全 文 ：基金项目:《中国药典 》2010年版标准研究(YZ-241)
作者简介:张东 ,男 ,实习研究员　　研究方向:中药化学及分析　　＊通讯作者:杨岚 ,女 ,硕士生导师 ,研究员　　研究方向:中药有效成分和
质量标准研究　　Tel/Fax:(010)64014347　　E-mail:ylan 66@yahoo.com.cn
·论　著·
中药紫萁贯众中紫萁酮的分离及含量测定
张东 ,厉博文 ,杨岚＊ ,付梅红 ,方婧(中国中医科学院中药研究所 ,北京 100700)
摘要:目的　建立中药紫萁贯众的含量测定方法。方法　用柱色谱法从紫萁贯众中分离紫萁酮 , 对紫萁酮 HPLC含量测定色
谱条件进行优选。结果　分离得到紫萁酮化学单体作为含量测定对照品 。含量测定采用 KromasilC18(4.6 mm×250 mm, 5
μm)色谱柱;乙腈-0.1%磷酸水(17∶83)为流动相;检测波长为 332 nm;流速为 1 mL· min-1。紫萁酮进样量在 1.62 ～ 324 ng
内与峰面积线性关系良好 , r=1.000 0, 平均加样回收率为 99.90%, RSD为 1.67%。 不同产地药材中含量为 0.026 7% ～
0.051 7%。结论　首次建立了中药紫萁贯众中紫萁酮的 HPLC含量测定方法 , 该方法能有效控制紫萁贯众药材的质量。
关键词:紫萁贯众;紫萁;紫萁酮;高效液相色谱法
中图分类号:R284　　　文献标志码:A　　　文章编号:1001-2494(2010)21-1612-03
IsolationandDeterminationofOsmundacetoneinOsmundaeRhizoma
ZHANGDong, LIBo-wen, YANGLan＊ , FUMei-hong, FANGJing(InstituteofChineseMateriaMedica, ChinaAcademy
ofChineseMedicalSciences, Beijing100700, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　TostudythequantitativedeterminationmethodforOsmundaeRhizoma(therhizomeofOsmundajaponi-
ca).METHODS　OsmundacetonewasisolatedfromOsmundaeRhizomawithsilicagelcolumnchromatography.HPLCwasusedto
determineosmundacetonecontentinOsmundaeRhizomaandtheoptimum conditionwaschosen.RESULTS　Osmundacetonewas
usedasreferencestandard.TheKromasilC18(4.6mm×250mm, 5 μm)columnwasusedinHPLC, andmobilephasewascomposed
ofacetonitrile-0.1% phosphoricacid(17∶83).Thedetectionwavelengthwasat332 nm.Theflowratewas1 mL· min-1.Thelinear
relationshipofosmundacetonewasintherangof1.62 -324 ng(r=1.000 0)andtheaveragerecoverywas99.90%(RSD=
1.67%).ThecontentsofosmundacetoneintheOsmundaeRhizomafromdiferentlocationswere0.026 7% -0.051 7%.CONCLU-
SION　TheHPLCmethodfordeterminingosmundacetoneinOsmundaeRhizomaisestablishedforthefirsttime.Itcanbeefectively
usedtocontrollthequalityofOsmundaeRhizoma.
KEYWORDS:OsmundaeRhizome;OsmundajaponicaThunb.;osmundacetone;HPLC
　　紫萁贯众为紫萁科植物紫萁(Osmundajaponica
Thunb.)的根茎及叶柄残基 。具有清热解毒 ,止血
的功效 。用于防治感冒 、鼻衄头晕 、痢疾 、崩漏 。为
传统中药贯众的主要商品流通品种之一。为将紫萁
贯众增补为 《中国药典 》品种 ,我们对其进行了系统
的化学成分和质量标准研究 ,所制订标准已纳入
2010年版《中国药典 》[ 1] 。
紫萁酮为紫萁贯众的专属性成分 ,且具有抗氧
化 [ 2]和杀伤癌细胞 [ 3]的药理活性 ,因此选择其作为
紫萁贯众定性和定量分析的对照品。本实验首次报
道了紫萁贯众中紫萁酮对照品的分离鉴定和含量测
定方法 。
1　仪器与试药
HP8453E紫外可见光谱仪 (Aglient公司 );
Aglient1200型高效液相色谱仪(Aglient公司);Shi-
madzu20A高效液相色谱仪(Shimadzu公司);超声
波清洗器(KQ-100,昆山超声仪器有限公司);微波
萃取仪(MDS-6, 上海新仪微波化学科技有限公
司);KromasilC18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)色谱
柱;DiamonsilC18 (4.6 mm ×250 mm, 5 μm)色谱
柱;AgilentEclipseXDBC18 (4.6 mm×250 mm, 5
μm)色谱柱;显微熔点仪(Kofler公司);Finnigan-
MAT-95质谱仪(Finnigan公司);INOVA-500核
磁共振仪(Varian公司)。乙腈 (色谱纯);石油醚 、
·1612· ChinPharmJ, 2010 November, Vol.45 No.21　　　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2010年 11月第 45卷第 21期
乙酸乙酯 、丙酮等(分析纯);体积分数 95%乙醇(医
用级);超纯水(Mili-QPlus纯水机)。
紫萁酮对照品(自制 ,经 UV, EI-MS, 1 H-NMR,
13C-NMR结构验证 ,经 HPLC面积归一化法纯度 >
99.5%,经 Aglient公司 ChemStation软件纯度检测
为单一峰);紫萁贯众药材采自不同产地 ,经中国中
医科学院中药研究所冯雪峰副研究员鉴定为紫萁科
植物紫萁(Osmundajaponica)的干燥带叶柄残基的
根茎 ,来源见表 1。
2　实验方法与结果
2.1　紫萁酮的分离和鉴定
取干燥的紫萁贯众药材粗粉 ,用 4倍量体积分
数 95%乙醇回流提取 4次 ,每次 2 h,滤过 ,合并滤
液 ,减压回收乙醇 ,得乙醇浸膏 。将浸膏以适量水稀
释 ,用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯萃取部分蒸干 ,硅
胶柱色谱分离 ,用石油醚-丙酮梯度洗脱 。收集石油
醚 -丙酮(7∶3)洗脱流分 ,再经硅胶柱色谱分离 ,以石
油醚-乙酸乙酯梯度洗脱。收集石油醚 -乙酸乙酯
(7∶3)洗脱流分 ,浓缩 ,经丙酮重结晶得橙黄色结
晶 ,经波谱分析及与文献数据对照鉴定 [ 4]为 3′, 4′-
二羟基苄叉丙酮 [ 4-(3′, 4′-Dihydroxyphenyl)-(E)-
3-buten-2-one)] ,为首次从紫萁贯众中分离得到 ,命
名为紫萁酮(osmundacetone)。
紫萁酮:橙黄色晶体。 mp176 ～ 178 ℃。 UV
(MeOH):220, 332 nm。 EI-MSm/z:178[ M] + , 162,
145, 135, 117, 89, 77, 43。分子式:C10 H10 O3。1 H-
NMR(500 MHz, CD3 OD)δ:2.26(3H, s, 1-H), 6.5
(1H, d, J=16 Hz, 3-H), 7.47(1H, d, J=16 Hz, 4-
H), 6.74(1H, d, J=8 Hz, 9-H), 6.94(1H, dd, J=
8.2 Hz, 10-H)。13C-NMR(125 MHz, CD3 OD)δ:27.0
(C-1), 201.5 (C-2), 123.5(C-3), 146.8 (C-4),
127.8(C-1′), 115.3(C-2′), 146.9(C-3′), 150.0(C-
4′), 116.0(C-5′), 124.8(C-6′)。
2.2　紫萁酮的 HPLC测定方法的建立
2.2.1　检测波长的选择　将紫萁酮单体用甲醇配
　　
表 1　不同产地紫萁贯众药材样品
Tab.1　SamplesofOsmundaeRhizomafromdiferentsource
BatchNo. Origin BatchNo. Origin
1 Jiangshan, Zhejiang 7 Pan′an, Zhejiang
2 Nanchang, Jiangxi 8 Hefeng, Hubei
3 Jinggangshan, Jiangxi 9 Yuanling, Hunan
4 Yichun, Jiangxi 10 Badong, Hubei
5 Enshi, Hubei 11 Jiujiang, Jiangxi
6 Jianshi, Hubei 12 Yi′en, Hubei
成浓度为 10 mg· L-1的溶液 ,经全波长扫描 ,最大
吸收波长在 332 nm。
2.2.2　HPLC测定色谱条件及系统适用性实验　
色谱条件:色谱柱 ,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充
剂(KromasilC18 , 4.6 mm×250 mm, 5 μm);流动
相 ,乙腈-0.1%磷酸水(17∶83);检测波长 , 332 nm;
流速 1.0 mL· min-1;柱温 , 35 ℃;进样量 , 10 μL。
理论板数按紫萁酮峰计算应不低于 5 000,两个相邻
色谱峰的分离度应大于 1.5。结果见图 1。
2.2.3　紫萁酮 HPLC测定方法学考察　①供试品
溶液的制备:在供试品溶液的制备过程中 ,分别以乙
醇 、体积分数 50%乙醇 、甲醇为提取溶剂 ,考察了加
热回流 、超声提取 、微波萃取 3种提取方法对紫萁贯
众中紫萁酮提取率的影响。结果表明 , 50%乙醇对
紫萁酮的提取效率最高 ,故以 50%乙醇作为供试品
溶液制备的提取溶剂。微波萃取法测定的含量明显
高于加热回流和超声提取法 ,故选用微波萃取法制
备供试品溶液 。
②优化后的供试品溶液制备方法:取紫萁贯众
粉末(30目)约 0.2 g,精密称定 ,置微波萃取密封罐
中 ,精密加入体积分数 50%乙醇 40mL,称定重量 ,微波
萃取提取 15 min[萃取温度为 170 ℃(压力约为 1.8
MPa)] ,放冷 ,再称定重量 ,用提取溶剂补足减失的重
量 ,摇匀 ,滤过 ,精密量取续滤液 ,作为供试品溶液。
③紫萁酮线性关系考察:精密称取紫萁酮对照
品 3.24 mg,用体积分数 50%乙醇定容至 100 mL,质
量浓度为 32.4 μg· mL-1。用体积分数 50%乙醇
依次稀释成质量浓度为 0.162 ～ 32.4 μg· mL-1的
一系列质量浓度的对照品溶液。分别吸取上述的对
照品溶液各 10 μL,按 “2.2.2”色谱条件进行测定。
　　
图 1　紫萁贯众药材中紫萁酮 HPLC色谱图
A-紫萁酮对照品;B-样品
Fig.1　HPLCChromatogramsofosmundacetoneinOsmundae
Rhizoma
A-osmundacetonereferencestandard;B-sample
·1613·中国药学杂志 2010年 11月第 45卷第 21期　　　　　　　　　　　 ChinPharmJ, 2010 November, Vol.45 No.21
以峰面积积分值为纵坐标 (Y),紫萁酮对照品进样
量为横坐标 (X)(ng), 绘制标准曲线 , 结果
Y=5.790 0x-0.331 6, r=1.000 0, 紫萁酮进样量
在 1.62 ～ 324 ng内与峰面积线性关系良好。定量
下限为 1.62 ng。
④精密度实验:精密吸取湖北宜恩县紫萁贯众
样品溶液重复进样 6次 ,测得紫萁酮的峰面积 RSD
为 0.38%。
⑤稳定性实验:取湖北宜恩县的紫萁贯众粉末
约 0.2 g,精密称定 ,照 “供试品溶液的制备”项下方
法处理 ,分别于 0, 1, 2 , 4, 12, 24 h测定供试品溶液
中紫萁酮的峰面积 ,并计算含量 。结果表明 ,在 24 h
内供试品溶液基本稳定 , RSD为 0.74%。
⑥重复性实验:取湖北宜恩县的紫萁贯众粉末
约 0.2 g,平行取样 6次 ,精密称定 ,照 “供试品溶液
的制备 ”项下方法处理 ,在 “2.2.2”项下的色谱条件
进行测定 ,结果紫萁酮含量的 RSD为 1.92%。
⑦加样回收率实验:取湖北宜恩县的紫萁贯众
粉末约 0.1 g,平行取样 6次 ,精密称定 ,照 “供试品
溶液的制备 ”项下方法处理 ,提取溶剂为体积分数
50%乙醇对照品溶液(精密称取紫萁酮对照品 4.58
mg,用体积分数 50%乙醇定容至 100 mL,精密量取
5 mL以体积分数 50%乙醇定容至 250 mL), 按
“ 2.2.2”项下色谱条件进行测定 ,计算回收率。结
果平均回收率为 99.90%, RSD=1.67%, n=6。
2.2.4　含量测定　分别取不同来源的紫萁贯众粉
末(30目)约 0.2 g,按 “供试品溶液的制备”项下方法
制备供试品溶液 , 在 “2.2.2”项下的色谱条件进行测
定 ,以外标两点法计算紫萁酮的含量 ,结果见表 2。
3　小结与讨论
本实验首次从紫萁贯众中分离鉴定了紫萁酮 ,
以紫萁酮为对照品的紫萁贯众药材薄层鉴别方法已
被 2010年版《中国药典》收载;曾用 HPLC测定药材
　　
表 2　不同来源紫萁贯众药材中紫萁酮的含量测定结
果 .n=2
Tab.2 　 Contents of osmundacetone in Osmundae
Rhizoma.n=2
BatchNo. Contents/% BatchNo. Contents/%
1 0.041 7 7 0.033 8
2 0.037 7 8 0.038 4
3 0.034 3 9 0.033 4
4 0.051 7 10 0.031 8
5 0.026 7 11 0.044 8
6 0.031 5 12 0.036 9
(湖北宜恩县)中紫萁酮含量 ,因采用常规的加热回
流 [考察了 0.5, 1, 2 , 3 , 4 , 5 h,含量逐渐增加 ,最高
含量为加热回流提取 5 h(0.006 3%)]和超声提取
(考察了 1 h,含量为 0.001 1%)2种方法 ,紫萁酮的
提取率均很低 ,导致测定结果不准确 ,而未能收入标
准。本实验采用微波萃取法 ,考察了不同提取条件
对紫萁酮提取率的影响 ,结果在萃取温度为 170 ℃
(压力约 1.8 MPa)条件下 ,提取 15 min,紫萁酮的提
取率最高(0.036 9%),为常规提取方法的 5倍以
上 ,经方法学考察建立了以紫萁酮为对照品紫萁贯
众药材含量测定方法 ,并测定了 12批不同产地紫萁
贯众药材的紫萁酮含量 ,结果含量在 0.026 7% ～
0.051 7%之间 ,暂定紫萁贯众药材中紫萁酮的含量
为不低于 0.03%。本实验结果对于提高 《中国药
典》中紫萁贯众药材及其相关制剂的质量标准具有
参考价值 。
分析微波萃取法提取效率高的主要原因可能
为:①微波透过溶剂直接到达植物物料内部维管束
和腺细胞内 ,使细胞内温度突然升高 ,连续的高温使
其内部压力超过细胞空间膨胀的能力 ,从而导致细
胞破裂 ,细胞内的物质自由流出 ,传递到周围被溶
解 ,这一原理使得紫萁酮被更高效率的提取。 ②微
波萃取所用提取容器是密闭的 ,随着温度的升高 ,其
内部的压力也逐渐升高 ,从而能得到更高的温度 ,在
高达 170 ℃的提取条件下 ,紫萁酮能够更好的溶出。
微波萃取法对热稳定性好但难溶出中药成分的提取
是一种较好的选择 。
本实验考察了 KromasilC18(4.6 mm×250 mm,
5 μm)色谱柱 , DiamonsilC18(4.6 mm ×250 mm, 5
μm)色谱柱 , AgilentEclipseXDBC18(4.6 mm ×250
mm, 5 μm)色谱柱在 Agilent1200, Shimadzu20A高
效液相色谱仪上的分离效果 ,结果紫萁酮的分离不
受影响 ,含量结果没有差异。
REFERENCES
[ 1] 　Ch.P(2010)VolⅠ (《中国药典 》 2010年版 .一部)[ S].
2010:232.
[ 2] 　NAKAJIMAY, SATOY, KONISHIT.Antioxidantsmallphenolic
ingredientsinInonotusobliquus(persoon)pilat(chaga)[ J] .
ChemPharmBul, 2007, 55(8):1222-1226.
[ 3] 　NAKAJIMAY, NISHIDAH, MATSUGOS, etal.Cancercelcy-
totoxicityofextractsandsmallphenoliccompoundsfromChaga
[ Inonotusobliquus(persoon)Pilat] [ J].JMedFood, 2009, 12
(3):501-507.
[ 4] 　MOSY, YANGYC, SHIJG.Studiesonchemicalconstitutesof
Phelinusigniarius[ J] .ChinTraditHerbalDrugs(中草药),
2004, 35(10):1095-1097.
(收稿日期:2010-06-10)
·1614· ChinPharmJ, 2010 November, Vol.45 No.21　　　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2010年 11月第 45卷第 21期