全 文 ：329
响应面法优化紫萁多糖提取工艺
及体外抗癌活性研究
林 薇，李巧凤，陈 晔，詹寿发*
(九江学院药学与生命科学学院，江西九江 332000)
收稿日期:2016－05－06
作者简介:林薇(1995－) ，女，大学本科，研究方向:天然植物的开发与利用，E－mail:artemislyn@ 163.com。
* 通讯作者:詹寿发(1964－) ，男，副教授，研究方向:天然植物的开发与利用，E－mail:zhan9630@ 126.com。
摘 要:本文意在优化紫萁多糖的提取工艺，并探讨紫萁多糖对癌细胞的作用。以超声－微波协同萃取为方法，料液
比、微波功率和提取时间为考察因素，在单因素实验的基础上，设计响应面 Box－Benhnken 中心组合实验，对紫萁多糖
提取工艺参数进行优化，得到优化紫萁多糖的提取条件:料液比 1∶ 35(g /mL) ，微波功率 353 W，提取时间 250 s时，紫
萁多糖的提取率为 0.236%。以体外细胞毒性实验方法研究紫萁多糖对 HepG－2 癌细胞的抑制作用，当紫萁多糖浓度
为 0.001 mg /mL时，对 HepG－2 癌细胞的抑制率为 18.13%，在 10 mg /mL时抑制率为 72.65%，IC50值为 0.474 mg /mL。
关键词:紫萁，水溶性多糖，响应面法，抑癌率
Optimization of extraction of polysaccharides
from Osmunde japonica leaves by response surface
methodology and their inhibitory effects on tumor
LIN Wei，LI Qiao－feng，CHEN Ye，ZHAN Shou－fa*
(School of Pharmacology and Life Sciences，Jiujiang University，Jiujiang 332000，China)
Abstract:The study was to explore the optimum processes of extraction polysaccharides from Osmunda japonica
leaves and the effect of Polysaccharides on cancer cells.Using the ultrasonic microwave synergistic extraction，
solid－ liquid ratio，microwave power and extraction time as factors，based on the single factor experiment，the
response surface methodology(ＲSM)Box－Benhnken center combination experimental design was employed to
optimize the extraction of polysaccharides of Osmunda japonica.The results of optimum extraction conditions were
as follow:the solid－ liquid ratio was 1∶ 35(g /mL) ，microwave power 353 W，extraction time was 250 s.Under these
conditions，the extraction yield was 0.236% . According to the Cytotoxicity test，the inhibitory effect of
polysaccharides from Osmunda japonica on the HepG－2 cancer cells had been studied.The results of cytotoxicity
test indicated that the concentration of polysaccharides were 0.001 mg /mL，10 mg /mL separately，the inhibition
rate was 18.13%，72.65% respectively.The vaule of IC50 was 0.474 mg /mL.
Key words:Osmunda japonica;water－ soluble polysaccharides;response surface methodology(ＲSM) ;inhibition
rate
中图分类号:TS255.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2016)24－0329－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2016． 24． 055
紫萁(Osmunda japonica)为紫萁科多年生草本蕨
类植物，嫩叶干品可食，称为薇菜，含有丰富的维生
素、蛋白质、氨基酸［1］、多糖、黄酮、鞣酸［2］、无机盐等
多种人体所需营养成分，具清热解毒、润肺理气、补
虚舒络、止血、安神、降压、解热之功效［3］，主要活性成
分是多糖和黄酮类化合物。多糖存在于植物体中，
有广泛的生物学活性和功能，如抗衰老、抗菌［4］、降血
糖［5］等。人们逐渐认识到植物多糖不仅能作为能量
资源和结构材料，更重要的是植物活性多糖参与了
生命现象中细胞的各种活动［6］，多糖在抗肿瘤［7］、抗
病毒、抗辐射方面的作用引起了人们的关注。
国内外学者对紫萁多糖功能活性进行了相关研
究，戴金凤、陶海南等［8－9］对紫箕的水溶性多糖进行
了提取研究，并运用气相色谱测定了紫萁单糖由葡
萄糖、甘露糖、木糖和半乳糖组成，同时也证明紫萁
水溶性多糖的抑菌作用是广谱性的，而且紫萁水溶
性多糖在抗菌消炎的同时，具有止痛、生肌和护肤等
功效;周仁超［10］也证明了紫萁多糖具有一定抑菌活
性，特别对金色葡萄球菌和痢疾杆菌抑菌效果明显;
许文涛［11］用 FAＲP 法测定了紫萁多糖的抗氧化活
330
性，结果表明紫萁多糖具有较好抗氧化活性;此外，
Takashi 等［12］曾从幼小紫萁叶中提取分离出一种具
有血细胞凝集抑制作用的蛋白聚糖，这种蛋白聚糖
对血型 H有活性。但有关紫萁多糖抗肿瘤活性鲜见
报道。
目前，有的学者分别以乙醇、水为溶剂，采用水浴
浸提取法进行紫萁多糖提取，提取时间分别为 2～6 h，
提取温度为 90～100 ℃［13－14］，该方法提取时间长，提
取温度高;张钟等［15］以水为溶剂采用微波辅助提取
技术从紫萁中提取多糖，在微波强度为 539 W 的条
件下提取 35 s，虽然提取时间较短，但微波功率较高。
而超声微波协同提取技术作为一种新兴的样品前处
理方法，具有快速、高效、安全、提取时间短［16］、提取
效率高［17］、重现性好及目标物损失少等优点，已在天
然产物活性成分研究领域广泛应用。有关超声微波协
同提取技术在紫萁多糖提取工艺方面研究鲜见报道。
本实验以提取时间、微波功率、液料比为实验因素，采
用响应面法优化紫萁水溶性多糖的超声－微波协同萃
取工艺，并通过细胞毒性实验研究其对 HepG－2 癌细
胞的体外抗癌活性，为紫萁多糖研究与利用提供
参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
紫萁 2015 年 6 月在江西庐山采集紫萁新鲜植
株，太阳下晒干后取紫萁叶在干燥箱中烘干，将干燥
的紫萁叶用粉碎机粉碎，过 40 目筛，贮于密封袋放
入冰箱备用;HepG－2 细胞 中国科学院生物化学研
究所提供;葡萄糖，Sevage 试剂［氯仿(V)∶ 正丁醇
(V)= 4∶ 1］，3－(4，5－二甲基噻唑－2)－2，5－二苯基
四氮唑溴盐(MTT) Sigma－Aldrich公司;ＲPMI 1640
培养基和胰蛋白酶－EDTA 基诺生物技术公司;胎
牛血清(FBS) 杭州四季青生物工程材料有限公司。
CW－2000 超声－微波协同萃取仪 新拓分析仪
器科技有限公司;BSA124S 电子天平 赛多利斯科
学仪器有限公司;TDL－ 40B 低速台式大容量离心
机 上海安亭科学仪器厂;721 可见光分光光度
计 天津普瑞斯仪器有限公司;AE31 倒置生物显微
镜 麦克奥迪实业集团有限公司;酶标仪 美国伯
腾仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 水溶性紫萁多糖的提取和精制 称取紫萁叶
粉末 2.00 g(M)加去离子水，使用超声－微波协同提
取仪提取紫萁多糖，4000 r /min 离心 15 min 得上清
液，加入 3 倍体积 95% 冰乙醇，置冰箱过夜后
4000 r /min离心 15 min，沉淀即为紫萁粗多糖。
Sevage法脱蛋白 2 次，将脱蛋白后的多糖溶液按体积
比 1∶ 3加入 95%乙醇溶液，沉淀得紫萁多糖(m)。
1.2.2 水溶性紫萁多糖检测方法
1.2.2.1 葡萄糖标准曲线的制作 采用苯酚－硫酸法
测定样品中的多糖［18］。准确称取 10 mg 经烘干的葡
萄糖，用蒸馏水溶解并定容至 100 mL(浓度为
100 μg /mL)。分别吸取上述溶液 0、0.1、0.5、0.9、1.3、
1.8 mL加入试管中，每管用蒸馏水定容至 2 mL，配制
成系列标准葡萄糖溶液，各管加 1.0 mL 6%苯酚溶
液，再加入浓硫酸 5.0 mL，静置 10 min，30 ℃水浴
15 min，于 490 nm 处测定各管 OD 值，以糖含量
(μg /mL)为横坐标，OD 值为纵坐标绘制标准曲线，
得到葡萄糖含量 x 与吸光度 y 的回归方程为 y =
13.088x + 0.01885(Ｒ2 = 0.999) ，表明葡萄糖在 10 ～
100 μg /mL质量范围浓度内线性关系良好。
1.2.2.2 紫萁多糖的测定 将脱蛋白后的紫萁多糖
用去离子水溶解定容至 100 mL，摇匀，从中移取
2.5 mL于 25 mL容量瓶，加去离子水至刻度。取样液
2.0 mL于具塞试管中，加入 6%苯酚溶液 1.0 mL，再
加入浓硫酸 5.0 mL，按标准曲线制作相同的方法进
行多糖测定，按下式计算样品中紫萁多糖的提取率:
提取率(%)= mM × 100
式中:m为提取到的紫萁多糖质量，g;M 为紫萁
叶粉末的质量，g。
1.2.3 单因素实验 在开启超声波(50 W/40 KHz)
的条件下，固定微波功率 150 W，料液比 1∶ 20，考察
不同提取时间 60、120、180、240、300、360 s 对紫萁多
糖提取率的影响;固定提取时间 180 s，料液比 1∶ 20，
考察不同微波功率 100、150、200、250、300、350 W 对
紫萁多糖提取率的影响;固定提取时间 180 s，微波功
率 150 W，考察不同料液比 1∶ 20、1∶ 30、1∶ 35、1 ∶ 40、
1∶ 45、1∶ 50 g /mL对紫萁多糖提取率的影响。
1.2.4 Box－Benhnken中心组合实验设计 在单因素
实验的基础上，采用 Box－Benhnken 实验设计，以提
取时间、微波功率、料液比为自变量，紫萁多糖提取
率为响应值，建立紫萁多糖提取工艺条件的二次模
型。因素水平见表 1。
表 1 紫萁多糖提取工艺响应曲面因素和水平
Table 1 Factors and levels in the response surface design
因素
水平
+ 1 0 － 1
A提取时间(s) 300 240 180
B微波功率(W) 400 350 300
C料液比(g /mL) 1∶ 40 1∶ 35 1∶ 30
1.2.5 紫萁水溶性多糖抑癌实验
1.2.5.1 紫萁多糖溶液的配制 精密称取 250 mg 已
精制的多糖，溶于 10 mL 的 5%的葡萄糖等渗溶液，
涡旋 10 min 左右，加入 10 mL 含有胎牛血清和双抗
的 1640 培养液，再加入 40 μL(0.2%，v /v)的二甲基
亚砜，继续涡旋10 min左右，充分溶解后过0.45 μm水
膜，用 1640培养液定容到 25 mL，即为含 10 mg /mL紫
萁多糖母液。用 1640 培养液稀释成 0.001、0.01、
0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5、10 mg /mL的系列紫萁多糖
溶液(使用时配制)。
1.2.5.2 细胞培养 人肝癌 HepG－2 细胞培养于含
10%胎牛血清的 ＲPMI 1640 培养基中，在 5% CO2 培
养箱内 37 ℃ 培养传代，取对数生长期细胞用于
实验。
1.2.5.3 MTT法测细胞增殖抑制率 取传代 3～4 代
的对数生长期 HepG－2细胞用胰酶消化，洗涤、离心后
331
将其制备成细胞悬液(5.0 × 104 个 /mL) ，取 200 μL接
种于 96 孔板中(1.0 × 104个 /孔)。将细胞培养板置
于 37 ℃细胞培养箱中，在 5% CO2 条件下孵育 24 h，
显微镜下观察可见细胞贴壁生长，吸掉培养液，加入
浓度分别为 0.001、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5、
10 mg /mL的紫萁多糖溶液 200 μL，以细胞空白和溶
剂空白为对照。继续培养 48 h 后，换无血清的培养
液，每孔加入 5 mg /mL 的 MTT 30 μL 继续培养 4 h
后，吸去原培养液，每孔加入 200 μL 的 DMSO 溶解
结晶，用酶标仪于 570 nm 处测定其吸光度，计算不
同浓度下的细胞存活率。上述实验，每个浓度设 8
个复孔，每组重复 3 次。
细胞存活率(%)=
A1 －A0
A2 －A0
× 100
式中:A1 为实验组吸光度;A2 为细胞空白组吸光
度;A0 为溶剂空白组吸光度。
1.2.6 数据处理 采用 Origin7.5 软件作图，Design－
expert 8.0.6 软件进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 提取时间对多糖提取率的影响 微波功率
150 W，料液比 1∶ 20 时，随着提取时间的增加，多糖
提取率呈现先升高后下降的趋势，图 1 所示。当提
取时间超过 240 s 时，多糖提取率呈下降趋势，原因
可能是时间过长导致多糖水解程度增大，选取提取
时间为 240 s。
图 1 提取时间对对紫萁多糖提取率的影响
Fig.1 Effect of extraction time on the yield of
polysaccharides of Osmunda japonica
2.1.2 微波功率对多糖提取率的影响 提取时间
180 s，料液比 1∶ 20 时，随着微波功率的增加，多糖提
取率呈现先升高后下降的趋势，图 2 所示。当微波
功率超过 350 W时，多糖提取率会下降，原因可能是
过高的功率破坏多糖的结构使其分解，造成多糖的
损失。另外，过高的功率可能引起爆沸，也引起一定
程度的损失，选取微波功率为 350 W。
2.1.3 料液比对多糖提取率的影响 提取时间 180 s，
微波功率 150 W时，随着料液比的增加，多糖提取率
呈现先升高后下降的趋势，图 3 所示。当料液比
(g /mL)超过 1∶ 35 时，多糖提取率会下降，原因可能
是随着溶剂用量的增大，出现了暴沸的现象导致不
能持续加热，同时部分提取液也会冲上冷凝管造成
损失，选取料液比为 1∶ 35。
图 2 微波功率对紫萁多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of microwave power on the yield of
Polysaccharide from Osmunda japonica
图 3 料液比对紫萁多糖提取率的影响
Fig.3 Effect of solid－liquid ratio
on the yield of Polysaccharides from Osmunda japonica
2.2 响应曲面实验结果与分析
2.2.1 响应曲面实验设计及结果 利用 Design －
Expert V8.0.6 软件，采用 Box－Behnken 设计响应曲面
实验方案，以提取时间(A)、微波功率(B)和液料比
(C)为自变量，根据单因素实验结果，按表 1 中的因
素、水平进行实验设计，结果见表 2。
表 2 响应曲面设计与实验结果
Table 2 Ｒesponse surface design
arrangement and experimental results
实验号 A B C Y多糖提取率(%)
1 0 － 1 － 1 0.149954
2 － 1 0 1 0.141149
3 0 1 － 1 0.172830
4 － 1 0 － 1 0.129635
5 0 0 0 0.239358
6 0 1 1 0.113041
7 0 0 0 0.239358
8 1 0 － 1 0.108300
9 － 1 1 0 0.055674
10 0 0 0 0.242067
11 1 － 1 0 0.105252
12 0 0 0 0.241390
13 1 0 1 0.193979
14 0 － 1 0 0.124556
15 － 1 － 1 0 0.166887
16 0 0 0 0.248840
17 1 1 0 0.198381
332
表 3 拟合二次多项式模型的方差分析
Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p值
模型 0.0052000 9 0.0057900 8.7500 0.0046
A 0.0015840 1 0.0015840 2.3900 0.1658
B 0.0000056 1 0.0000056 0.0085 0.9290
C 0.0000180 1 0.0000180 0.0270 0.8736
AB 0.0100000 1 0.0100000 15.7700 0.0054
AC 0.0013750 1 0.0013750 2.0800 0.1927
BC 0.0002957 1 0.0002957 0.4500 0.5254
A2 0.0120000 1 0.0120000 18.3700 0.0036
B2 0.0140000 1 0.0140000 20.6000 0.0027
C2 0.0086000 1 0.0086000 12.9900 0.0087
残差 0.0046340 7 0.0006621 100.1000 0.0003
失拟性 0.0045730 3 0.0015240
纯误差 0.0060920 4 0.0000152
总差 0.0570000 16
Ｒ2 = 0.9183 Ｒ2Adj = 0.8133
利用 Design－Expert V8.0.6 软件对实验结果进行
回归拟合，得到紫萁多糖提取率对以上 3 个因素的
二次多项回归模型:Y (%) = 0.24 + 0.014A －
0.0008403B + 0.001501C + 0.051AB + 0.019AC －
0.008598BC－0.054A2－0.057B2－0.045C2。对该模型进
行方差分析，结果见表 3。由表 3 可知，该模型具有
高度显著性(p ＜ 0.01) ，失拟项不显著(p = 0.6335) ，
Ｒ2Adj = 0.8133，Ｒ
2 = 0.9183，信噪比为 8.75，远大于 4，可
知回归方程拟合度和可信度均较高，能够用此模型
对紫萁多糖提取率进行分析与预测。进行回归方程
系数显著性检验，结果表明提取时间与微波功率交
互项(AB)和提取时间二次项(A2)、微波功率二次项
(B2)、料液比二次项(C2)的影响达到极显著(p ＜
0.01) ，各因素对响应值显著性排序为 A ＞ C ＞ B。
2.2.2 响应曲面分析与优化 响应曲面是优化存在
多因素影响实验条件的寻优方法，通过固定数量的
实验次数可以连续的对实验因素进行分析，并得到
直观的 3D 曲面图进而评价各因素间的交互作用。
根据回归分析的结果，做出模型的响应曲面图，结果
如图 4～6 所示。根据二次模型所做的响应曲面可评
价实验因素对紫萁多糖得率的交互作用，以及确定
各因素的最佳水平。
从图 4～6 中的响应曲面及其等高线可以看出，
紫萁多糖提取率受提取时间、微波功率和料液比的
共同影响。图 4～6 所示为当固定提取时间、微波功
率、料液比任一因素为为零水平时，其余两个因素间
的交互作用及对多糖提取率的影响。紫萁多糖提取
率随其中任意两个变量的增加均呈上升趋势，达到
某一定值时，曲面稍下降或趋于平缓。其中，提取时
间和微波功率的交互作用较大，而微波功率和液料
比、液料比和提取时间的交互作用小。
通过对回归模型求解方程，得出紫萁多糖的最
佳提取工艺条件为提取时间 250.21 s，微波功率
353.31 W，料液比 1∶ 35.23(g /mL)。此条件下紫萁多
糖最大提取得率的理论计算值为 0.243%。
图 4 微波功率和提取时间对提取率交互影响的三维曲面图
Fig.4 Ｒesponse surface diagram and contour plot for yield of
crude Polysaccharides as a function of
microware power and extraction time
图 5 料液比和提取时间对提取率交互影响的三维曲面图
Fig.5 Ｒesponse surface diagram and contour plot for yield of
crude polysaccharides as a function of
solid / liquid ratio and extraction time
2.2.3 验证实验 为检验实验模型的可靠性，采用
上述工艺条件进行紫萁多糖的提取实验，同时考虑
到实际操作的可行性，将实验条件定为:提取时间
250 s，微波功率为 353 W，料液比为 1∶ 35(g /mL) ，在
此条件下提取 4 次，实际测得的平均提取率为
0.236%，与理论预测值相比，相对误差约为 0.004%。
(下转第 341 页)
341
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99－103.
(上接第 332 页)
图 6 微波功率和料液比对提取率交互影响的三维曲面图
Fig.6 Ｒesponse surface diagram and contour plot for yield of
crude polysaccharides as a function of
microware power and solid / liquid ratio
因此，采用响应曲面法优化得到的提取参数准确可
靠，具有实用价值。
2.3 水溶性紫萁多糖抑制癌细胞增殖
统计不同浓度紫萁水溶性多糖溶液培养下的癌
细胞存活率及标准差，随着多糖浓度的上升，癌细胞
的存活率迅速下降，计算 IC50值为 0.474 mg /mL，见图
7。多糖浓度为 0.001 mg /mL 时，抑制率为 18.13%;
当浓度为 10 mg /mL 时，对癌细胞的抑制率达
到 72.65%。
图 7 紫萁多糖对 HepG－2 细胞存活率的影响
Fig.7 The polysaccharides of Osmunda japonica
on HepG－2 effect of cell survival
本实验初步证实紫萁中提取的水溶性多糖具有
较强的抗癌活性，但其抗癌作用的机制和免疫活性
的机理有待进一步的探索。
3 结论
在单因素实验的基础上，采用 Box－Behnken 实
验，优化得到紫萁水溶性多糖提取的最佳工艺:提取
时间 250 s、微波功率 353 W、料液比 1 ∶ 35(g /mL)。
在此模型下，理论提取率为 0.243%，实测提取率为
0.236%。与理论预测值相比，相 对 误 差 约 为
0.004%。细胞毒性实验结果显示，随着紫萁多糖浓
度的上升，癌细胞的存活率迅速下降，IC50 值为
0.474 mg /mL。当多糖浓度为 0.001 mg /mL 时，对
18.13%的癌细胞有抑制能力;当浓度为 10 mg /mL
时，癌细胞的抑制率达到了 72.65%，表明紫萁多糖具
有较强的抗癌活性，但其抗癌作用的机制和免疫活
性的机理还需进一步的探究。
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