全 文 ：摘 要：采用活性追踪分离的方法，综合运用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析等，从
红树尖瓣海莲（Bruguiera sexangula var. rhynchopetala）来源的一株青霉属真菌 Penicillium sp.
（3126）的发酵产物中分离鉴定了 5个化合物.根据理化性质和 NMR波谱方法等，并通过与文献
对照，鉴定出化合物的结构分别为：麦角甾-22-烯-3β-醇（ergosta-22-triene-3β-ol）（1）,麦角
甾-5,7,22-三烯-3β-醇（ergosta-5,7,22-triene-3β-ol）（2）,过氧化麦角甾醇（ergosterol peroxide）
（3）,对羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoic acid）（4）和对羟基苯甲醛 (4-hydroxybenzaldehyde)（5）.以上
化合物均为首次从尖瓣海莲内生真菌中分离得到.活性测试表明，甾体类化合物 1、苯衍生物 4
和 5都具有较强的卤虫致死活性.
关键词：尖瓣海莲来源真菌；次级代谢产物；结构鉴定；卤虫致死活性
中图分类号：R 284.1 文献标识码：A 文章编号：1674-4942（2013）04-0406-04
唐雄肇 1，黄国雷 1，周学明 1，2，李小宝 1，2，陈光英 1，2，郑彩娟 1，2*
Abstract：Under the guidance of bioassay, column chromatography on silica gel and Sephadex LH-20 were used to iso⁃
late and purify the metabolites from the fermentation products of Penicillium sp. (3126), a fungus was obtained from a
manBruguiera sexangula var. rhynchopetala grove. The structures of the isolated compounds were identified by spectro⁃
scopic analysis including NMR, and by comparison with the data of literature. Five compounds were isolated from the
EtOAc extracts of 3126, and their structures were identified as ergosta-22-triene-3β-ol (1), ergosta-5,7,22-triene-3β-
ol (2), ergosterol peroxide (3), 4-hydroxybenzoic acid (4) and 4-hydroxybenzaldehyde (5). All compounds were isolated
from the fungus, which were isolated from the medicinal mangrove Bruguiera sexangula var. rhynchopetala for the first
time. Compounds 1, 4 and 5 exhibited strong lethality to brine shrimp Artemia salina.
Key words:Bruguiera sexangula var. rhynchopetala-derived fungus；secondary metabolites；structural identification；
lethality to brine shrimp Artemia salina
Secondary Metabolites and their Antibacteria of a Medicinal
Mangrove Bruguiera sexangula var. rhynchopetala-derived
Fungus Penicillium sp.
TANG Xiongzhao1，HUANG Guolei1，ZHOU Xueming1，2，LI Xiaobao1，2，
CHEN Guangying1，2，ZHENG Caijuan1，2*
一株红树尖瓣海莲内生真菌Penicillium sp.
次级代谢产物及其生物活性研究
（1.海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571158；
2.海南师范大学 热带药用植物省部共建教育部重点实验室，海南 海口 571158）
（1. Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou 571158，China；
2. Key Laboratory of Tropical Medicinal Plant Chemistry of Ministry of Education，
Hainan Normal University，Haikou 571158，China）
第26卷第4期 海南师范大学学报（自然科学版） Vol.26 No.4
2013年12月 Journal of Hainan Normal University（Natural Science） Dec.2013
收稿日期:2013-07-23
基金项目:海南省自然科学基金 (213021)；海南师范大学博士科研启动基金项目
*通讯作者
红树林生态系统处于热带、亚热带的海陆交界
处，长年受高强光照射，且高盐度的生境又使红树
根部长期处于缺氧状态；特殊的生长环境使红树植
物体内富含特殊的内生微生物.近几十年来，从红
树植物内生微生物的发酵产物中分离具有多种生
物活性且骨架新颖的次级代谢产物，已成为海洋天
然产物研究的热点之一 [1-4].药用红树尖瓣海莲为
海南特有植物，目前未见其内生真菌次级代谢产物
与生物活性的报道，本文为对尖瓣海莲内生真菌的
次级代谢产物及生物活性的首次报导.本研究组从
采自中国南海东寨港红树林保护区的红树尖瓣海
莲（Bruguiera sexangula var. rhynchopetala）中分离
获得一株青霉属真菌Penicillium sp.（3126），其发酵
液的乙酸乙酯提取物对卤虫Artemia salina显示强
的致死活性，对其次级代谢产物进行活性追踪分
离，获得 5个化合物，包括 3个甾体类化合物（1-
3）和 2个苯衍生物（4-5）.以上化合物均为首次从
尖瓣海莲内生真菌中分离得到，且对所得的化合物
都进行了卤虫致死活性测定.
1.1 仪器与试剂
Bruker AV400MHz 超导核磁共振仪（瑞士
Bruker 公司）；洁净工作台（苏净集团安泰公司）；
Sephadex LH-20（Phar-macia公司）；BSZ-100自动
部分收集器（上海青浦沪西仪器有限公司）；EYE⁃
LA COOLACE CA-IIII冷却水循环装置（日本东京
理化有限公司），旋转蒸发仪（日本东京理化有限公
司），24孔板.石油醚（沸程 60-90 ℃）、氯仿、乙酸
乙酯、甲醇等均为国产分析纯，乙醇（95%）为国产
食品级，薄层硅胶 GF254和柱色谱硅胶（200-300
目）均为青岛海洋化工厂
1.2 菌株的分离与筛选
1.2.1 菌株的分离与培养
1.2.1.1 样品来源
尖瓣海莲（B. sexangula var. rhynchopetala）于
2008年 9月采自中国东寨港红树林保护区.对从
中分离获得的一株红树内生真菌，结合形态、生理
生化特征，确定其为青霉属真菌 Penicillium. sp.
（3126）.该菌株现保藏于海南师范大学热带药用植
物化学教育部重点实验室，保存方法为 PDA斜面
培养基，冰箱4 ℃保存.
1.2.1.2 培养基组成
马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、海水 1000 mL、pH
7.2. 发酵培养基：马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、海水
1000 mL、pH7.2[5].
1.2.1.3 内生真菌的分离
取新鲜尖瓣海莲样品，依次经过：无菌水冲洗，
75%酒精浸泡30 s（除去表面微生物），无菌水冲洗
2-3遍，无菌滤纸吸掉表面水分后，将组织切块置
于PDA培养基中，在28 ℃恒温条件下倒置培养.待
菌丝长出后，挑取菌丝移至新的固体培养基上，最
终将分离纯化后的内生真菌转接到试管斜面上保
存备用[5].
1.3 发酵与提取
内生真菌Penicillium. sp.（3126）发酵培养条件
为：马铃薯液体培养基静置室温培养，发酵时间 28
天. 将复苏后的该菌，从斜面培养基转接到装有
100 mL马铃薯液体培养基的 5个三角瓶（500 mL）
中，用摇床培养48 h（28 ℃），获得种子培养液.用移
液器取种子培养液 5 mL加入到装有 300 mL土豆
汁液体培养基的50个（1000 mL）三角瓶中培养 28
天后，获得培养液 15 L，经纱布过滤分为发酵液和
菌丝体.发酵液用乙酸乙酯萃取 3次，得发酵液的
乙酸乙酯浸膏（10.0 g）；菌丝体用甲醇浸泡，提取3
次，再用乙酸乙酯萃取并减压浓缩得到菌丝体的乙
酸乙酯浸膏（8.0 g）.
1.4 化合物分离纯化
对该菌发酵液乙酸乙酯浸膏进行减压硅胶柱
层析（100-200目），以Petroleum/Ethyl acetate/MeOH
为溶剂进行梯度洗脱，分离得到 7个组分（Fr.1-
Fr.7）. 本研究重点对组分 Fr.2和组分 Fr.3进行分
离，经反复的硅胶柱层析（200-300目，300-400
目），Sephadex LH-20凝胶柱层析（Petroleum∶CHCl3
∶MeOH=2∶1∶1 洗脱，CHCl3∶MeOH=1∶1 洗脱），反
相硅胶柱层析（ODS）及重结晶等分离技术纯化后：
从 Fr.2中分离得到化合物 1（12.0 mg）和化合物 2
（10.0 mg）；从 Fr.3分离得到化合物 3（25.0 mg），化
合物4（20.0 mg）和化合物5（11.0 mg）.
1.5 生物活性测试
按照 Solis改良法进行卤虫（Artemia salina）致
死活性测定[6-7].
2.1 化合物的结构鉴定
化合物 1：无色针状结晶，易溶于氯仿. TLC检
测经硫酸-香草醛显色剂显色后显紫色特征，推测
其为甾醇类化合物. 1H NMR 谱图中，在低场区给
出给出 1组反式双键氢信号δ 5.21（1H, dd, J=15.2,
7.2 Hz）和 5.13（1H, dd, J=15.2, 8.0 Hz），1个连氧氢
1 实验部分
2 结果与讨论
第4期 唐雄肇等：一株红树尖瓣海莲内生真菌Penicillium sp.次级代谢产物及其生物活性研究 407
信号δ 3.61（1H, m），6个甲基信号δ 1.02（3H, d, J=
6.7 Hz, H-28），0.94（3H, s, H-19），0.92（3H, d, J=
6.8 Hz, H-21），0.82（3H, d, J=6.7 Hz, H-26），0.80
（3H, d, J=6.8 Hz, H-27）和0.62（3H, s, H-18）；根据
以上氢谱信息，并通过与文献[8]的数据比较，确定
化合物 1的结构为麦角甾-22-烯-3β-醇（ergosta-
22-triene-3β-ol）. 核磁数据：1H NMR（CDCl3, 400
MHz）∶δ 5.21（1H, dd, J=15.2, 7.3 Hz, H-22），5.13
（1H, dd, J=15.2, 8.0 Hz, H-23），3.61（1H, m, H-3），
1.02（3H, d, J=6.6 Hz, H-28），0.94（3H, s, H-19），
0.92（3H, d, J=6.8 Hz, H-21），0.82（3H, d, J=6.6 Hz,
H-26），0.80（3H, d, J=6.6 Hz, H-27）, 0.62（3H, s,
H-18）.
化合物 2：无色针状结晶，易溶于氯仿. TLC检
测经硫酸-香草醛显色剂显色后显紫色特征，推测
其为甾醇类化合物.比较化合物2与化合物1的 1H
NMR谱发现两者非常相似，不同之处仅在于在化
合物 2中多了 2个烯氢质子信号δ 5.56（1H, d, J=
2.4 Hz）和 5.37（1H, d, J=2.4 Hz），提示化合物 2比
化合物 1多了 2个双键氢信号. 根据 1H NMR谱信
息，并与文献[9]数据对照，确定化合物2为麦角甾-
5,7,22-三烯-3β-醇（ergosta-5,7,22-triene-3β-ol）.
核磁数据：1H NMR（CDCl3, 400 MHz）∶δ 5.56（1H, d,
J=2.4 Hz, H-6），5.37（1H, d, J=2.4 Hz, H-7），5.20
（1H, dd, J=15.2, 7.2 Hz, H-22），5.13（1H, dd, J=
15.2, 8.0 Hz, H-23），3.60（1H, m, H-3），1.01（3H,
d, J=6.6 Hz, H-28），0.95（3H, s, H-19），0.92（3H, d,
J=6.6 Hz, H-21），0.84（3H, d, J=6.6 Hz, H-26），0.83
（3H, d, J=6.6 Hz, H-27），0.64（3H, s, H-18）.
化合物 3：无色针状晶体，从其性状及经硫酸
–香草醛显色剂显色后显紫色特征，推测其也为甾
醇类化合物.在其1H-NMR谱中低场区出现1对顺
式双键的氢信号 δ 6.50（1H, d, J=8.4 Hz）和 6.24
（1H, d, J=8.4 Hz）；另外在 δ 5.23（1H, dd, J=15.0,
8.4 Hz）和 5.15（1H, dd, J=15.0, 8.4 Hz）处为 1对双
键氢信号，耦合常数为 15.0提示为反式双键.在 δ
3.96（1H, m）处为 1个连氧碳上的氢信号.根据这
些特征推测该化合物为过氧化麦角甾醇.通过与文
献 [10-11]核磁数据及与标准品进行 TLC对照检
测，进一步确定化合物 3为过氧化麦角甾醇 ergos⁃
terol peroxide. 核磁数据：1HNMR（400 MHz, CDCl3）
∶δ 6.50（1H, d, J=8.4 Hz, H-7），6.24（1H, d, J=8.4
Hz, H-6），5.23（1H, dd, J=15.0, 8.4 Hz, H-23），5.15
（1H, dd, J=15.0, 8.4 Hz, H-22），3.96（1H, m, H-3），
0.99（3H, d, J=6.6 Hz, H-21），0.90（3H, d, J=7.2 Hz,
H-28），0.87（3H, s, H-19），0.83（3H, d, J=7.2 Hz,
H-27），0.81（3H, d, J=7.2 Hz, H-26），0.81（3H, s,
H-18）.
化合物4：白色粉末状固体.在其 1H NMR谱低
场区给出两个活泼氢信号δ 12.40（1H, s）和 10.22
（1H, s），在芳香区给出 4个两两耦合的氢信号δ
7.79（2H, d, J=7.6 Hz）和 6.82（2H, d, J=7.6 Hz），提
示存在 1个二取代的苯环片段.在其 13C NMR谱中
共给出 6个碳信号，在低场区给出1个羰基碳信号
δ 167.6（C），在芳香区给出 6个碳信号δ 162.0（C），
132.0（CH），132.0（CH），121.8（C），115.6（CH）和
115.6（C）. 根据以上 1H NMR和 13C NMR谱图信息
并与文献[11]数据进行对照确定化合物 4 为对羟
基苯甲酸（4-hydroxybenzoic acid）. 核磁数据：1H
NMR（400 MHz, DMSO-d6）∶δ 12.40（1H, s），10.22
（1H, s），7.79（2H, d, J=7.6 Hz）和 6.82（2H, d, J=7.6
Hz）. 13C NMR（100 MHz, DMSO-d6）∶δ 167.6（C），
162.0（C），132.0（CH），132.0（CH），121.8（C），115.6
（CH），115.6（C）.
化合物5：无色针状结晶. 1H NMR中在低场区
给出 1个活泼氢信号δ 9.72（1H, s），在芳香区给出
两组相互耦合的邻位氢信号δ 7.67（2H, d, J=7.6
Hz）和6.88（2H, d, J=7.6 Hz），以上信息提示该化合
物含有二取代苯的结构；在 13C NMR谱低场区出现
一个羰基信号δ 189.5（C），结合 1H NMR谱推测为
羰基碳信号.根据以上数据并与文献[12]数据进行
对照，确定化合物 5为对羟基苯甲醛（4-hydroxy⁃
benzaldehyde）. 核磁数据：1H NMR（400 MHz, Ace⁃
tone）：δ 9.72（1H, s），7.67（2H, d, J=7.6 Hz），6.88
（2H, d, J=7.6 Hz）. 13C NMR（100 MHz, Acetone）：δ
189.5（C），162.4（C），131.3（CH），131.3（CH），129.0
（C），115.2（CH），115.2（CH）.
2.2 化合物的生物活性测定
对化合物 1-5进行了卤虫 A. salina致死活性
测试，化合物 1，4和 5都显示了较强的卤虫致死活
性，在浓度为 25 g/mL时对卤虫的致死率分别为
70%，75%和68%.
本研究采用活性追踪分离的方法，从分离自红
树尖瓣海莲的一株青霉属真菌 Penicillium sp.
3 结论
408 海南师范大学学报（自然科学版） 2013年
（3126）的发酵产物中分离鉴定了 5 个化合物：包
括 3 个甾体类化合物（1-3）和 2 个苯衍生物 4 和
5.以上化合物均为首次从尖瓣海莲内生真菌中分
离得到.活性测试结果表明，甾体类化合物 1和苯
衍生物 4和 5具有较强的卤虫致死活性.
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