方法 ,为该制剂的开发和应用提供依据 。
图 1 5F的化学结构
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ChineseJournalofNewDrugs2008, Vol.17No.23 中国新药杂志 2008年第 17卷第 23期
仪器与试药
LC1200型高效液相色谱仪(包括四元泵 、DAD
检测器 、在线脱气机 、LC1200中文工作站 ,美国安捷
伦科技有限公司);AE204型十万分之一分析天平
(瑞士梅特勒 -托利多科技有限公司);MILLI-Q超纯
水制备仪(美国密理博科技公司);四用紫外分析仪
(上海顾村仪器厂);GF254预制薄层硅胶板(青岛
海洋化工厂分厂)。
半边旗 5F对照品(本室分离纯化 ,经中国科学
院广州化学研究所结构鉴定 ,按峰面积归一化法检
测纯度为 99.6%);半边旗 5F注射液 (4mL∶8mg,
自制 ,批号分别为 20070502, 20070503, 20070604);
甲醇为色谱纯 ,冰醋酸等其他化学试剂均为分析纯 。
方法与结果
1 溶液制备
1.1 对照品储备液 精密称取 5F对照品 37.5
mg,加适量甲醇溶解 ,转入 25mL量瓶中 ,加甲醇定
容至刻度 ,即为 5F对照品储备液。
1.2 供试品溶液 精密量取半边旗注射液 2.0
mL,放入 25mL量瓶中 ,加甲醇定容至刻度 ,即得到
含量 160mg·L-1的供试品溶液 。
1.3 阴性对照品溶液 按注射液处方不加 5F成
分 ,取空白溶剂 2.0mL,放入 25mL量瓶中 ,加甲醇
定容至刻度即得阴性对照品溶液 。
色谱条件及系统适应性
色谱条件:HypersilC18(250mm×4.6mm, 5μm)
色谱柱;流动相为甲醇-水-冰醋酸(55∶45∶0.045);检
测波长为 254 nm;流速为 1.0 mL·min-1;柱温为
35℃。在上述色谱条件下 ,取对照品 、供试品和阴
性对照品溶液各 20μL,分别进样 HPLC分析 ,记录
色谱图如图 2。
图 2 半边旗 5F注射液高效液相色谱图
试验结果表明 ,供试品溶液有一主要色谱峰 ,保
留时间 7.5min,和对照品色谱图一致 ,阴性对照品
无显著色谱峰 ,表明空白溶剂不干扰供试品的检测;
色谱柱理论塔板数按 5F计 >5 000,色谱峰分离度
高 ,系统适应性良好。
线性关系考察
精密量取对照品储备液 0.2 , 0.4, 0.8, 1.0,
1.2, 1.6mL,分别放入 10mL量瓶中 ,加甲醇定容到
刻度 ,摇匀即得系列浓度的对照品溶液。分别取配
制好的各浓度对照品溶液 20μL,进样高效液相色
谱 ,记录峰面积积分值。分别以对照品含量 (mg·
L-1)为横坐标 ,峰面积积分值为纵坐标 ,绘制标准
曲线 , 得线性方程为 Y=11.557X-35.272, r=
0.999 8,表明在 30 ～ 240mg·L-1范围内半边旗 5F
线性关系良好。
精密度试验
精密吸取供试品溶液 ,按照上述色谱条件连续
进样 6次 ,每次进样量 20μL,以峰面积计算相对标
准偏差 RSD。计算得 RSD为 1.47%,表明试验方法
精密度良好。
重复性试验
取同批号供试品 6份 ,按供试品溶液配制方法
制样 ,每份进样 20μL,记录峰面积 ,测定 5F含量 ,
计算得供试品 5F含量的 RSD为 1.67%,表明本方
法的重复性良好。
稳定性试验
取相同供试样品溶液 ,分别在 0, 1, 2, 4, 29h进
样 HPLC测定 5F的峰面积 ,计算峰面积相对标准偏
差 RSD。计算得 RSD为 0.92%,表明样品溶液在
29h内稳定。
加样回收率试验
取相同批号供试品溶液 9份 ,按处方量分别加
入 100%, 80%和 120%的对照品各 3份 ,按供试品
(下转第 2058页)
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ChineseJournalofNewDrugs2008, Vol.17No.23 中国新药杂志 2008年第 17卷第 23期
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编辑:况扶华 /接受日期:2008-03-18
(上接第 2049页)
溶液制备方法制样 ,每份进样 20μL,测定 5F回收
率 ,结果见表 1。
表 1 5F的加样回收率试验
样品量
/μg
加样量
/μg
测得量
/μg
回收率
/%
RSD
/%
平均回
收率 /%
86.85 86.30 168.74 94.8 0.92
86.85 86.30 169.69 95.9
86.85 86.30 170.23 96.6
86.85 69.65 157.59 101.5 1.65
86.85 69.65 157.39 101.2 99.8
86.85 69.65 159.53 104.3
86.85 102.95 193.27 103.3 1.69
86.85 102.95 190.45 100.6
86.85 102.95 190.00 100.1
样品含量测定
取 3个批号的注射液样品 ,按照供试品溶液配制
方法制样。精密吸取对照品溶液和各供试品溶液 20
μL,进样高效液相色谱 ,按上述色谱条件分析 。分别
测得 3批注射液样品中 5F的含量 ,测定结果见表 2。
表 2 注射液中 5F装量测定 n=3
批号 5F(mg/支) RSD/%
20070502 8.36 1.98
20070503 8.12 1.02
20070604 8.48 1.65
讨 论
本品为无色澄明水溶性注射液 ,在 HPLC测定
前无需萃取分离 ,可直接加甲醇或乙醇稀释后进样。
经比较发现 ,乙醇稀释样品的色谱图有明显负峰 ,峰
形差 ,甲醇稀释后的色谱图则无显著负峰 ,因此选用
甲醇作为稀释溶剂 。
在甲醇-水流动相体系中添加少量冰醋酸 ,所得
色谱图的峰形明显改善 ,色谱峰对称性好 ,无拖尾 ,
这可能和 5F化学结构本身具有羧基有关 [ 5] 。
本实验所建立的方法灵敏可靠 ,重现性好 ,可做
为半边旗 5F注射液中有效成分的含量测定方法。
[作者简介 ] 吕应年(1975-), 男 , 助理研究员 , 硕士。联
系电话:13692338157, E-mail:lyn7591@hotmail.com。
[通讯作者 ] 梁念慈(1940-), 男 ,教授 ,博士生导师 , 主要
从事天然产物的生化药理研究。联系电话:(0759)2388501,
E-mail:ncliang@gdmc.edu.cn。
[ 参 考 文 献 ]
[ 1] 秦仁昌 ,邢公侠.中国植物志 [ M] .第 3卷第 1分册.北京:科
学出版社 , 1990:46-47.
[ 2] 张晓 ,李金华 ,梁念慈 ,等.半边旗中二萜类化合物的植化及抗
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[ 3] 李金华 ,梁念慈 ,莫丽儿 ,等.半边旗 5种成分体外细胞毒活性
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[ 4] 戴滨 ,崔燎 ,吴铁 ,等.半边旗有效成分 5F注射液体内外抗肿
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[ 5] 吕应年 ,李彩虹 ,梁念慈 ,等.常压硅胶柱层析法分离制备高纯
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编辑:周卓 /接受日期:2008-07-16
—2058—
ChineseJournalofNewDrugs2008, Vol.17No.23 中国新药杂志 2008年第 17卷第 23期