全 文 ：中华皮肤科杂志 !# 年 $! 月第 %& 卷第 ’! 期 ()*+ , -./012345 -.6.07./ !#5 834 %&5 93: $!
!论著!
系统性硬化病;;6#是以皮肤纤维化$硬化为特
征的疾病%同时伴有其他系统损害&过度增殖的成纤
维细胞和沉积的胶原导致局部皮肤硬化$ 纤维化是
决定 ;;6 生物学行为的一个重要因素% 其主要原因
可能是增殖<凋亡调控的失衡’’(& 已知半边旗提取物
=> =># 对体外培养的 ;;6 患者皮肤成纤维细胞
;>?#的增殖及其胶原合成具有抑制作用’!(%本实验
进一步研究其对 ;>? 凋亡的影响%探讨诱导细胞凋
亡是否是其抑制作用的机制&
材料和方法
一$实验材料
$: 实验药物)=> 由广东医学院天然药物研究与
开发重点实验室提供& => 是中草药半边旗!#$%&
&’(%)%**+, -.#的乙醇抽提物%分子式为 (!@A!BC#%化
学名为 ’’!<羟基<’=氧<’D<烯<对映贝壳杉烷<’E<
酸%为白色针状结晶& 使用前制成钠盐%并用 -FGF
溶解%经 @:!! 0滤器除菌%# !贮存备用&
!: 主要实验仪器) HGI(J FK;%@ 荧光L光学纤
维镜德国#&
%: 主要实验试剂)-FGF 培养基M*763 公司#*
细胞凋亡检测试剂盒 NO9GH 法#武汉博士德公
司#*A36).P2 %%%#!;*Q01 公司#*碘化丙啶KI%;*Q
01 公司#&
二$实验方法
$: NO9GH 法检测 => 对 ;>? 凋亡的影响 )在
局麻下切取 #例 ;;6 患者的活动性硬化皮损边缘的
皮肤组织%剪去皮下组织$去除表皮层后%将皮肤剪
成 $ 00% 以下碎块% 进行 ;>? 原代培养并传代增
殖%实验选用第 % R D代细胞&将 ;>?接种于底面积
为 =@ 60!的玻璃培养瓶内%每瓶 = # $@=个细胞& 向
生长接近融合的 ;>?中加入不同质量浓度的 =>@$
!@$#@$D@$B@ QL0H#% 以不加药组作为对照% 培养
#B ) 后%离心B@@ R $ @@@ /L0*+#收集细胞%涂片*
按试剂盒所介绍步骤进行实验% 最后% 显微镜下观
察$计数$拍照&
!: 荧光显微镜观察 => 对 ;>? 凋亡的影响 )
A3.6)P2 %%%#! 和 KI 用蒸馏水配制% 使其质量浓度
半边旗提取物 =>对系统性硬化病患者
成纤维细胞凋亡的影响
肖佐环 张培华 吴志华
【摘要】 目的 探讨半边旗提取物 => 抑制系统性硬化病患者皮肤成纤维细胞增殖的机制& 方法
用 NO9GH法和荧光显微镜观察法测定半边旗提取物 => 对成纤维细胞凋亡的影响&结果 半边旗提取物
=> 对患者皮肤成纤维细胞的凋亡具有显著的诱导作用% 该作用在一定范围内随着药物浓度的增高和作
用时间的延长而增强&结论 半边旗提取物 => 可诱导系统性硬化病患者皮肤成纤维细胞的凋亡%从而抑
制其增殖%减少其胶原蛋白的合成&
【关键词】 硬皮病%系统性* 成纤维细胞* 细胞凋亡* 半边旗
!#$%& ’ !(%)*$% +, )’- !#$%& ’()%*%++,, -. ’/ %01 23’3%’&4& ’ 564/ ,47)’78*&%& 4/ 9*%41/%& :4%0
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PY*+ V*7/3741P2P *+ X12*.+2P Z*2) PUP2.0*6 P64./3T./01 #;;6$ 1+T 2). X3PP*74. 0.6)1+*P0 3V *2P *+)*7*2*3+ 3+
2). X/34*V./12*3+ 3V PY*+ V*7/3741P2P: @1%0’<& N). 6S42S/.T ;;6 PY*+ V*7/3741P2P Z./. SP.T 1P 1+ .WX./*0.+214
03T.45 1+T 2). 1X3X23P*P 3V ;;6 PY*+ V*7/3741P2P 7.V3/. 1+T 1V2./ 2). .W2/162 => P2*0S412*3+ Z1P T.2.62.T 7U
NO9GH 1PP1U 1+T V4S3/.P6.+2 0*6/3P63XU: A1&B8%& N). 1X3X23P*P 3V ;;6 PY*+ V*7/3741P2P Z1P *+TS6.T 7U 2).
.W2/162 =>5 1+T 2). 1X3X23P*P Z1P .+)1+6.T 143+Q Z*2) 2). *+6/.1P. 3V 2). 63+6.+2/12*3+ 1+T *+6S712*3+ 2*0. 3V
2)*P 630X3S+T Z*2)*+ T.V*+*2. 4*0*2P: C’/$8B&4’/& N).P. /.PS42P *+T*612. 2)12 2). .W2/162 => 61+ *+TS6. 2).
1X3X23P*P 3V ;;6 PY*+ V*7/3741P2P5 1+T P*Q+*V*61+24U *+)*7*2 2). X/34*V./12*3+ 1+T 63441Q.+ PU+2).P*P *+ 2).P. 6.44P:
+D1; :’)<&, ;64./3T./015 PUP2.0*6[ >*7/3741P2[ JX3X23P*P[ H’$%& &’(%)%**,,
----------
作者单位)=’E 珠海%中山医科大学附属第五医院皮肤科肖
佐环#*广东医学院附属医院张培华$吴志华#
&!’
中华皮肤科杂志 !#年 $!月第 %& 卷第 ’! 期 ()*+ , -./012345 -.6.07./ !#5 834 %&5 93: $!
分别为 $;; !<=0>!#;; !<=0>取对数生长期 ?@A#
每瓶细胞计数 ’ ! ’;B 加入含不同质量浓度的 C@
$;%!;!#;!D; !<=0>&’孵育 #D )消化收集细胞’离
心’先后加入 E3.6).F2 %%%#! 和 GH !:! 0>孵育后
取 $; !>放在玻片上’盖上盖玻片’荧光显微镜下观
察%计数%拍照(
结 果
$: IJ9K> 法检测 C@ 对 ?@A 凋亡的影响)用
IJ9K> 法检测质量浓度为 ;%!;%#;%B;%D; !<=0>
的 C@ 作用于 ?@A #D ) 后的细胞凋亡情况’ 结果见
图 $* 凋亡细胞的核呈棕色或棕褐色着染’细胞核形
态呈碎点状’不规整’大小不一致’而正常非凋亡细
胞和阴性对照细胞核被苏木素复染呈蓝色’ 核相对
较大’形态大小较为一致* 实验所见随着 C@浓度的
不断增大凋亡细胞逐渐增多*
!: 荧光显微镜观察 C@ 对 ?@A 凋亡的影响)荧
光染色结果显示$图 !&’凋亡的细胞核呈高亮蓝色
的浓染致密的颗粒块状荧光’核固缩+凝聚!断裂’
随着 C@ 浓度的不断增大’凋亡细胞逐渐增多, 而正
常非凋亡细胞和阴性对照细胞核呈弥散均匀的蓝
色荧光’坏死细胞核被 GH 染为桔红色,
讨 论
IJ9K> 技术是近年应用较多的检测细胞凋亡
的方法’ 其用于检测培养细胞的凋亡细胞的核断裂
片段’可以检测早期的细胞凋亡’且特异性和敏感性
都较高-%.*本实验结果表明培养 ?@A在加入 C@后出
现明显凋亡’且随着 C@ 的浓度加大’阳性细胞数量
增多’可以见到凋亡细胞的核呈棕色或棕褐色着染’
细胞核形态呈碎点状’不规整’大小不一致’而正常
非凋亡细胞和阴性对照细胞核被苏木素复染呈蓝
色’核相对较大’形态大小较为一致*提示 C@有诱导
?@A凋亡的作用* 值得注意的是’就 IJ9K> 技术本
身而言’不能区别凋亡+坏死和自溶性死亡’必须结
合凋亡细胞的形态学特征加以判断-#.*
研究细胞凋亡的方法很多’ 形态学鉴定细胞凋
亡是最可靠的方法’ 荧光显微镜观察方法是其中重
要的一种’ 我们采用 E3.6)F2 %%%#!作为荧光染料’
并加用 GH双染以便更易辨认坏死和自溶性死亡*在
荧光显微镜下’ 凋亡的细胞核呈高亮蓝色的浓染致
密的颗粒块状荧光’核固缩+凝聚+断裂’并可见凋亡
小体’ 而正常非凋亡细胞和阴性对照细胞核呈弥散
均匀的蓝色荧光’坏死和自溶性死亡细胞核被 GH 染
为桔红色* 实验表明培养 ?@A 在加入 C@ 后出现了
凋亡’ 并随着 C@ 浓度的不断增大凋亡细胞逐渐增
多* 表明 C@可诱导 ?@A凋亡* 本实验应用 IJ9K>
法和荧光显微镜观察方法两种方法进行研究’ 避免
了单一测定方法的局限’充分证明 C@ 能够诱导 ?@A
凋亡’从而抑制其生长增殖* 据文献报道 -C. ’含 +
#L亚甲基环戊酮结构的化合物可经 M*6)1.4 加成反
应与含巯基的酶结合’导致该酶失活’从而显示这类
正常对照 C@ !; !<=0> C@ #; !<=0> C@ B; !<=0> C@ D; !<=0>
图 ! IJ9K> 法检测半边旗提取物 C@ 对系统性硬化病患者皮肤成纤维细胞凋亡的影响$ ! !;;&
正常对照 C@ !; !<=0> C@ #; !<=0> C@ D; !<=0>
图 荧光显微镜观察半边旗提取物 C@ 对系统性硬化病患者皮肤成纤维细胞凋亡的影响$ ! #;;&
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中华皮肤科杂志 !# 年 $! 月第 %& 卷第 ’! 期 ()*+ , -./012345 -.6.07./ !#5 834 %&5 93: $!
先证者女!#;岁 因全身起皮疹伴瘙
痒 $<余年来诊自诉 &#=岁时!每遇碰撞
后在碰撞处出现水疱! 约与碰撞面积相
同十余年前!无明显诱因!于右下肢出现
淡白色斑丘疹!上有小水疱!并随皮疹增
大而增大!疱液清!疱易破 皮疹瘙痒明
显!尤阴雨天更甚曾到多家医院就诊!诊
断为扁平苔藓#银屑病#扁平疣!后皮疹渐
增多 !<<<年到我院皮肤科就诊
体检$一般情况良好!各系统检查未
见异常 皮肤科情况$四肢伸侧#躯干的
肩背%图 ’&#胸腹#腰骶及双足背见扁平
高起的象牙白色斑丘疹及结节! 密集成
群!伴有抓痕#血痂 皮疹小米粒至豌豆
大小!部分皮疹上有水疱!疱壁薄!疱液
清9*>34?>@ 征阴性部分皮疹已愈!留有
大片萎缩性瘢痕!质略硬 头皮上有相同
皮损 口腔上腭可见散在淡白丘疹!水
疱!血疱指甲无损害既往无特殊病史
家族史$患者近 ; 代 #; 人!有 $; 人患同
病 %图 !& 其中男 !< 人有 & 人患病!女
!; 人有 = 人患病 胎产史$孕 # 产 !!行
人工流产 ! 次!现育一儿一女!其儿患有
本病 组织病理$表皮下大疱!疱内未见
炎症细胞浸润!真皮结缔组织增生 家族
史分析$调查全家 #; 人中!$; 人患本病
此 $; 例病程经过及临床表现基本上与
该患者相同 调查发现!连续 ; 代均有发
病!遗传方式符合常
染色体显性遗传
讨论 白色丘
疹样显性营养不良
型大疱性表皮松解
症!亦名 A1?*+* 型营
养不良型大疱性表
皮松解症!是显性营
养不良型大疱性表
皮松解症的一种变
异 本病发病较早!
一般在出生后不久
及婴儿期发病!皮损
广泛!水疱多位于四
肢!愈后可留下萎缩
性瘢痕!口腔可以受
累具有特征意义的
表现为躯干部位自
发象牙白色丘疹样
损害!多在青春期后
出现!丘疹可以出现在没有创伤的部位!
与水疱的关系不清楚 组织病理显示表
皮下疱! 疱内及真皮炎症细胞浸润不明
显’ 白色丘疹的病理可见真皮内结缔组
织增生’ 电镜检查显示裂隙或水疱位于
致密板下方! 而外观正常的皮肤致密板
下方的锚状纤维减少或缺如 结合本患
者典型临床及组织病理表现# 特征性的
白色丘疹及家系报告! 诊断为白色丘疹
样显性营养不良型大疱性表皮松解症
本病需与扁平苔藓# 寻常性银屑病相鉴
别 扁平苔藓多为紫红色苔藓样丘疹!表
面有 B*6>)10 纹! 病理有特征性改变
寻常性银屑病为浸润性红色丘疹#斑片!
上被层层银白色鳞屑! 刮除鳞屑可见薄
膜现象!刮除薄膜可见点状出血!病理有
特征性改变 本病治疗主要是避免外伤!
对症处理!防止继发感染!不主张给予糖
皮质激素治疗!口服维生素 C 可能有效
%收稿日期$!<<%D’!E!&&
白色丘疹样显性营养不良型大疱性表皮松解症一家系报告
徐佳 王萍
((((((((((
作者单位$$<<<$< 北京中医医院皮肤科
图 ! 肩背部皮损
图 家系谱
! !
! # ! # ! $ $ #
# # # ! # # ! # $ # $ # ! # !
$ # ! ! $ ! # $ ! ! ! #
% $ # #
%
化合物的细胞毒作用 ;F恰好含有 &#’E亚甲基E环
戊酮结构)G*!因此!我们推测 ;F 诱导 HFI 凋亡!抑制
其生长增殖的作用!减少其胶原蛋白的合成!可能与
具有该结构有关
参 考 文 献
’ 91>12?JK* L5 M*44./ NO: H.4.62*P. 6.44!6@64. 1//.?2 1+Q *+QJ62*3+ 3R
1S3S23?*? *+ S/34*R./12*+T +.J/14 6.44? 7@ T1+T4*3?*Q. UM%: CVS 9.J!
/34W !<<$5 $G=X !Y
纤维细胞增殖和胶原合成的影响 : 中华皮肤科杂志 5 !<<%! %G$
%$E%#:
% 谭晓华! 周殿元! 姜泊! 等: 两种原位 -9Z 断链标记技术检测组
织切片和培养细胞中的凋亡细胞: 中华医学检验杂志5 $YY=5 !$X
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# U/1?4![/1JSS I5 NJ22>1@!9.Q.6>@ I5 [3JQ.4>1 O5 .2 14: \+ ?*2J
Q.2.62*3+ 3R R/1T0.+2.Q -9Z !]^9C_ 1??1@ R1*4? 23 Q*?6/*0*+12.
103+T 1S3S23?*?W +.6/3?*?W 1+Q 1J234@2*6 6.44 Q.12)X 1 61J2*3+1/@
+32.: O.S12343T@W ’YY;W !’X ’#G;E’#G=:
; FJK* [W ‘J O,W ]12?J0* OW .2 14: -.?*T+ 1+Q ?@+2).?*? 3R 1+2*2J03/
630S3J+Q? 71?.Q 3+ 2). 6@2323V*6 Q*2./S.+3*Q? R/30 2). T.+J? N17!
Q3?*1: ().0 A)1/0 IJ44 !]3>@3W ’YY’W %YX G=;EG=Y:
G 张晓W 崔燎W 田中信寿!等: 半边旗有效成份及抗肿瘤活性研究: 中
国药学杂志! ’YY&! %!$ %&:
%收稿日期$!%E’!E!!&
+病例报告+
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