全 文 ：第３４卷 第１期
２０１６年３月
四川农业大学学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｖｏｌ．３４ Ｎｏ．１
Ｍａｒ．２０１６
收稿日期：２０１５－１１ －０４
基金项目：国家星火计划（金花茶种苗繁育与茶膏加工技术的示范推广２０１４ＧＡ８３００１６）； ２０１５年三区人才支持计划
（２１５０１７３７）。
作者简介：吴田，副教授，博士，主要研究方向为植物分子生物学，Ｅ－ｍａｉｌ：２３５１４１７６５５＠ｑｑ．ｃｏｍ。＊责任作者：蓝增全，教
授，硕士，主要从事茶学的研究，Ｅ－ｍａｉｌ：４６１２５７２７１＠ｑｑ．ｃｏｍ。
ｄｏｉ：１０．１６０３６／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－２６５０．２０１６．０１．０１０
云南峨毛茶亲缘关系的ＩＳＳＲ分析及指纹图谱构建
吴 田１，蓝增全２＊
（１．西南林业大学园林学院，昆明 ６５０２２４； ２．西南林业大学环境科学与工程学院，昆明 ６５０２２４）
摘要：【目的】了解和保护峨毛茶大茶树资源。【方法】采用ＩＳＳＲ技术对云南峨毛地区的５份茶样资源的遗传多样
性和亲缘关系进行研究。【结果】结果表明：５份峨毛茶样共扩增出９４条清晰的ＤＮＡ条带，其中多态性带７３条，占
７７％，遗传相似系数介于０．４５～０．６４之间，表明来自同一地区的峨毛茶之间已经产生遗传分化。【结论】利用８２３
引物构建了５份峨毛茶的指纹图谱，为今后峨毛茶的鉴定提供了参考。
关键词：峨毛茶；指纹图谱；遗传多样性
中图分类号：Ｒ２８２．７１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１０００－２６５０（２０１６）０１－００５４－０６
ＩＳＳＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｉｎ Ｅｍａｏ Ｔｅａｓ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ
ＷＵ Ｔｉａｎ１，ＬＡＮ Ｚｅｎｇ－ｑｕａｎ２＊
（１．Ｌａｎｄｓｃａｐｅ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ Ｃｏｌｅｇｅ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｌｅｇｅ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｅ ａｉｍ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｔｏ ｋｎｏｗ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔ ｔｈｅ ｌａｒｇｅ ｔｒｅｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ
Ｅｍａｏ ｔｅａｓ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｆｉｖｅ Ｅｍａｏ ｔｅａ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ
Ｙｕｎｎａｎ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＩＳＳＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．【Ｒｅｓｕｌｔｓ】Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ９４ｃｌｅａｒ ＤＮＡ
ｂａｎｄｓ ｉｎ Ｅｍａｏ ｔｅａ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．７３ｂａｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ａｎｄ
ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｒａｔｅ ｗａｓ ７７％．Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ０．４５ａｎｄ
０．６４，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｅｍａｏ ｔｅａｓ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｔｈｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｏｆ
ｆｉｖｅ ｔｅａｓ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ ８２３，ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ
ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｍａｏ ｔｅａｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｅｍａｏ ｔｅａ；ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ；ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
中国是世界茶树起源中心，茶树种植资源的多
样性和特异性为世人瞩目［１－２］。１９９０年中国茶树种
质资源圃分别在浙江和云南勐海建成［３］，已经收集
保存了来源于全国多个地区的野生茶树、地方品种、
名枞、育成品种品系、株系、近缘种共计２ ７００余份，
且每年都以１００余份的速度增加［４］。资源快速鉴定
利用已经成为大家关注的核心问题。ＤＮＡ分子标
记计术是进行茶树遗传多样性研究的重要手段之
一，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础
的遗传标记，是 ＤＮＡ 水平遗传多态性的直接反
应［５］。ＤＮＡ指纹图谱能直接表明基因组 ＤＮＡ差
异，是当今最先进的遗传标记系统，具有多位点性、
高变异性、简单而稳定的遗传性等特点。利用ＩＳＳＲ
标记已经成功构建枣［６］、红花橙木［７］、龙眼［８］、红
麻［９］等多种植物的指纹图谱。近年来ＩＳＳＲ技术在
茶树指纹图谱构建上的应用亦越来越多，并在鉴定
第１期 吴 田，等：云南峨毛茶亲缘关系的ＩＳＳＲ分析及指纹图谱构建
种质上起到了重要作用［１０－１１］。
云南省１６个州１２９个县中，有１５个州１１０多
个县产茶。茶区主要分布于滇西、滇西南的大叶种
茶片区和滇东北的小叶种茶片区。云南茶叶面积约
３０３万ｈｍ２，居全国第１位；茶叶年产量达到１７万
ｔ，居全国第２位。据文献记载，清朝乾隆年间，有人
从思茅（现在的云南省普洱市）带了３棵茶树苗，栽
种于峨毛村一带，三百多年间，这３棵茶树苗又被反
复接种移栽，在者竜乡繁衍，成为现在的峨毛茶，２０
世纪３０年代期间成为当地一大经济支柱，并演变成
当今新平“峨毛茶”地方性优良品种［１２］。２０世纪７０
年代，中科院茶叶研究所对峨毛茶树采样分析，结论
是其色、香、味媲美西湖龙井茶，同等物质含量是龙
井茶的两倍，该结论引起新平县科委的重视，采用嫁
接移栽的办法发展，但经过多年的努力，只要移出峨
毛村这块土地，茶苗要么不生根，要么变种，至今尚
未在峨毛村之外的地方成功栽培峨毛茶，峨毛茶是
只宜在云南新平县者竜乡哀牢山的峨毛村栽培一种
云南大叶种茶。峨毛茶外形粗细适中显毫，色泽嫩
绿光润，带着淡淡的兰花香味，冲泡后，茶汤呈金黄
透亮的玛瑙色，滋味鲜醇甘爽。峨毛茶虽然在当地
已有３００多年的栽种和加工历史，但因加工粗放，没
有创立品牌，鲜被外界所认识，但考虑到其优良的品
质，当地茶业工作者近年来致力于峨毛茶的推广工
作，直至２０１１年开始运作、２０１３年在峨毛村正式成
立云南玉溪新平凤翥峨毛茶专业合作社，峨毛茶才
逐渐又被重视，目前已经有２０余公顷生态茶田。
目前，利用ＩＳＳＲ技术对茶树资源进行遗传多
样性和亲缘关系的研究较多［１３－１５］，但鲜见将ＩＳＳＲ
技术应用于峨毛茶。２０世纪末期，由于茶业产业不
景气，峨毛茶被疏于管理，大量的峨毛茶树被采伐，
峨毛茶种质，尤其是峨毛茶大树资源越来越少，笔者
此次在峨毛村的调查发现，乔木型峨毛茶树有５００
株左右，这些茶树有大叶茶树的明显特征，如树体高
大，主干明显，树姿张开，叶色深绿，叶片大等，其中
地径３０ｃｍ、树高４ｍ以上的峨毛茶大树在仅存５
株，这也是本研究的倡导方云南玉溪新平凤翥峨毛
茶农民专业合作社尤为关注的５株峨毛茶大树，希
望通过本研究确认它们之间亲缘关系的同时挂牌保
护。为了云南峨毛茶大树资源的鉴定和保护，以及
后续进行新品种培育和种质资源的开发利用，本研
究拟利用ＩＳＳＲ技术分析峨毛茶大树资源的遗传多
样性和亲缘关系，同时构建５个峨毛茶大树的指纹
图谱，以在分子生物学水平区分５株峨毛茶大树。
１ 材料和方法
１．１ 植物材料
本研究于２０１３年５月在新平县者竜乡哀牢山
的峨毛村进行取样，取样对象为云南玉溪新平凤翥
峨毛茶专业合作社重点关注的５株峨毛茶大树，这
些茶树树体高大，叶色深绿，据合作社负责人介绍，
这些峨毛茶树树龄在百年以上。为了便于区分将其
分别编号为峨毛茶１～５号，５棵峨毛茶树分别用皮
尺测量地径、树高、叶长、叶宽，重复３次，取平均值，
挂牌（编号、时间）后采集鲜嫩叶片１０片，于冰盒中
带回实验室，存于－８０℃冰箱内用于提取 ＤＮＡ。
经测量，５株峨毛茶大树地径３９～５４ｃｍ、树高４．２
～６．５ｍ，叶色深绿，成熟叶面积为４０．２５～５９．３５
ｃｍ２（表１），为云南大叶茶种。
１．２ 实验试剂
天根新型植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒（离心
柱型）、琼脂糖凝胶、ＤＬ ２０００Ｍａｒｋｅｒ等分子生物学
药品购自Ｔａｋａｒａ公司。Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶及配套试
剂购自北京全式生物技术有限公司。从加拿大哥伦
比亚大学设计的１００个ＩＳＳＲ通用引物中随机选出
３８个引物序列（表２）合成，用于本实验，由上海生工
合成。
１．３ 实验方法
１．３．１ ＤＮＡ的提取
ＤＮＡ的提取使用天根新型植物基因组ＤＮＡ
表１ 峨毛茶供试材料
Ｔａｂｌｅ １ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｏｆ Ｅｍａｏ ｔｅａ
编号
Ｎｏ．
地径
Ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｔｒｅｅ／ｃｍ
树高
Ｈｅｉｇｈｔ ｏｆ ｔｒｅｅ／ｍ
叶色
Ｃｏｌｏｒ
叶长
Ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｌｅａｆ／ｃｍ
叶宽
Ｗｉｄｔｈ ｏｆ ｌｅａｆ／ｃｍ
叶面积
Ｌｅａｆ ａｒｅａ／ｃｍ２
峨毛１号 ５４ ５ 深绿 １４．２２ ４．８６ ４８．３８
峨毛２号 ４０ ４．５ 深绿 １２．５ ４．６ ４０．２５
峨毛３号 ４４ ５．５ 深绿 １４．９８ ５．６６ ５９．３５
峨毛４号 ３９ ６．５ 深绿 １２．４６ ５．１ ４４．４８
峨毛５号 ３５ ４．２ 深绿 １３．４６ ４．７ ４４．２８
５５
四川农业大学学报 第３４卷
表２ ＩＳＳＲ引物
Ｔａｂｌｅ ２ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ
引物名称
Ｎａｍｅ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ
序列（５′－３′）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′－３′）
引物名称
Ｎａｍｅ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ
序列（５′－３′）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′－３′）
８０２ ＡＴＡ ＴＡＴ ＡＴＡ ＴＡＴ ＡＴＡ ＴＧ ８４０ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＹＴ
８０３ ＡＴＡ ＴＡＴ ＡＴＡ ＴＡＴ ＡＴＡ ＴＣ ８４１ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＹＣ
８０５ ＴＡＴ ＡＴＡ ＴＡＴ ＡＴＡ ＴＡＴ ＡＣ ８４２ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＹＧ
８０６ ＴＡＴ ＡＴＡ ＴＡＴ ＡＴＡ ＴＡＴ ＡＧ ８４４ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＲＣ
８０８ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＣ ８４５ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＲＧ
８１１ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＣ ８４６ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＲＴ
８１２ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＡ ８４７ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＲＣ
８１４ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＡ ８４８ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＲＧ
８１５ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＧ ８５０ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＴＧ ＴＹＣ
８１８ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＧ ８５３ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＲＴ
８２２ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＡ ８５４ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＲＧ
８２３ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＣ ８５５ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＹＴ
８２４ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＧ ８５６ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＹＡ
８２５ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＴ ８５７ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＹＧ
８２６ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＣ ８５８ ＴＧＴ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＲＴ
８２７ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＧ ８６０ ＴＧＴ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＲＡ
８３４ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＹＴ ８６６ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＴＣ
８３５ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＹＣ ８９５ ＡＧＡ ＧＴＴ ＧＧＴ ＡＧＣ ＴＣＴ ＴＧＡ ＴＣ
８３６ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＹＡ ９００ ＡＣＴ ＴＣＣ ＣＣＡ ＣＡＧ ＧＴＴ ＡＡＣ ＡＣＡ
提取试剂盒（离心柱型），操作步骤按照说明书进行。
用１．０％琼脂糖凝胶（Ｂｉｏｗｅｓｔ，西班牙）电泳检测
ＤＮＡ完整性，用分光光度计（ＮａｎｏＶｕｅ，英国）检测
ＤＮＡ提取纯度及浓度。
１．３．２ ＩＳＳＲ引物筛选及ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增
以峨毛茶１号茶样的ＤＮＡ为例作为ＰＣＲ反
应模板、分别以表２中３８个ＩＳＳＲ引物序列为ＰＣＲ
反应引物，以筛选ＩＳＳＲ引物。ＰＣＲ反应液体系为
５０μＬ，其中包含 ５μＬ １０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（包含
ＭｇＣｌ２），５μＬ ｄＮＴＰｓ，０．３μＬ单引物（２０μｍｏｌ／Ｌ），
０．５μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶，１μＬ ＤＮＡ，其余用
ｄｄＨ２Ｏ补足。反应液用适量矿物油（Ｓｉｇｍａ，美国）
覆盖，在ＰＣＲ仪（德国，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）上进行扩增。每
个反应４２个循环，进入循环前９４℃预变性３ｍｉｎ，
每个循环９４℃变性４５ｓ，５３℃退火温度下退火４５
ｓ，７２ ℃延伸９０ｓ，循环结束后７２ ℃充分延伸５
ｍｉｎ。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，在 ＵＶＰ凝胶
成像系统上照像并保存。有ＰＣＲ产物的ＩＳＳＲ引
物即为入选引物，将进行下一步的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增。
１．３．３ 数据分析
根据电泳条带的有无统计数据，在相同迁移位
置，有带记为１，无带记为０。计算５份峨毛茶的多
态性。
１．３．４ 聚类分析
采用ＮＴｓｙｓ ２．１ｅ软件对５份峨毛茶进行非加
权组平均法（Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐａｉｒ－ｇｒｏｕｐ ｍｅｔｈｏｄ ａｎａｌｙ－
ｓｉｓ，ＵＰＧＭＡ）聚类分析，计算遗传相似系数，建立
树状图。
２ 结果与分析
２．１ ＤＮＡ提取的检测结果
本实验提取的峨毛茶叶片基因组ＤＮＡ经电泳
检测，可以观察到ＤＮＡ主带清晰明亮，条带整齐，
无拖带现象，几乎无降解，无电泳可见的ＲＮＡ。经
超微量分光光度计检测，峨毛茶叶片基因组 ＤＮＡ
的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值在１．７７～１．９５之间，ＯＤ２６０／ＯＤ２３０
值在１．９１～２．２３之间，表明该方法提取的总ＤＮＡ
质量比较高，纯度好。结合电泳检测结果，用该方法
提取的５个峨毛茶叶片基因组ＤＮＡ均满足ＩＳＳＲ
分子标记的要求。
２．２ 引物的筛选
用３８个不同的随机引物、以峨毛茶１号叶片的
ＤＮＡ为模板，进行了ＰＣＲ扩增。结果表明，１５个
引物能扩增得到条带，分别是８１８、８２２、８２３、８２５、
８２６、８２７、８３５、８３６、８４１、８４２、８４６、８４８、８５３、８５６、８５８。
６５
第１期 吴 田，等：云南峨毛茶亲缘关系的ＩＳＳＲ分析及指纹图谱构建
２．３ ５份峨毛茶的ＩＳＳＲ扩增多态性分析
利用筛选出的１５个引物，分别对５个峨毛茶
ＤＮＡ进行ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增（图１），结果发现清晰且
易于读带的ＰＣＲ条带共有９４条，其中多态性条带
７３条，占７７％，平均引物多态性带为６条，其中，扩
增带数最多的引物是８４１，为１３条（图１Ｅ），带数最
少的是引物８２５，为１条。
２．４ ５份峨毛茶的聚类分析
根据对５份峨毛茶种质所产生的７３条多态性
条带使用ＮＴｓｙｓ ２．１ｅ软件进行统计分析，获得了５
份峨毛茶的遗传相似系数的聚类图（图２）。由７３
条多态性条带获得的遗传相似系数的聚类图中，各
泳道 Ｍ：ＤＮＡ分子量标准ＤＬ ２０００；泳道１～５：峨毛茶１～５号；Ａ～Ｉ分别是ＩＳＳＲ引物８１５、８１８、８２３、８３６、８４１、８２７、
８４８、８５３、８５６的ＰＣＲ扩增图片。
Ｍ ｉｓ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２０００；１－５ａｒｅ Ｅｍａｏ ｔｅａ Ｎｏ．１－５，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ａ－Ｉ ｉｓ ｔｈｅ ｐｉｃｔｕｒｅ
ｏｆ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ８１５，８１８，８２３，８３６，８４１，８２７，８４８，８５３ａｎｄ ８５６，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
图１ ＩＳＳＲ扩增
Ｆｉｇｕｒｅ １ ＩＳＳＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
７５
四川农业大学学报 第３４卷
个种质间的遗传相似系数分布在０．４５～０．６４范围
内。通过聚类发现，在０．４５水平上，５份峨毛茶被
均认为同一大类；在０．５０水平上，５份峨毛茶被分
为２大类群，其中峨毛５号茶样被单独聚为一类，余
下４个茶样为另一类，说明峨毛５号茶样与其他茶
样的亲缘关系较远；在０．５５水平上除峨毛５号茶样
外的另外４个茶样被划分成了２个亚类，峨毛２号
茶样与峨毛３号茶样归为一个亚类，而峨毛１号茶
样与峨毛４号茶样为另一个亚类，其中峨毛２号茶
样与峨毛３号茶样的遗传相似水平最高。
图２ ５份峨毛茶的聚类图
Ｆｉｇｕｒｅ ２ Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ ｏｆ ５Ｅｍａｏ ｔｅａｓ
２．５ 引物８２３构建指纹图谱
引物８２３在５个峨毛茶样中均有特征条带（图
１Ｃ），能够区分５个供试样品，从而建立了５个峨毛
茶样的ＤＮＡ指纹图谱。为了更清晰地诠释电泳图
谱，将目的条带１∶１绘制在空白框中，即形成图３。
在２５０～７５０ｂｐ间，共读得５个水平的ＰＣＲ条带，
将５个水平的条带按照由大到小的顺序依次命名为
Ｍ １～Ｍ５。其中，５个峨毛茶样分别在Ｍ１～Ｍ５处
图３ 绘制引物８２３的对应电泳条带
Ｆｉｇｕｒｅ ３ Ｄｒａｗｉｎｇ ｏｆ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ｓｔｒｉｐ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ８２３
均只有唯一条带，因此引物８２３可以将５个供试峨
毛茶样区分开。若将有带读为１、无带读为０，峨毛
茶１～５号的数字代号依次分别００００１、０００１０、
００１００、１００００、０１０００。
３ 讨论
本实验对５份峨毛茶进行了ＩＳＳＲ遗传多样性
分析，结果表明本组茶样遗传变异水平较高，具有较
丰富的遗传多样性，这可能与峨毛村所处的哀牢山
脉独特的气候区域差异和垂直变化有一定关系，即
受到太阳辐射、温度、水分、土壤、风、火等不同的生
态因子的不同影响［１６］，种质的生境不一样，才会造
成采集地相同而处于不同的类群或不同的亚类。
植物杂种优势的产生在一定程度上取决于亲本
间的遗传差异，遗传差异大说明其亲缘关系较远，杂
交后代的杂种优势较大［１７］。从ＤＮＡ分子水平上，
查明亲本及其杂种间的遗传差异大小，对选配亲本
杂交组合及其杂种优势利用评价有重要的理论指导
价值［１８］。本研究中检测的５份峨毛茶样中，峨毛茶
５号与其他４个样本的亲缘关系较远，以本研究ＩＳ－
ＳＲ标记的聚类结果为依据，今后进行育种时应选择
峨毛茶５号作为母本与其他峨毛茶样进行杂交，可
以增加遗传变异，以得到更多变异的子代。指纹图
谱具有高度的个体特异性，分辨率高、稳定可靠，能
够准确地鉴定出生物个体和群体之间的差异，甚至
可以鉴别出一些基因组中的微小变异，因而是一种
理想的品种纯度和真实性检测技术［１９－２１］。引物８２３
可以将５个供试峨毛茶样区分开，峨毛茶１～５号的
数字代号依次分别００００１、０００１０、００１００、１００００、
０１０００。该指纹图谱的获得为今后峨毛茶的鉴定提
供了一定参考依据。
云南大叶种是云南省大叶类茶树品种的总称，
国家曾经在１９８５年审定过３个云南大叶种，分别为
勐库大叶种、凤庆大叶种和勐海大叶种，是最为著名
的云南大叶种，其主要特性是成熟叶片面积大于４０
ｃｍ２、鲜叶中茶多酚与儿茶素含量高等。在云南大
叶茶包含丰富的种质资源，随着这３个大叶种的审
定，其他的大叶种茶也在逐步被关注，如冰岛茶、紫
鹃茶、南糯山茶、班章茶、景谷大白茶等，本研究中所
提到的峨毛茶也是云南大叶种的一类，由于其形成
的地域品饮风味，成为这几年云南提到比较多的一
类大叶种茶，但是由于地域生长的局限性，目前对峨
毛茶几乎没有太多的文献著作可以查阅，本文通过
峨毛茶大树资源进行调查并做此研究开启对峨毛茶
８５
第１期 吴 田，等：云南峨毛茶亲缘关系的ＩＳＳＲ分析及指纹图谱构建
的科学研究，以使更多的茶爱好者、茶研究者们关注
峨毛茶。
志谢：感谢昆明市农业科学研究院高级农艺师沈晓进老师和
云南玉溪新平凤翥峨毛茶专业合作社刘恭睿社长在峨毛茶
背景介绍和取样时给予的热情帮助。
参考文献：
［１］ Ｚｅｎｇ Ｙ Ｗ，Ｗａｎｇ Ｊ Ｊ，Ｙａｎｇ Ｚ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ
ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｒｏｐ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｌａｎ－
ｃａｎｇ ｒｉｖｅｒ ｖａｌｅｙ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔ Ｒｅｓｏｕｒ Ｃｒｏｐ Ｅｖｏｌ，２００４，４８：
２９７－３０６．
［２］ Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｐ Ｓ，Ｘｉａ Ｙ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｆ－
ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｌ．（ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｔｅａ）ａｎｄ ｉｔｓ
ｗｉｌｄ ｒｅｌａｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｙｕｎｎａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｎａ，ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｍｏｒ－
ｐｈｏｌｏｇｙ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ａｌｏｚｙｍｅ ｓｔｕｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔ Ｒｅ－
ｓｏｕｒ Ｃｒｏｐ Ｅｖｏｌ，２００５，５２：４１－５２．
［３］ 闵天禄．山茶属茶组植物的修订［Ｊ］．云南植物研究，１９９２，
２：１１５－１３２．
［４］ 王新超，杨亚军，陈亮，等．构建茶树种质资源的核心种质
［Ｃ］．杭州：第三届全国青年茶学学术讨论会论文集，２００３：
１４－１９．
［５］ 周延清．ＤＮＡ分钟标记计数在植物研究中的应用［Ｍ］．北
京：化学工业出版社，２００５：１－３．
［６］ 孙雯雯，孙俊，周军永，等．枣ＩＳＳＲ反应体系的建立及其指
纹图谱构建［Ｊ］．安徽农业大学学报，２０１１，３８（６）：９４０－９４５．
［７］ 董海燕．利用ＩＳＳＲ标记构建红花橙木品种（品系）指纹图谱
［Ｄ］．南京：南京林业大学风景园林学院，２００９．
［８］ 郑姗，张立杰，张小艳，等．龙眼新品种（品系）的ＩＳＳＲ指纹
图谱研究初探［Ｊ］．福建农业学报，２０１２，２７（１２）：１３０８－
１３１２．
［９］ 汪斌，祁伟，祁建民，等．应用ＩＳＳＲ分子标记绘制红麻种质
资源ＤＮＡ指纹图谱［Ｊ］．作物学报，２０１１，３７（６）：１１１６－
ｌ１２３．
［１０］ 刘本英，孙雪梅，李友勇，等．２０个云南无性系茶树良种的
ＤＮＡ指纹图谱构建［Ｊ］．热带作物学报，２０１１，３２（４）：７２０－
７２７．
［１１］ 马瑞君，梅洪娟，庄东红，等．不同品种（系）凤凰单丛茶
ＤＮＡ指纹图谱的构建［Ｊ］．茶叶科学，２０１４，３４（５）：５１５－
５２４．
［１２］ 东林．慢捻细品峨毛茶［Ｊ］．普洱，２０１４，２：９２－９５．
［１３］ 季鹏章，张俊，王平盛，等．云南古茶树（园）遗传多样性的
ＩＳＳＲ分析［Ｊ］．茶叶科学，２００７，２７（４）：２７１－２７９．
［１４］ 姚明哲，陈亮，王新超，等．我国茶树无性系品种遗传多样
性和亲缘关系的ＩＳＳＲ分析［Ｊ］．作物学报，２００７，３３（４）：
５９８－６０４．
［１５］ 汪云刚，孙雪梅，李友勇，等．应用ＩＳＳＲ标记对茶树新品种
佛香茶亲本的鉴定［Ｊ］．西北农业学报，２０１１，２０（７）：１４９－
１５４．
［１６］ Ｐａｕｌｏ Ｊ Ｅ．Ｉｓｏｚｙｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｐｏｒｔｕｇｕｅｓｅ
ｍａｎｄａｒｉｎ＇Ｃａｒｖａｌｈａｉｓ＇ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ａｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｌｏｎｅ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎ－
ｔｉａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，１９９９，８２：１４５－１５２．
［１７］ 姚明哲，黄海涛，余继忠，等．ＩＳＳＲ在茶树品种分子鉴别和
亲缘关系研究中的适用性分析［Ｊ］．茶叶科学，２００５，２５（２）：
１５３－１５７．
［１８］ 骆文华，代文娟，刘建，等．广西火桐自然种群和迁地保护
种群的遗传多样性比较［Ｊ］．中南林业科技大学学报，２０１５，
３５（２）：６６－７１．
［１９］ Ｚｈａｏ Ｗ Ｇ，Ｍｉａｏ Ｘ Ｘ，Ｐａｎ Ｙ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｎ－
ｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｉｎ Ｃｈｉ－
ｎａ ｂｙ ＩＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｇｅｎｅｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ，２００６，３３（９）：
８５１－８６０．
［２０］ 郭长奎，罗淑萍．新疆主要玉米杂交种及亲本ＩＳＳＲ鉴定和
指纹图谱数据库的构建［Ｊ］．新疆农业科学，２００９，４６（１）：
３４－３９．
［２１］ 雷天刚，何永睿，陈善春，等．柑橘栽培品种（系）ＤＮＡ指纹
图谱库的构建［Ｊ］．中国农业科学，２００９，４２（８）：２８５２－２８６１．
（本文审稿：吴琦，陈盛相；责任编辑：巩艳红；英文编辑：徐振锋）
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