全 文 ：书收稿日期:2015-09-07
基金项目:国家基础科学人才培养基金资助项目(J1103606);国家自然科学基金面上项目(81173544)
作者简介:王鹏旭(1993-)，男(汉族)，辽宁庄河人，本科生，E-mail 1607837917 @ qq． com;* 通讯作者:
袁丹(1963-)，女(汉族)，辽宁丹东人，教授，博士，主要从事传统药物分析技术和体内药代动力学的研究，Tel． 024-
23986502，E-mail yuandan_kampo@ 163． com。
文章编号:1006-2858(2016)09-0729-06 DOI:10． 14066 / j． cnki． cn21-1349 /r． 2016． 09． 009
去氢毛钩藤碱在大鼠体外肠道菌群中
代谢产物的鉴定
王鹏旭，周春卫，齐 文，赵丽珠，申慧玲，袁 丹*
(沈阳药科大学 中药学院，辽宁 沈阳 110016)
摘要:目的 研究去氢毛钩藤碱在大鼠体外肠道菌群中的代谢途径，阐明肠道菌群对去氢毛钩藤碱
吸收和代谢的影响。方法 采用 UPLC /Q-TOF MS技术，鉴定并推测了去氢毛钩藤碱在大鼠体外肠
道菌群培养液中的代谢产物。采用 HSS C18色谱柱(100 mm × 2. 1 mm，1. 8 μm)，以乙腈(A)-体积
分数 0. 2%甲酸水溶液(B)为流动相梯度洗脱，流速为 0. 5 mL·min －1，采用 ESI 离子源，正离子模
式下检测。结果 通过色谱保留时间及质谱碎片等信息，在大鼠肠道菌群中鉴定了原型化合物去氢
毛钩藤碱，以及经还原、氮氧化和羟基化反应后得到的 3 个微量代谢产物。结论 建立了采用 UP-
LC/Q-TOF MS技术鉴定去氢毛钩藤碱在大鼠体外肠道菌群中代谢产物的方法，为吲哚类生物碱在
体内吸收和代谢机制的研究提供试验依据。
关键词:钩藤;去氢毛钩藤碱;大鼠;肠道菌群;代谢产物鉴定;超高效液相色谱串联四极杆飞行
时间质谱
中图分类号:Ｒ 28;Ｒ 917 文献标志码:A
中药制剂多以经口给药为主，药效成分到达
体内组织器官需要经过吸收、分布、代谢和排泄等
过程，虽然每一环节都对药物活性有重要影响，但
胃肠道是药物成分吸收和代谢的前提条件。肠道
菌群对药物具有一定的代谢能力，与体内最重要的
代谢器官肝脏相比，肠道菌群在药物代谢类型和功
能等方面有其独特之处，多以还原和水解为主［1］。
去氢毛钩藤碱(hirsuteine)是中药钩藤［Un-
caria rhynchophylla(Miq．)Miq． ex Havil．］中主要
的生物碱类成分之一［2 － 3］，具有中枢神经抑制、抗
惊厥、扩张血管和降血压等药理作用［4 － 10］。目前
关于去氢毛钩藤碱代谢的研究较少。Nakazawa
等在灌胃给予大鼠去氢毛钩藤碱单体后，在尿中
检测到代谢产物 11-羟基去氢毛钩藤碱、11-羟基
去氢毛钩藤碱-11-O-葡萄糖醛酸苷和去氢毛钩藤
碱，在胆汁中检测到代谢产物 11-羟基去氢毛钩
藤碱-11-O-葡萄糖醛酸苷，大鼠肝微粒体酶催化
试验表明 CYP2C酶影响去氢毛钩藤碱11 位羟基
化代谢的过程［11］。Banba 等在大鼠灌胃给予去
氢毛钩藤碱单体后，在粪便中检测到11-羟基去氢
毛钩藤碱和去氢毛钩藤碱［12］。Gai等通过对抑肝
散代谢的研究，在尿中检测到代谢产物 11-羟基
去氢毛钩藤碱［13］。然而目前关于去氢毛钩藤碱
在肠道菌群中代谢方面的研究尚未见文献报道。
本文作者对去氢毛钩藤碱在大鼠体外肠道菌群中
的代谢产物进行研究，探讨去氢毛钩藤碱在肠道菌
群中的代谢反应，为钩藤吲哚类生物碱的体内代谢
规律及作用机制提供数据参考。
1 仪器与材料
Waters ACQUITY UPLCTM系统、XevoTM G2 Q-
TOF系统、MasslynxTM NT 4. 1 工作站(美国Waters
公司)，AG-245 电子分析天平(瑞士 Mettler-Tole-
do公司)，H-26F 离心机(日本 Kokusan 公司)，
CT10 离心机(日本 Hitachi Koki有限公司)，TME-
21 液体快速混合器(日本 Eddy 公司)，净化工作
台(沈阳利港净化设备有限公司)，高压灭菌锅
(上海申安仪表厂)，ZQLY-300F 振荡培养箱(上
海知楚仪器有限公司)。
去氢毛钩藤碱和去氢毛钩藤碱氮氧化物为本
第 33 卷 第 9 期
2 0 1 6 年 9 月
沈 阳 药 科 大 学 学 报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol. 33 No. 9
Sep． 2016 p. 729
实验室自制，化合物的结构经 UV、IＲ、MS、
1H-NMＲ和 13C-NMＲ鉴定［14 － 16］，经 HPLC-UV 分
析，去氢毛钩藤碱质量分数大于 95%。乙腈、甲
醇及甲酸(色谱纯，美国 Fisher 公司)，超纯水(法
国 Millipore公司)。
SD 大 鼠，雄 性，共 4 只，体 质 量 为
(250 ± 30)g，由沈阳药科大学实验动物中心提
供，动物使用许可证号为 SYXK(辽)2014-0004。
2 方法
2. 1 大鼠肠道菌群培养液的制备
取大鼠粪便 1 g，转移至 20 mL 三角瓶(含有
已灭菌的厌氧培养基)中，将粪便与培养基混合
形成均匀混悬液，即得大鼠肠道菌群培养液。
2. 2 去氢毛钩藤碱体外肠道菌群样品的制备
取去氢毛钩藤碱 1. 0 mg，精密称定，溶于
150 μL 0. 1 mol·L －1盐酸溶液中;移取大鼠肠道菌
群培养液 1 mL置 2 mL EP管中，向培养液中加入
上述去氢毛钩藤碱溶液。同时移取大鼠肠道菌群
培养液 1 mL 置 2 mL EP 管中，加入0. 1 mol·L －1
盐酸溶液 150 μL，与去氢毛钩藤碱肠道菌群培养
液形成空白对照。涡旋混匀，放入厌氧培养袋中，
同时加入耗氧产气袋，将培养袋立即密封，置于培
养箱中，于 37 ℃条件下培养 24 h。
培养结束后，向培养液中加入 1 mL甲醇终止
反应，样品涡旋 30 s，于 10 000 r·min －1离心
10 min，上清液转移到另一个 EP管中，于室温下氮
气 吹 干。残 留 物 加 甲 醇 2 mL 复 溶，于
13 000 r·min －1离心 10 min，精密吸取上清液样品
2 μL，进行 UPLC /Q-TOF MS分析。
2. 3 UPLC /Q-TOF MS分析条件
采用Waters ACQUITY UPLCTM系统。色谱柱为
HSS C18柱(100 mm × 2. 1 mm，1. 8 μm);柱温为 35
℃;流动相为体积分数 0. 2%甲酸水溶液(A)-乙腈
(B)，梯度洗脱;流速为 0. 5 mL·min －1;自动进样，样
品室温度为 10 ℃;梯度程序:0 ～ 1. 5 min 5% ～
18% B，1. 5 ～ 2. 7 min 18% ～ 19% B，2. 7 ～ 3. 0
min 19% ～ 27% B，3. 0 ～ 6. 0 min 27% ～ 34% B，
6. 0 ～ 10. 0 min 34% ～ 60% B，10. 0 ～ 11. 0 min
60% ～ 99% B，11. 0 ～ 11. 1 min 99% ～ 5% B，
11. 1 ～ 13. 0 min 5% B。空白样品和代谢样品进
样量均为 2 μL。
质谱鉴定采用 XevoTM G2 Q-TOF 系统。离子
源为 ESI源，正离子模式检测;脱溶剂气流速为
800 L·h －1;脱溶剂气温度为 450 ℃;锥孔气流速
为 50 L·h －1;源温度为 130 ℃;毛细管电压为
3 kV;锥孔电压为 35 V。校准液采用亮氨酸脑啡
肽［M + H］+ (m/z 556. 277 1)进行实时质量校
准，流速为 5 μL·min －1。为了获得物质母离子及
碎片离子信息，采用 MSE 模式进行样品测定，参
数如下:1 通道的扫描范围 m/z 50 ～ 1 200，扫描
时间 1. 0 s，扫描延迟 20 ms，碰撞能量 6 eV;2 通
道的扫描范围 m/z 50 ～ 1 200，扫描时间 1. 0 s，扫
描延迟 20 ms，碰撞能量 20 ～ 30 eV。
3 结果
3. 1 去氢毛钩藤碱在大鼠肠道菌群培养液中代
谢产物的鉴别
采用 UPLC /Q-TOF MS 技术，对去氢毛钩藤
碱在大鼠肠道菌群培养液中代谢产物进行了鉴
别。通过 MasslynxTM NT 4. 1 软件及 Metabolynx
XS程序进行处理，结合标准品共色谱及质谱分析
方法，参考已报道的吲哚类生物碱质谱裂解规
律［17 － 18］，在大鼠肠道菌群培养液中鉴定了去氢毛
钩藤碱原型及 3 个代谢产物。空白肠道菌群培养
液和去氢毛钩藤碱肠道菌群培养液 UPLC /Q-TOF
MS 色谱图见图 1。去氢毛钩藤碱及其代谢
产物的色谱保留时间及质谱等信息见图2。肠道
Fig. 1 UPLC/Q-TOF MS chromatograms of blank(A)and hirsuteine(B)in culture fluid of rat intestinal flora in vitro
图 1 大鼠空白肠道菌群培养液(A)和去氢毛钩藤碱肠道菌群培养液(B)UPLC/Q-TOF MS色谱图
037 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 33 卷
A—Hirsuteine(M0);B—Hydroxylated metabolite(M1) ;C—Ｒeductive metabolite(M2) ;D—N-oxidated metabolite(M3)
Fig. 2 MS2 spectra of hirsuteine and its metabolites in rat intestinal flora in vitro
图 2 大鼠体外肠道菌群中去氢毛钩藤碱及其代谢产物的二级质谱碎片
菌群代谢物的鉴定如下。
3. 1. 1 原型药物去氢毛钩藤碱(M0)
M0(tＲ = 5. 76 min)ESI-MS 图谱中，给出准分
子离子［M + H］+ m/z 367. 202 2，由此确定分子式
为 C22H26N2O3，在高碰撞能量下产生碎片离子 m/
z 144、170、224 和 251，与对照品去氢毛钩藤碱的
保留行为和碎片信息相同，确定 M0 为去氢毛钩
藤碱(hirsuteine)。
3. 1. 2 羟基化代谢产物(M1)
M1(tＲ = 4. 17 min)ESI-MS 图谱中，给出准分
子离子［M + H］+ m/z 383. 197 1，由此确定分子式
为 C22H26N2O4，与质子化的去氢毛钩藤碱相比增
加了 16 u(O)，推测其为羟基化代谢产物。MS /
MS图谱给出的主要碎片离子 m/z 160(144→
160)和 m/z 267(251→267)的存在提示苯环发生
羟基化，m/z 351(335→351)是准分子离子脱去一
137第 9 期 王鹏旭等:去氢毛钩藤碱在大鼠体外肠道菌群中代谢产物的鉴定
分子 CH3OH(32 u)形成的。Nakazawa 和 Gai 等
曾对大鼠尿液中去氢毛钩藤碱代谢产物进行鉴
定［11，13］，结果表明 11 位为去氢毛钩藤碱最可能
的羟基化活性取代位点，因此推测 M1 为 11-羟基
去氢毛钩藤碱(11-hydroxyhirsuteine)。
3. 1. 3 还原代谢产物(M2)
M2(tＲ = 5. 63 min)ESI-MS 图谱中，给出准分
子离子［M + H］+ m/z 369. 217 8，由此确定分子式
为 C22H28N2O3，与质子化的去氢毛钩藤碱相比增
加了 2 u(2H)，推测其为还原代谢产物。MS /MS
图谱给出的主要碎片离子 m/z 144、m/z 170、m/z
226(224→226)和 m/z 253(251→253)，提示还原
位点最可能为 18，19 位之间的双键，因此推测 M2
为 18，19-二氢去氢毛钩藤碱(18，19-dihydrohirsu-
teine)。
3. 1. 4 氮氧化代谢产物(M3)
M3(tＲ = 5. 69 min)ESI-MS 图谱中，给出准分
子离子［M + H］+ m/z 383. 197 1，由此确定分子
式为 C22H26N2O4，与质子化的去氢毛钩藤碱相比
增加了 16 u(O)，通过与对照品去氢毛钩藤碱氮
氧化物的保留行为、精确质量数和碎片信息比较，
确定 M3 为去氢毛钩藤碱氮氧化物(4-hirsuteine-
N-oxide)。
3. 2 去氢毛钩藤碱在大鼠肠道菌群转化中各代
谢产物的相对含量
采用归一化法计算了大鼠肠道菌群培养液中
去氢毛钩藤碱及 3 个代谢产物的相对含量，各代
谢产物的相对含量由其峰面积与培养液基质中所
有代谢物峰面积之和的百分比计算得出，结果见
表 1。大鼠肠道菌群培养液中主要是去氢毛钩藤
碱，占大鼠肠道菌群总代谢物的 98. 8%。11-羟基
去氢毛钩藤碱、18，19-二氢去氢毛钩藤碱和去氢
毛钩藤碱氮氧化物分别占大鼠肠道菌群总代谢物
的 0. 18%、0. 64%和 0. 33%。基于上述鉴定的代
谢产物，推测了去氢毛钩藤碱在大鼠体外肠道菌
群中可能的代谢途径，见图 3。
Table 1 UPLC/Q-TOF MS analysis and relative content of hirsuteine and its metabolites in rat intestinal flora in vitro
表 1 UPLC/Q-TOF MS分析大鼠体外肠道菌群中去氢毛钩藤碱及其代谢产物及各组分的相对含量
No tＲ /min Calculated mass
Observed mass(u)
Fragment ions
Error
(mu)
Metabolite
description
Formula
Ｒelative
contenta /%
M0 5. 76 367. 202 2 367，224，170，144 － 5. 9 Parent C22H26N2O3 98. 8
M1 4. 17 383. 197 1 383，351，267，160 － 7. 5 Hydroxylation C22H26N2O4 0. 18
M2 5. 63 369. 217 8 369，253，170，144 － 6. 3 Ｒeduction C22H28N2O3 0. 64
M3 5. 69 383. 197 1 383，351，184，144 － 6. 4 N-oxidation C22H26N2O4 0. 33
a—The relative content was calculated as:(peak area of each metabolite / total peak area of metabolites)× 100%
Fig． 3 Proposed metabolic pathways of hirsuteine in rat intestinal bacteria system in vitro
图 3 去氢毛钩藤碱在大鼠体外肠道菌群中可能的代谢途径
237 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 33 卷
4 讨论
a. 本文作者采用 UPLC /Q-TOF MS 分离检测
技术，结合 MSE 采集数据模式和 MetabolynxTM
(V4. 1)软件分析，通过一次进样分析，采集准分
子离子和碎片离子信息，实现主要及微量代谢产
物的同时检测。通常代谢产物与母体化合物具有
相同母核，同时结合色谱保留时间、质谱碎片等信
息，可快速鉴别中药成分在肠道菌群中的代谢产
物。
b. 在本研究中，在大鼠体外肠道菌群培养液
中检测到去氢毛钩藤碱的微量代谢反应类型可归
为还原反应、氮氧化反应和羟基化反应，产生的
3 个代谢产物 18，19-二氢去氢毛钩藤碱、去氢毛
钩藤碱氮氧化物和 11-羟基去氢毛钩藤碱分别占
大鼠肠道菌群总代谢产物的 0. 64%、0. 33% 和
0. 18%。基于上述鉴定的代谢产物，推测了去氢
毛钩藤碱在大鼠体外肠道菌群中可能的代谢途径
(图 3)。
c. 本研究结果表明，肠道菌群可参与去氢毛
钩藤碱在体内的代谢反应，但均为微量代谢反应，
因此，肝可能是去氢毛钩藤碱体内代谢的主要器
官，本研究结果为今后进行去氢毛钩藤碱的体内
代谢机制和药动学研究提供了依据。
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Identification of metabolites of hirsuteine in rat
intestinal flora in vitro
WANG Peng-xu，ZHOU Chun-wei，QI Wen，ZHAO Li-zhu，SHEN Hui-ling，YUAN Dan*
(School of Traditional Chinese Meteria Medica，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，
China)
Abstract:Objective To understand the influence of intestinal flora on absorption and metabolism of
hirsuteine by investigating the metabolic pathways of hirsuteine in rat intestinal flora system in vitro ．
Methods An ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spec-
trometry(UPLC /Q-TOF MS)method was developed to identify the metabolites of hirsuteine in rat intestinal
flora in vitro ． The column utilized was a HSS C18 column(100 mm × 2. 1 mm，1. 8 μm)，and the mobile
phase was composed of 0. 2% formic acid in water(solvent A)and acetonitrile(solvent B)in gradient
elution and at 0. 5 mL·min －1 flow rate． A Micromass-Q-Tof Premier mass spectrometer coupled to an
electrospray ionization(ESI)source was operated in positive ion mode． Ｒesults A total of 3 minor
metabolites，as well as parent compound，were identified in rat intestinal flora by comparing the retention
time and characteristic molecular and fragment ions． Conclusions An UPLC /Q-TOF MS method was
developed to characterize the flora metabolites of hirsuteine in vitro，which provided helpful information for
the study of the absorption and metabolic mechanism of the indole alkaloids in vivo ．
Key words:Uncaria;hirsuteine;rat;intestinal flora;metabolites identification;ultra performance liquid chro-
matography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry
437 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 33 卷