全 文 ：中华皮肤科杂志 !# 年 $月第 #% 卷第 $ 期 &’() * +,-./0123 */)4/-5 !66#7 812 #%3 91:$
系统性硬皮病!;;<是以皮肤纤维化#硬化为特
征的疾病$同时伴有其它系统损害$其发病机制尚
不清楚% 成纤维细胞!=>是参与 ;;< 纤维化#硬化
的主要细胞% 因此$探讨药物对 => 的增殖及其胶原
合成的影响$从而寻找安全#有效#副作用少的治疗
;;< 的药物是皮肤科研究课题之一% 本课题选用从
中草药半边旗中提取的一种具有抗肿瘤活性$但副
作用极小的成分&&二萜类化合物 ?= 进行研究%
该成份已被证明具有显著的体内#外对抗肿瘤的作
用$而且毒副作用很小 @AB#C$其作用机制主要与细胞
毒作用有关% 我们推测该成分对体外培养的 ;;<患
&&&&&&&&&&
作者单位’?!DEEA 广东湛江市$广东医学院附属医院皮肤科@肖
佐环!现在珠海市中山大学附属第五医院#吴铁#吴志华#张培华C
者皮肤 => 及其胶原合成可能具有抑制作用$ 故开
展了实验研究%
材料和方法
一#实验材料
A: 实验药物’半边旗 ?=$由广东医学院天然药
物研究与开发重点实验室提供% 半边旗 ?= 是中草
药半边旗的乙醇抽提物$分子式为 &!EF!GHD$化学名
为 $$!I羟基JA? 氧JA%J烯J对映贝壳杉烷JAKJ酸
!,)0 JAA!LM’/ J’5N-1O5 J$? J1O1 JP/4- J$% J,) J$K J
1(+QRQ溶解$经 E:!! . 滤器除菌$D !贮存备用%
!: 主要实验仪器’H25.M4S TQUJ#型倒置显微
(论著(
半边旗 ?=对系统性硬皮病患者成纤维细胞
增殖和胶原合成的影响
肖佐环 吴铁 吴志华 张培华
)摘要* 目的 研究中草药半边旗 ?= 对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞的作用$以期找到治疗
该病的新的有效药物% 方法 用四甲基偶氮唑盐!QUU方法和光度检测法及逆转录J聚合酶链反应!VUI
W&V 法测定半边旗 ?= 对成纤维细胞增殖和培养基中的胶原含量以及## $型前胶原 .V9X 表达的影
响% 结果 半边旗 ?= 对患者皮肤成纤维细胞的增殖具有显著的抑制作用$还能显著降低该细胞培养基中
可溶性胶原的含量!W :A% 上述抑制作用随着药物浓度的增高和作用时间的延长而增强% 采用 VUI
W&V 法对%# &型前胶原的 .V9X 检测显示随着药物浓度的增高二者的表达量降低% 结论 半边旗 ?=
对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞的增殖和胶原合成具有显著的抑制作用$为寻找有效治疗该病的药
物提供了新的启示%
)关键词* 硬皮病Y系统性+ 成纤维细胞+ 半边旗
!#$% & ’%()*+ ,(-*.*//0%0 12 &/ 3*4)&450+%+ ’)&5*()0%*&/ 0/6 7&5508(/ ,9/%:(+*+ */ ,9+%(-*$
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Z-1. S5S0,.(< S<2,-1N,-./ !;;< SP() /)N ,OM21-, ),\ N-4] Z1- ;;< 0-,/0.,)0: @(%:&6+ U’, ;;< SP()
Z([-1[2/S0S \,-, <4204-,N /S /) ,OM,-(.,)0/2 .1N,2 /)N 0’, ,ZZ,<0S 1Z W0,-(S S,.(M())/0/ ?= \,-, N,0,<0,N: U’,
<,22 M-12(Z,-/0(1) \/S N,0,-.(),N [5 QUU /SS/57 /)N 0’, <122/],) M-1N4<0(1) [5 M’101.,0-(< N,0,-.()/0(1): U’,
.V9X ,OM-,SS(1) Z1- 05M,%/)N & M-1<122/],) \/S N,0,<0,N [5 VU#W&V: A(+B5%+ T0 \/S S’1\) 0’/0 W0,-(S
S,.(M())/0/ ?= <142N )10 1)25 S(])(Z(/2S1 S(])(Z(\/S ()<-,/S,N /21)] \(0’ 0’, ()<-,/S()] 0’, <1)<,)0-/0(1) 1Z 0’, N-4] /)N M-121)]()] 0’, 0(., 1Z /<0(1): U’,
-,S420S 1Z VU#W&V S’1\,N 0’, ,OM-,SS(1) 1Z 05M, % /)N & M-1<122/],) \/S N,<-,/S,N /21)] \(0’ 0’,
()<-,/S()] 1Z 0’, <1)<,)0-/0(1) 1Z 0’, N-4]: C&/$5B+*&/+ U’, /[1^, -,S420S N,.1)S0-/0, 0’/0 W0,-(S
S,.(M())/0/ ?= <142N S(])(Z(Z([-1[2/S0S: T0 ./5 [, N,^,21M,N /S / ),\ N-4] Z1- 0’, 0-,/0.,)0 1Z ;;<:
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#A
中华皮肤科杂志 !# 年 $ 月第 #%卷第 $ 期 &’() * +,-./0123 */)4/-5 !66#7 812 #%3 91:$
表 ! ;<=>&; 检测!!型前胶原及内参的引物序列
检测指标 序 列 长度?@#
!型前胶原 A!&A!B&&CBBCBCC&&C&B<<&#!
内参照#=肌动蛋白# A!&&&C<&C&&C<&<<&&CB#! AEF
A!CBCCBB型前胶原 A!&A!&&C<&&<&&CBCC&内参照BC>+G# A!<&&A!BCCB&C<<镜日本#$I(1J;/K AA型酶标仪德国#$B<&=!型
>&;仪美国#$+L=+ 型电泳仪北京东方特力科贸
中心#$M+=NFO#& 型紫外透射仪 北京沃德生物医
学仪器公司#%
#: 主要实验试剂&+PQP 培养基B(?R1 公司#$
四甲基偶氮唑盐S(T./ 公司#$羟脯氨酸检测试剂
盒南京建成生物工程研究所#$<-(U12 总 ;9C 提取
试剂盒 B(?R1 公司 #$S4@,-VR-(@0 逆转录试剂盒
B(?R1 公司#$原及内参的引物大连宝生生物工程公司#%
FX LI 的来源及培养方法&在局麻下切取 F 例
SSR 患者的活动性硬化皮损边缘的皮肤组织’ 修剪
去皮下组织后’ 用锋利的眼科剪分离去除表皮层’
将皮肤剪成 H ..#以下碎块’平贴于 A .Y 培养瓶
的内壁’具体参考 S121.1) 等ZF[介绍的方法进行皮肤
LI原代培养并传代增殖’实验选用第 #\%代细胞%
二!实验方法
H: 半边旗 AL对 LI生长特性及形态的影响&将
LI 接种于底面积为 AO R.!的玻璃培养瓶内’ 每瓶
AHOA个细胞% 向生长接近融合的 LI中加入不同浓
度的半边旗 AL’ 以不加药组作为对照’ 培养 FD ’
后’置镜下直接观察细胞生长状况及形态’并拍照%
!: 半边旗 AL对 LI增殖的影响&采用改良 P<<
比色法测定’将 LI 接种于 N% 孔培养板’每孔 HHOF
个细胞’加入 HOO $Y培养基% !F ’后更换培养基并
加入半边旗 AL’经预试验及参照文献Z#[ ’药物的终
质量浓度分别确定为 !O $T].Y!F $T].Y!% $T]
.Y!D $T].Y’每种药物浓度共做 D 个培养孔’空气
调零’ 以不加药组为对照% 于加药后 !F ’!FD ’!E!
’’用酶标仪检测 C 值’检测波长 AE ).’参考波长
%# ).%抑制率^;#_H‘用药组 C值]对照组 C值#
Ha %
#: 半边旗 AL 对 LI 胶原合成的影响&将细胞接
种于 !F 孔细胞培养板’每孔 A$OF 个细胞’加入 $
.Y 培养基’接种 FD ’ 后’更换培养基’加入半边旗
AL试剂’每个试剂浓度测 F个孔’加药后 FD ’’从每
个孔里各吸取 O:A .Y 培养基’按羟脯氨酸G>;#检
测试剂盒南京建成生物工程研究所#说明书方法
测定培养基中羟脯氨酸含量% 在酶标仪 AFO ). 处
检测 C 值’样品中羟脯氨酸质量浓度$T].Y 培养
基#_测定管 C 值标准管浓度]标准液 C 值$样品中
胶原的质量浓度 $T].Y培养基#_样品羟脯氨酸质
量浓度E:F%稀释倍数 E:F% 是从羟脯氨酸换算为
胶原时的计算常数#% 抑制率 ^;_$=用药组胶原含
量]对照组胶原含量#$OOa %
F: 半边旗 AL 对 LI!型!型前胶原 .;9C 表
达的影响&采用逆转录聚
合酶链反应;<=>&;#技术’操作依照试剂盒说明
书方法进行% 取对数生长期的 LI’每瓶细胞计数 $
$O%个’ 加入不同浓度的药物’ 以不加药物组为对
照’FD ’ 后’弃去培养基’收集细胞’用氯仿!异丙醇
抽提细胞总 ;9C’逆转录得到 +9C 模板’进行 >&;
扩增’ 扩增参数为& 预变性 NF # % .()!NF # AO
V!AA # AO V!E! # $:A .()共 #!个循环#!E! #
A .()’>&; 产物经 $:Aa 琼脂糖凝胶电泳’以 >&;=
./-b,- 标记 +9C 条带位置’ 紫外透射仪下观察并
拍照% !!型前胶原及内参引物序列ZA’%[见表 $%
结 果
一! 体外培养的 SSR 患者皮肤 LI 的形态学观
察
用倒置显微镜观察可见正常存活的 LI 生长旺
盛!密集’呈平行极性排列’相互连接成片’细胞晕
清晰’形态规则’以梭形为主’胞体饱满’有扁平而
长的突起% 用药组’随药物浓度加大’细胞突起缩
短’胞体缩小’胞浆减少’细胞变圆’染色质浓缩边
集’胞核模糊’细胞间隔增宽’见图 $\F%
二!半边旗 AL对 LI增殖的影响
阴性对照 O:$FO$O:O$$ O:$AF$O:O$% O:!$O$O:O$!
半边旗 ALc$T].Yd
!6 6X6N!$6X66Ne#FXFHdf OXO%%$OXOH#eAEX!!df OXO%#$OXOH#eEOXO!df
FO OXO%A$OXOO%eA#XADdf OXO#A$OXOONeEEX%Odf OXO#H$OXOONeDAXH#df
%O OXOAO$OXOOEe%FX!Adf OXO!F$OXOO%eDFXHEdf OXO!!$OXOOAeDNXFEdf
DO OXOFO$OXOO%eEHX!#df OXOOD$OXOONeNFX%Fdf OXOOA$OXOOHeNEXENdf
! !注&半边旗 AL 与阴性对照组比较’f>gOXOH%括号内为抑制率a#
表 半边旗 AL 对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞
增殖的影响!$V# C 值
组别
培养时间
!F ’ FD ’ E! ’
#!
中华皮肤科杂志 !# 年 $月第 #% 卷第 $ 期 &’() * +,-./0123 */)4/-5 !66#7 812 #%3 91:$
阴性对照 !:$;#!<:=>< =%:#%!=:<><
半边旗 ?@!!AB.C
!< =:;:!#!=:D#< =#:<>
>< =:D<%!<:%< =:>D!!<:<%>F =<:;E!<:>DF #!:E?F
E< =:>?=!<:=E=F =<:E!!=:#?F ##:E!F
! !注#半边旗 ?@ 与阴性对照组比较$FG H <:<=
表 ! 半边旗 ?@对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞
胶原合成的影响!!!I
组别
羟脯氨酸
!AB.C
胶原蛋白
!AB.C
抑制率
!J
用改良 KLL比色法测定细胞增殖$ 结果可见#
半边旗 ?@ 对体外培养的 MMN 患者皮肤 @O 具有显
著的抑制作用$ 随药物浓度增高和作用时间延长$
抑制作用增强$见表 !%
三&半边旗 ?@对 @O胶原合成影响的测定结果
半边旗 ?@ 对 MMN 患者 @O 胶原合成有显著抑
制作用$随药物浓度增高$抑制作用增强$见表 #%
四& 半边旗 ?@对 @O& #型前胶原的 .P9Q
表达的影响
PLRG&P 产物电泳结果见图 ?&%$ 由图可见阴
性对照组 @O&$型前胶原 .P9Q 呈高表达$半边
旗 ?@ 呈剂量依赖性抑制 @O%&$型前胶原的 .P
9Q 表达$即随着药物浓度加大$抑制作用增强%
讨 论
本研究直接采用 MMN 患者皮肤分离的 @O 进行
体外培养$镜下可见 @O 形态规则$以梭形为主$胞
体饱满$有 !S# 个扁平而长的突起$呈平行极性排
列$相互连接成片$与文献资料TDU一致% 细胞生长旺
盛$传代至第 =E 代$外观仍无明显改变% 实验选用
#S%代细胞$ 适用于研究 @O 的形态及功能如生长&
分化及胶原蛋白合成情况等%形态学观察及 KLL结
果发现$半边旗 ?@ 能够使 @O 突起缩短$胞体缩小$
胞浆减少$细胞变圆$染色质浓缩边集$胞核模糊$
细胞间隔增宽$与阴性对照相比$细胞数减少% 提示
半边旗 ?@ 能够诱导 @O 凋亡$抑制其生长增殖% 根
据文献报道 TEU$含 &&’V亚甲基环戊酮结构的化合物
可经 K(N’/,2 加成反应与含巯基的酶结合$ 导致该
酶失活$从而显示这类化合物的细胞毒作用% 半边
旗 ?@ 恰好含有 &&’V亚甲基V环戊酮结构 T!U$因此$
我们推测半边旗 ?@ 诱导 @O 凋亡$抑制其生长增殖
的作用可能与具有该结构有关% 其诱导 @O 凋亡的
具体机制仍待进一步研究%
羟脯氨酸是胶原蛋白中一种重要且含量稳定
的氨基酸$在其他组织中含量甚微$因此$测量羟脯
氨酸的含量是检测胶原含量的可靠方法% 本研究发
现半边旗 ?@ 对 @O 培养基中的可溶性胶原具有显
著的抑制作用$ 可有效抑制%& $型前胶原 .P9Q
的表达$ 是半边旗 ?@ 有效抑制胶原合成的作用机
制之一% 胶原合成过多并过量沉积是硬皮病的重要
病理特征之一$因此$具有抑制胶原合成和!或促
进胶原降解功能$是治疗 MMN药物的重要条件之一%
L/W,X/ 等T;U对 MMN 的胶原酶 .P9Q 表达情况进行研
究$ 发现其 .P9Q 表达下降是 MMN 的 @O 的一个特
征% 胶原 .P9Q 表达增加和胶原酶 .P9Q 表达下
降$ 可能是导致 MMN患者皮损内胶原过量堆积的原
因%半边旗 ?@是否可使胶原酶 .P9Q表达增加$从
而增加胶原酶的含量7促进胶原降解需进一步探讨%
本研究初步证明$ 半边旗 ?@具有抗 MMN 的 @O
增殖$诱导其凋亡的作用$并可抑制其合成胶原% 为
寻找有效治疗该病的药物提供了新的启示$但上述
所提的半边旗 ?@ 其他可能作用机制和动物及临床
图 #$ 半边旗 ?@ 对成纤维细胞形态的影响 图 = 正常对照$图 ! 半边旗 ?@ !< !AB.C$图 # 半边旗 ?@ >< !AB.C$图 > 半边旗 ?@ E< !AB.C
图 %#& 半边旗 ?@ 对成纤维细胞%& $型前胶原的 .P9Q 表
达的影响 图 ?%型前胶原的 .P9Q 表达$图 %$型前胶原的 .P
9Q 表达% K#分子量标记7=#半边旗 ?@ < !AB.C$!#!< !AB.C$##><
!AB.C$>#E< !AB.C
##
中华皮肤科杂志 !# 年 $ 月第 #%卷第 $ 期 &’() * +,-./0123 */)4/-5 !66#7 812 #%3 91:$
近年研究表明!白癜风与自身免疫
遗传关系密切! 为探讨这些现象在儿童
白癜风发病中的影响! 我们回顾性分析
了 ;<< 例儿童白癜风患者的临床资料#
一资料与方法
$一%病历来源&;<< 例儿童白癜风患
者中有 ;?$==< 年间
就诊 并有设计完整和随访记录资料
的!$> 岁的患者’余 % 例先天发病者是
近 ! 年间就诊者! 确诊依据病史及临床
症状!诊断及分型标准均按文献@$A(
$二%方法&用原有设计完整的病历
资料!通过先证者$主要是随诊父母%的
口述和临床症状! 初次就诊时! 嘱患者
$或父母%进行病史回顾!并详细介绍了
表格填写的方法(具体内容为&!白癜风
的首发时间!诱发和加重因素!#伴发
疾病! $与季节的关系! %有无家族史
等(对有家族发病者!详细询问与先证者
的关系!了解阳性家族成员的临床症状!
并以县级以上医院的诊断为基础! 结合
临床症状确定诊断! 对再次随诊中有更
改者以最后 $ 次记录为准( 在表格整理
中! 对因填写不详或不规范者均未收入
本资料(
二结果
$: 性别与发病年龄&;<< 例患者中!
))))))))))
作者单位&BB$CC# 湖北襄樊铁路医院皮
肤科
男 #至!$> 岁!平均年龄为 ;:= 岁( > 岁前发
病者 $;< 例! 占 !!:>=D’%EFC 岁发病者
#;> 例! 占 B;:>=D’FFEF> 岁发病者 !#>
例 !占 !=:<#D( 寻常型 >FC 例 !节段型
!;< 例(
!: 伴发疾病&乙型肝炎 > 例!甲型肝
炎 # 例!支气管哮喘 = 例!特应性皮炎 #
例! 斑秃 FF 例( 伴发晕痣者 B= 例!占
%:!!D!其发病时间先后不等(
#: 发病季节&#B% 例发病与季节有
关!其中夏季发病和加重者 F!% 例!春季
F#B例!秋季 BC 例!冬季 B% 例(
B: 诱发因素&有明确外伤 $碰 摔
划手术烫冻晒伤及某些皮肤病炎症
或局部刺激% 后直接诱发和加重者 F<>
例!占 !#:B者 F!% 例!占 F>:==D( 在各型中!以皮节
型的外伤诱因最为突出! 且外伤均在白
斑处受神经支配区域的附近(
>: 家族史&FC% 例有白癜风家族史!
占 F#:B>D!其中男 B= 例!女 >; 例( 少数
儿童出生时即发现皮肤白斑! 并随年龄
增大而扩大!而且出现新发白斑!临床呈
典型的白癜风症状有 != 例(
三讨论
本组资料从发病年龄看!以 %EF! 岁
为高发年龄! 其原因除自身免疫 遗传
外! 可能还与该年龄段的学龄儿童外界
活动的能力增多! 自我保护意识缺乏致
外伤增多诱发本病有关(
据国内资料表明白癜风在群体发病
率约为 FD左右! 而有家族史则在 #DE
F;:!CD之间 @!A!本组有家族史为 F#:B>D!
与国内报道相符( 但由于部分患者亲属
并不完全了解家族发病情况! 实际发病
率可能更高( 在 ;<< 例患者中有少数于
出生时即发现皮肤白斑! 随年龄增长而
扩大!并出现新发白斑!临床呈典型的白
癜风症状!并有阳性家族史(根据黑素细
胞具有内在遗传缺陷 @#A和本组资料 @BA说
明!白癜风发病有遗传背景(至于是否存
在先天性白癜风!值得进一步调查(
在白癜风病因病机研究中! 目前公
认与自身免疫有重要关系( 本组资料显
示!节段型所占比例较高$#>:!;D%!晕痣
的伴发率增高 $%:!!D%’ 有明确外伤史
$特别是碰摔划伤%而诱发和加重白癜
风( 其原因复杂!尚有待进一步研究(
参 考 文 献
F 全国中西医结合皮肤性病学会色素病学
组:白癜风临床分型及疗效标准$草案%: 中
华皮肤科杂志3 F==>3!! 朱铁君: 白癜风 %>C 例临床研究: 临床皮肤
科杂志3 F==>3!BG!;=H!# 邓宝丽3 沈丽玉: 白癜风研究进展: 国外医
学皮肤性病学分册3 F==>3!FG;#H;>:
B 桂金萍3 李玉珍3 李进先 3 等 : FF < 例白
癜风患者及其家系分析: 中华皮肤科杂志3
!F3#BGFB:
$收稿日期&!!HFHB%
儿童白癜风 ;<<例病因分析
桂金萍 李进先 吴红波
试验还需进一步探索(
参 考 文 献
F 崔燎3 梁念慈3 陈志东! 等: 半边旗体内外抗癌作用及急性毒性研
究: 中药材! F==%!F=&!=H#!:
! 张晓3 崔燎3 田中信寿! 等: 半边旗有效成份及抗肿瘤活性研究 :
中国药学杂志! F==;!#!&#;:
# 李金华3 梁念慈3 莫丽儿! 等: 半边旗 > 种成份体外细胞毒活性比
较及构效关系分析: 药学学报! F==B I121.1) J3 K( +L3 K,, IM3 ,0 /2: N,O42/0(1) 1P Q122/O,)/R,7
R0-1.,25R()7 /)S 4-1T()/R,H05U, U2/R.()1O,) /Q0(V/01- () U-(./-5
U0,-5O(4. W1S5 P(W-1W2/R0R W5 ()P2/../01-5 Q501T(),R: X)V,R0 YU’!
0’/2.12 8(R IQ(7 !7BFG!F>BH!F%#:
> Z/)O11 J7 K/W/) &7 &11T [\7 ,0 /2:X)0,-2,4T()!FCH /)S Q1-0(Q1R!
0,-1(S!()S4Q,S -,S4Q0(1) () 05U, X U-1Q122/O,) () / ’4./) ,] V(V1
RQ/- Q4204-,: X)0 * ^]U _/0’12‘ F==;7;% a/U2/) ^_7 N(Q’(,- *&7 [1b/-S _I7 ,0 /2:\5U, XXX Q122/O,) .,RR,)!
O,- N9J (R .1S42/0,S () )1)!Q1.U2(/)0 ’4./) W2/SS,- 0(RR4,: *
c-127 F==;7F>;G!#%%H!#%=:
; 郑学毅! 马圣清! 汤秀英7 等: 体外培养硬皮病成纤维细胞的超微
结构观察: 临床皮肤科杂志! F==;!!%&F>=:
< d4e( a7 f4 [*7 \/0R4.( [7 ,0 /2: +,R(O) /)S R5)0’,R(R 1P /)0(04.1-
Q1.U14)SR W/R,S 1) 0’, Q50101](Q S(0,-U,)1(SR P-1. 0’, O,)4R N/W!
S1R(/: &’,. _’/-. M422 $\1T51%7 F==F7#=G%<>H%<=:
= \/T,S/ a7 [/0/.1Q’( J7 c,T( [7 ,0 /2: +,Q-,/R,S Q122/O,)/R, ,]!
U-,RR(1) () Q4204-,S R5R0,.(Q RQ2,-1R(R P(W-1W2/R0R: * X)V,R0 +,-./0127
F==B7FC#G#>=H#%#:
$收稿日期&!CCFHF!HC%%
*短篇论著*
#B