全 文 ：[制　　剂 ]
半边旗抗肿瘤有效成分 5F的纯化工艺研究
龚先玲 1 , 　陈志红 2 , 　吕应年1 , 　邓亦峰 1 , 　GeorgeG· Chen3 , 　梁念慈 1＊
(1.广东医学院 天然药物研究与开发重点实验室 ,广东 湛江 524023;2.广东医学院 分析中心 ,广东 湛江
524023;3.香港中文大学外科系癌症中心 ,香港)
收稿日期:2007-09-16
基金项目:国家自然科学基金(No.3987099),粤港科技合作基金项目(GHP/022/06)。
作者简介:龚先玲(1975-),女 ,硕士 ,助理研究员,主要从事天然药物化学的教学与研究工作。 0759-3863607;E-mail:xlgong@163.com
＊通讯作者:梁念慈 ,教授 ,博士生导师。电话:0759-2388501。
关键词:半边旗;5F;D101大孔吸附树脂;HPLC
摘要:目的:探索 D101大孔吸附树脂制备半边旗中抗肿瘤有效成分贝壳杉烷类二萜 5F的工艺。方法:以 HPLC为检测手
段 , 以 5F在浸膏中的含量为指标 ,比较甲醇和氯仿提取 5F的专属性;以 HPLC和 TLC为检测手段 ,考察 D101大孔吸附树
脂对 5F的吸附和洗脱条件。结果:半边旗药粉采用氯仿提取 ,制成含乙醇 20%的药液上柱后 , 先用 2BV30%的乙醇除去
极性杂质 , 再用 4BV60%的乙醇洗脱 ,得到质量分数为 32.25%的 5F。结论:建立了一种 5F的纯化工艺 , 并达到要求的
标准。
中图分类号:R284.2　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2008)09-1286-03
Purificationoftheantitumorcompound5FfromPterissemipinnataL.
GONGXian-ling1 , 　CHENZhi-hong2 , 　L Ying-nian1 , 　DENGYi-feng1 , 　GeorgeG· CHEN3 , 　LIANG
Nian-ci1＊
(1.GuangdongKeyLaboratoryforResearchandDevelopmentofNaturalDrugs, GuangdongMedicalColege, Zhanjiang524023 , China;2.Analysis
Center, GuangdongMedicalColege, Zhanjiang524023 , China;3.CancerCenter, SurgeryDepartment, ChineseUniversityofHongkong, Hongkong,
China)
KEYWORDS:PterissemipinnataL.;5F;D101 typemacroporousadsorptionresin;HPLC
ABSTRACT:AIM:Tostudythetechniqueforpurificationoftheantitumorcompound5F(11β -hydroxy-15-oxo-
16-ent-kaur-16-en-19oicacid)fromPterissemipinnataL.bymacroporousresin.METHODS:The5Fcontentin
extractbyHPLCwastakenasthemainstandardindex, bycomparisonof5Fextractionratebetweenmethanoland
chloroformandtheadsorptionandelutioncharactersofD101 typemacroporousadsorptionresinwereinvestigated.
RESULTS:32.25%of5FwasobtainedfromP.semipinnataL.bytheuseofchloroform, elutedby30% and
60% ethanol.CONCLUSION:Apurificationof5Fhasbeenestablishedandcomeuptotherequiredstandard.
　　半边旗 PterissemipinnataL.为凤尾蕨科凤尾蕨
属植物 ,广泛分布于长江以南和四川等地 [ 1] ,味苦 、
辛 ,性凉 ,具有清热 、解毒 、消肿等功效 [ 2] 。半边旗
中含有多种贝壳杉烷类二萜 [ 3-5] , 5F是其中的一种 ,
按 IUPAC命名规则 ,命名为 11β -hydroxy-15-oxo-16-
ent-kaur-16-en-19-oicacid,结构见图 1。 5F具有较
强的抗肿瘤作用 , 对多种瘤株具有体外抑制作
用 [ 3-6] ,对 S180荷瘤小鼠有体内抑制作用 [ 7] , 5F的抗
癌机理也是近年来研究的热点 [ 8-10] 。目前 ,用 D101
大孔树脂制备 5F的工艺有相关的文献报道 [ 11, 12] ,
但部分工艺参数尚不明确 ,为了优化 5F制备工艺参
数 ,为进一步研究 5F体内外抗肿瘤作用及其机理奠
定基础 ,本文对 5F的制备工艺进行了进一步的研
究。
1　仪器与试剂
Agilent1200高效液相色谱仪;瑞士梅特勒公
司 AE-240型电子分析天平。
甲醇为一级色谱纯 ,甲醇 、石油醚(60 ～ 90 ℃)
为分析纯 ,三蒸水;净品级 D101大孔吸附树脂为天津
海光化工有限公司产品 。
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图 1　5F的结构式
　　5F对照品(本课题组分离纯化 ,由日本东京理
科大学药学部和广东医学院医用生化研究所鉴
定)。半边旗药材于 2006年 12月采于广州市郊 ,由
苟占平博士鉴定 。
2　方法与结果
2.1　分析方法
2.1.1　HPLC法测定 5F的色谱条件:色谱柱为
ODSC18分析柱(25 mm×4.6 mm, 5μm);流动相为
甲醇-水(55∶45);检测波长 242 nm, 流速 1 mL/
min,柱温为 30 °C。
2.1.2　标准曲线的绘制:称取 5F10.7 mg,加甲醇
定容至 25 mL,作为对照品溶液。精密吸取对照品
溶液 1、2.5、5、10、15、20 μL依次进样 ,按照上述色
谱条件测定峰面积 , 5F的峰面积分别为 360.724 9,
850.197 6, 1 668.624 7, 3 004.309 1, 4 523.429 2,
6 187.564 9。以峰面积(Y)和质量(X)进行回归 ,求
得回归方程为 Y=704.619 4X+76.746 1, r=
0.999 5。结果表明 , 5F在 0.428 ～ 8.56μg范围内与
峰面积呈良好的线性关系 。
2.2　不同溶剂提取 5F的方法比较
取半边旗药材粉末 20.00 g,两份 ,分别用氯仿
和甲醇提取 ,加 10倍量的溶剂回流提取 2次 ,每次
3 h,过滤 ,合并滤液 , 得到氯仿提取物和甲醇提取
物 。取氯仿提取物 10 mL挥干溶剂 ,加 10 mL甲醇
超声溶解 ,过 0.45 μm的微孔滤膜 ,备用。取一定
量的甲醇提取物过 0.45 μm的微孔滤膜 ,备用 。按
上述色谱条件 ,标准品进样 5 μL,样品进样 10 μL。
色谱图见图 2。结果见表 1。
　　从表 1可以看出 ,用甲醇提取 5F, 5F对药材的
提取率稍高于氯仿提取 5F,但是 5F在氯仿浸膏中
的含量远远高于在甲醇浸膏中的含量;再者 ,用甲醇
提取的成分比较复杂(可能含大分子量的蛋白和多
糖),在实验过程中 ,甲醇浸膏制成含乙醇 20%的药
液很难过滤;由于 20%的药液呈混悬状态 ,离心也
比较困难 ,因此 ,从半边旗中提取 5F的溶剂选择氯
仿 。
图 2　5F对照品(A)、氯仿提取物(B)、甲醇
提取物(C)的 HPLC色谱图
1-5F(11β-hydroxy-15-oxo-16-ent-kaur-16-en-19-oicacid)
表 1　 采用不同溶剂提取半边旗中 5F的结果比较
提取所
用溶剂
20.00 g半边
旗药材中 5F
总质量 /mg
20.00 g半边旗
药材用不同溶剂
提取浸膏 /g
5F在浸
膏 中 含
量 /%
5F对药材
提取率 /%
甲醇 36.371 2.60 1.399 0.182
氯仿 28.595 0.85 3.364 0.143
2.3　药液的制备
称取一定量的半边旗粉末 ,加 10倍量的氯仿回
流提取 2次 ,每次 3 h,过滤 ,合并滤液 ,滤液浓缩至
干 ,加水悬浮 ,石油醚萃取 2次除去叶绿素等杂质
(石油醚萃取物经 TLC检测 ,无 5F)。萃取后的水
混悬物用旋转蒸发仪蒸掉石油醚 ,加一定量的水与
乙醇 ,过滤(滤渣经 TLC检测 ,无 5F),制成含乙醇
20%的药液(生药浓度 0.1 g/mL),备用 。
2.4　D101大孔吸附树脂的预处理
将 D101大孔吸附树脂用无水乙醇浸泡 24 h,倾
倒掉上层乙醇 ,然后加适量乙醇湿法装柱 ,待树脂装
好后 ,用乙醇 2BV/h通过树脂柱 ,至流出液加水不
呈白色为止 ,并用蒸馏水以同样的流速洗至无醇味 ,
用 20%的乙醇平衡大孔吸附树脂柱 ,备用 。
2.5　吸附容量的测定
按 2.4项方法处理 D101大孔树脂 4份 ,每份 30
mL,分别装入同样规格的玻璃柱(20 cm×2 cm)。
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取 970、1 000、1 030、1 060 mL半边旗药液 ,分别过
上述大孔树脂柱 ,再用 20%的乙醇 50 mL洗脱 ,收
集流出液 ,蒸干 ,加甲醇溶解 ,滤过。滤液置 5mL量
瓶中 ,加甲醇至刻度 。各吸取滤液 4 μL,分别点于
同一硅胶 HF254薄层板上 ,以石油醚-丙酮-乙酸(7∶
3∶0.05)为展开剂 ,展开 ,取出 ,晾干 ,在紫外灯下
检测 ,结果表明:药液与树脂的体积比为 323.3和
333.3时 ,未见明显的紫红色斑点;为 343.3时 ,隐
约出现紫红色斑点;为 353.3时 ,斑点明显。因此 ,
本实验采用药液与树脂的体积比为 333.3。
2.6　洗脱溶媒的选择
依次用 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、
90%乙醇各 50 mL,洗脱药液与树脂的体积比为
333.3的树脂柱 ,分别收集各洗脱液 ,每瓶收集 50
mL, HPLC检测 5F的含量 ,并计算结果 。以收集瓶
的编号(X)和 50mL5F的质量(Y)为坐标绘制洗脱
曲线 ,见图 3。
图 3　不同浓度乙醇洗脱液中 5F的质量
说明:X轴上 1代表用 30%乙醇洗脱时的收集液;X轴上 2代表用
40%乙醇洗脱时的收集液;X轴上 3代表用 50%乙醇洗脱时的收集
液;X轴上 4代表用 60%乙醇洗脱时的收集液;X轴上 5代表用 70%
乙醇洗脱时的收集液;X轴上 6代表用 80%乙醇洗脱时的收集液;X
轴上 7代表用 90%乙醇洗脱时的收集液
　　从以上洗脱曲线可以看出 ,半边旗 5F主要集中
在 50%和 60%乙醇洗脱液中 ,二者所占比例无显著
的差异 ,但 60%乙醇洗脱的解吸速度比 50%的快 ,
30%乙醇洗不出 5F。因此 , 确定洗脱溶媒为先用
30%乙醇洗去极性较大的杂质 ,再用 60%乙醇溶液
洗脱 5F,收集 60%乙醇洗脱部分。
2.7　洗脱溶媒的用量
根据上述结果确定的吸附容量和洗脱溶媒 ,吸
取半边旗药液 1 000 mL上柱 (生药浓度 0.1 g/
mL),用 30%乙醇 120mL洗脱 ,分段收集 ,每瓶收集
30 mL,每瓶收集液水浴蒸干 ,称重 ,结果见表 2;然
后再用 60%乙醇 180 mL洗脱 ,分段收集 ,每试管收
集 15mL, HPLC检测 5F的含量 ,并计算结果 ,结果
见表 3。
表 2　 30%乙醇洗脱的收集液中总固物的量
收集瓶编号 30mL收集液中的总固物 /mg
1 25.2
30%乙醇洗脱 2 10.5
的收集液 3 2.1
4 0
表 3　 60%乙醇洗脱 5F的考察结果
试管
编号
每试管中 5F
的质量 /mg
1000 mL药
液中 5F的质
量 /mg
每试管 5F占
总药液 5F的
含量 /%
5F对的
洗脱率 /%
1 6.774 3 4.74 4.74
2 25.900 4 17.49 22.23
3 32.683 8 22.89 45.09
4 33.723 3 23.59 68.68
5 11.638 0 142.975 8.14 76.82
6 8.879 0 6.21 83.03
7 4.261 0 2.98 86.01
8 2.229 4 1.56 87.57
9 1.470 9 1.03 88.60
　　从表 2结果可以看出 ,第 2瓶 30%乙醇洗脱的
收集液总固物量远远大于第 3瓶收集液总固物 ,因
此 , 30%的乙醇用量为 60 mL,即 2倍的柱体积。从
表 3结果可以看出 ,第 9试管中 5F占总药液 5F的
含量为仅 1.03%,而前 120mL(4BV)60%乙醇的洗
脱率大于 87%,证明 5F基本洗脱完毕 ,因此 , 60%
的乙醇用量为 120 mL,即 4倍的柱体积 。所以 ,确
定 2倍柱体积 30%乙醇和 4倍柱体积 60%乙醇组
合为最佳洗脱溶媒 。
2.8　工艺验证
根据最佳试验结果 ,按最佳优化条件进行 3次
实验 。取 D101 30 mL,按照 2.4项方法处理 , 另取
100.00g半边旗药材粉末 ,按 2.3项方法制备药液 ,
然后以流速 1mL/min上样 ,用 2BV30%乙醇洗柱 ,
弃取 30%乙醇洗脱的收集液 ,再用 60%乙醇 4 BV
洗柱 ,收集合并该部分收集液 ,经过 HPLC检测分
析 ,测得 3次 5F的平均纯度高达 32.25%。
3　讨论
非苷形式的萜类化合物具有较强的亲脂性 ,溶
于甲醇 、乙醇中 ,易溶于氯仿 、醋酸乙酯等亲脂性有
机溶剂中 [ 13] 。本实验选择甲醇 、氯仿两种提取溶
剂 ,对 5F在浸膏中的含量 、5F对药材的提取率等因
素进行考察 ,综合分析氯仿作为提取溶剂 , 5F在浸
膏中的含量高 、实验操作方便 。
由于 5F的极性小 ,难溶于水 ,为了提高 5F的溶
解度 ,因此 ,上柱的药液制成含乙醇 20%的药液 。
D101大孔树脂一般用于分离极性较大的苷类成
分 ,但它对 5F的吸附容量较大 , 60%的乙醇对 5F的
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洗脱能力达到 87%以上 ,制备工艺稳定 。用 D101大
孔树脂分离极性小的贝壳杉烯类二萜 5F,正是本文
的创新之处 。
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结肠定位盐酸小檗碱羧甲基魔芋胶小丸大鼠体内分布研究
张　瑜 1 , 　侯世祥 2＊
(1.河南大学 中药研究所 ,河南 开封 475004;2.四川大学华西药学院 ,四川 成都 610041)
收稿日期:2007-08-10
作者简介:张　瑜(1972-),男 ,副教授 ,博士 ,从事中西药物新型给药系统研究 ,电话:13569537621, Email:zy1219@henu.edu.cn
＊通讯作者:侯世祥(1943-),男 ,教授 ,博士生导师 ,从事中西药物新型给药系统和新制剂及其应用基础研究 ,电话:028-85502809, Email:
housix@ 263.net
关键词:盐酸小檗碱;羧甲基魔芋胶;分布;结肠定位给药系统
摘要:目的:评价盐酸小檗碱羧甲基魔芋胶小丸的结肠定位释药特性。方法:将盐酸小檗碱羧甲基魔芋胶小丸(小丸组)
和盐酸小檗碱羧甲基纤维素钠混悬液(对照组)大鼠灌胃给药(以盐酸小檗碱计 ,给药剂量为 50 mg/kg大鼠体重)后 ,于
规定时间间隔经大鼠股动脉取血 ,并取出胃 、小肠 、盲肠 、结肠组织及其内容物 , 采用高效液相法测定大鼠血浆和胃 、小
肠 、盲肠 、结肠组织及其内容物中药物浓度 ,绘制不同时间药物在各生物样品中分布相对百分比直方图 ,并计算药物相对
靶向释药指数。结果:小丸组给药后 ,在胃 、小肠及其内容物中药物分布始终低于对照组 ,而盲 、结肠及其内容物中的药
物分布开始低于对照组 , 2 ～ 6 h后高于对照组;与对照组相比 , 小丸组在大鼠胃 、小肠 、盲肠 、结肠组织及其内容物的相对
靶向释药指数值分别为 0.392 4, 0.478 6, 3.916, 4.193, 0.162 8, 0.619 4, 3.843, 4.087。结论:盐酸小檗碱羧甲基魔芋胶
小丸具有较好的结肠定位释药特性。
中图分类号:R969.1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2008)09-1289-05
Distributioninvivoofcolon-orientedberberinehydrochloride-carboxymethyl
konjacglucomannanpeletsinrats
ZHANGYu1 , 　HOUShi-xiang2＊
(1.InstituteofChineseMateriaMedica, HenanUniversity, Kaifeng475004 Henan;2.WestChinaSchoolofPharmacy, SichuanUniversity, Sichuan
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