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广西火桐自然种群和迁地保护种群的遗传多样性比较



全 文 :Vol. 35 No. 2
Feb. 2015
第 35卷 第 2期
2015年 2月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
Doi:10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.02.013 http: //qks.csuft.edu.cn
收稿日期:2014-04-25
基金项目:广西自然科学基金项目(2012GXNSFAA053069);财政部科技支撑计划项目(KSCX2-YW-Z-1009)
作者简介:骆文华,副研究员;E-mail:luowenhua2004@163.com
引文格式:骆文华 , 代文娟 , 刘 建 , 等 . 广西火桐自然种群和迁地保护种群的遗传多样性比较 [J].中南林业科技大学学报 , 2015,
35(2): 66-71.
广西火桐自然种群和迁地保护种群的遗传多样性
比较
骆文华 1,代文娟 1,刘 建 2,胡兴华 1,李祥军 1,3,黄仕训 1
( 1. 中国科学院 广西植物研究所, 广西 桂林 541006;2. 广西壮族自治区林业厅,广西 南宁 530028;
3. 广西师范大学 生命科学学院,广西 桂林 541004 )
摘 要:采用 ISSR 标记方法,对广西火桐 Erythropsis kwangsiensis 10个自然种群和 1个迁地保护种群的遗传多
样性和遗传结构进行了分析和比较。结果表明:用 10个引物从广西火桐总 DNA 中共扩增出 60条带,其中多态
性条带 51 条。自然种群中以维新种群的遗传多样性最高,而三叠岭瀑布种群最低。自然种群的总遗传变异 Ht为
0.281 5,种群内遗传变异 HS为 0.076 4,种群间遗传变异为 0.205 1,基因流为 0.183 2。迁地保护种群的 HEt和
HES均为 0.118 8。自然种群间存在一定程度的遗传分化 (Gst = 0.731 9),种群间变异占主导地位。合并后的自然
种群的多态性条带百分率(RPPB)、Nei’s多样性指数 (H)和 Shannon信息指数 (I)均高于迁地保护种群,分别为
85.00%和 31.67%、0.284 1和 0.118 8、0.428 5和 0.175 7。研究结果表明:广西火桐迁地保护种群的遗传多样性
较低,未能涵盖整个种群。建议从多个自然种群中收集种子,尽可能多的采集样本,分区育苗种植,以增加遗
传多样性水平。
关键词:广西火桐;野生种群;迁地保护种群;ISSR;遗传多样性;遗传结构
中图分类号:S718 文献标志码:A 文章编号:1673-923X(2015)02-0066-06
Comparison of genetic diversity of natural and ex-situ conservation
populations of Erythropsis kwangsiensis
LUO Wen-hua1, DAI Wen-juan1, LIU Jian2, HU Xing-hua1, LI Xiang-jun1,3, HUANG Shi-xun1
(1. Guangxi Institute of Botany, China Academy of Sciences, Guilin 541006, Guangxi, China; 2.Forestry Dept. of Guangxi, Nanning
530028, Guangxi, China; 3. College of Life Sciences, Guangxi Normal University; Guilin 541004, Guangxi, China)
Abstract: Genetic diversity and structure of ten natural populations and one ex-situ conservation population of Erythropsis kwangsiensis
were analyzed and compared by ISSR marker method. The results show that Sixty bands were amplified from total genomic DNA with
10 primers,in which there were 51 polymorphic bands; Of the ten natural populations, the percentages of polymorphic band (PPB),
Nei’s diversity index (h) and Shannon information index (I) of Weixin population were the highest, and those of Sandieling waterfall
were the lowest; The total genetic differentiation (Ht ) of natural populations was 0.281 5, with HS=0.076 4 in populations, 0.205 1 among
populations, and the gene flow was 0.183 2; However, the genetic differentiation values (HEt and HES) both were 0.118 8 in ex-situ
conservation population; There existed a genetic differentiation (Gst= 0.731 9) among natural populations but the differentiation between
populations occupied an leading position. The genetic diversity values of the natural population after merged, such as the percentage of
polymorphic bands (RPPB), Nei’s diversity index (H) and Shannon information index (I) were all higher than that of ex-situ conservation
population(REPPB), (HE), (IE) their were 85.00% (RPPB) and 31.67%(REPPB), 0.284 1 (H) and 0.118 8 (HE), 0.428 5 (I) and 0.175 7 (IE)m
respectively. It was concluded that the ex-situ conservation population failed to cover the entire genetic diversity of E. kwangsiensis, so
the suggestions are that seeds collecting should be selected from several wild populations, collected samples as many as possible and
made seedling and planting with partition method, in order to increase genetic diversity of E. kwangsiensis.
Key words: Erythropsis kwangsiensis; wild population; ex-situ conservation population; ISSR; genetic diversity; genetic structure
67第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
广西火桐 Erythropsis kwangsiensis为梧桐科
火桐属植物,为优良工艺用材和珍贵的园林观赏
树种,仅分布于广西中部至南部石灰岩地区的来
宾、大新、靖西、那坡、田阳等县。由于广西火
桐自身生物学特性和自然、人为因素的影响,在
其分布区一般呈零星分布,个体数量少,稀有大
的种群分布,已处于濒危状态,被列为国家二级
重点保护野生植物 [1]。目前对广西火桐的研究主
要集中在其资源分布状况 [2]、群落特征 [3])、光
合特性 [4]和育苗技术 [5-7]等方面,而遗传多样性
方面的研究尚未见报道。
为保护濒危物种广西火桐的种质资源,广西
植物研究所的科研人员从 2002年开始开展广西火
桐的迁地保护工作,繁育定植了 100多株广西火
桐于桂林植物园,现部分植株已开花结实,但结
实量极少且幼果早落而未能产生成熟种子。迁地
保护种群涵盖其野生种群的遗传多样性水平是评
价迁地保护有效性之关键 [8],为此,本项研究以
广西火桐 10个自然种群和 1个迁地保护种群为
研究对象,采用简单序列重复区间(inter-simple
sequence repeat, ISSR)分子标记技术来揭示广西
火桐自然种群及迁地保护种群的遗传多样性和遗
传结构状况,以期为制定该物种的有效保护措施
提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
于 2012年 8月对分布于广西来宾、大新、靖西、
那坡、田阳等县的 10个广西火桐自然种群及桂林
植物园 1个 迁地保护种群选取实验材料,各种群
的概况见表1。共取样株95株,其中自然种群77株,
迁地保护种群 18株。于每个植株上取当年生叶片,
硅胶中保存备用。
用于 ISSR-PCR反应的 Buffer、MgCl2、dNTPs、
TaqDNA聚合酶等均购于上海生物工程有限公司,
ISSR引物也由上海生物工程有限公司合成。
1.2 方 法
1.2.1 DNA的提取
采用植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)
(上海捷瑞生物工程有限公司)进行DNA的提取,
操作步骤参照说明。
1.2.2 反应体系和扩增程序
采用优化扩增反应体系:25 μL 体系中
1×PCR buffer,2.5 mmol/L MgCl2,0.15 mmol/L
dNTPs,0.06 U/μL Taq DNA聚合酶,3 ng/μLDNA模
板,0.2 μmol/L引物。最佳扩增程序为:94 ℃预变
性 5 min;94 ℃变性 45 s,52 ℃退火 45 s,72 ℃延
伸 1.5 min,共 30 个循环;72 ℃最后延伸 7 min。
1.2.3 扩增产物检测
PCR 扩增在 Biometra TProfessional PCR仪(华
粤企业集团有限公司)上进行。反应结束后,10 μL
上样液含 1 μL GelGreen核酸染料在 1.5 %琼脂糖凝
胶中电泳 60 min,电压设定为 120 V,于生物电泳
图像分析系统(美国UVP)成像分析系统拍照记录。
1.2.4 统计分析
对扩增产物稳定的 10 个引物的清晰条带进行
统计分析。按条带有或无分别赋值 ,有带记为 1,
无带记为 0,形成 1、0数据矩阵。利用 Popgene
32 软件分析各个居群的等位基因数(Na)、有
效等位基因数(Ne)、多态位点百分率。在物
种水平上整个种群的遗传变异(Ht)、种群内
遗传多样性(Hs)、遗传分化系数(Gst),以
及 Shannon多样性指数(I)和 Nei’s遗传一致度
(H)。采用 NTSYS-pc 2.1软件对种群间遗传距
离进行 UPGMA(unweighedpair-group method with
arithmetic-means)聚类分析,绘制聚类图。
2 结 果
2.1 种群遗传多样性
从 100 条 ISSR引物中筛选出电泳谱带清晰且
多态性较好的 10 条引物(表 2),并对 95个个体
进行 ISSR分析,共扩出 60 条带,范围在 400~
2 000 bp(图 1),其中多态性条带 51条,平均每
表 1 供试11个广西火桐种群概况
Table 1 General situation of eleven populations of E.
kwangsiensis
种群 来源地 经度 纬度 种群规模 /株 样株数
回龙村 HL 来宾凤凰镇 E109°10′ N23°57′ 27 10
孔婴村 KY 大新县福隆乡 E107°28′ N22°58′ 9 3
定夜村 DY 田阳五村乡 E106°51′ N23°31′ 4 3
弄依 LY 那坡平孟镇 E106°00′ N22°58′ 2 2
维新 WX 靖西化峒乡 E106°27′ N23°03′ 275 20
陇维 LW 靖西武平乡 E106°32′ N23°11′ 14 4
马巷 MH 靖西武平乡 E106°33′ N23°11′ 9 9
灵屯 LT 靖西湖润镇 E106°40′ N23°00′ 173 20
三叠岭瀑布 SDL 靖西湖润镇 E106°40′ N22°59′ 3 3
爱布瀑布 AB 靖西化峒镇 E106°51′ N23°31′ 9 3
植物园 ZWY 桂林植物园 E110°17′ N25°01′ 106 18
骆文华,等:广西火桐自然种群和迁地保护种群的遗传多样性比较68 第 2期
个引物扩增出的条带数为 6条,平均每个引物扩
增出的多态性条带数为 5.1条,多态条带百分比为
85.00%。
表 2 10条ISSR引物序列及扩增结果
Table 2 Ten ISSR primer sequences and amplification results
引物编号 引物序列 (5’~ 3’) 扩增条带数 多态性条带数
UBC808 A(Ga)7gC 6 5
UBC813 C(TC) 7TT 4 1
UBC816 C(AC) 7AT 8 8
UBC835 (Ag)8YC 6 6
UBC842 G(Ag) 7 AYg 8 8
UBC847 C(AC) 7ARC 6 5
UBC856 A(CA) 7CYA 5 4
UBC864 (ATg) 6 7 5
UBC865 (CCg) 6 6 6
UBC867 (ggC) 6 4 3
总计 60 51
平均 6 5.1
用 Popgen32软件对 11个种群的遗传多样性进
行分析(表 3):各种群的等位基因数(Na)范围
为 1.033 3~ 1.416 7,平均值 1.207 6;有效等位基
因数(Ne)从 1.014 3~ 1.286 6,平均值 1.140 9;
多态性条带百分率(PPB)、Nei’s多样性指数(H)
和 Shannon信息指数(I)范围分别在 3.33%~
41.67%、0.010 0~0.157 3和0.015 9~0.231 8之间,
平均值分别为 20.76%、0.080 3和 0.118 0。在物
种水平上,广西火桐的多态性条带百分率(PPB)、
Nei’s多样性指数(H)和 Shannon信息指数(I)
分别分别为 85.00%、0.273 2和 0.415 5。
注:1-20为 LT种群个体,M为 Lambda DNA/EcoRⅠ + Hind Ⅲ
图 1 UBC842扩增 DNA样品的电泳
Fig.1 Electrophoresis of DNA samples with primer UBC842
表 3 广西火桐13个种群的遗传多样性比较
Table 3 Genetic diversity comparisons among 13 populations of E. kwangsiensis
居群 等位基因数 Na 有效等位基因数 Ne Nei’s多样性指数 H Shannon多样性指数 I 多态位点数 多态位点百分率 /%
灵屯 LT 1.400 0 1.269 4 0.157 3 0.231 8 24 40.00
三叠岭瀑布 SDL 1.033 3 1.014 3 0.010 0 0.015 9 2 3.33
爱布瀑布 AB 1.100 0 1.069 1 0.039 4 0.057 9 6 10.00
维新 WX 1.416 7 1.286 6 0.156 9 0.228 5 25 41.67
马巷 MH 1.200 0 1.119 1 0.070 9 0.106 7 12 20.00
陇维 LW 1.233 3 1.164 3 0.093 3 0.136 5 14 23.33
定夜村 DY 1.083 3 1.070 7 0.037 5 0.053 4 5 8.33
孔婴村 KY 1.133 3 1.083 3 0.049 4 0.073 8 8 13.33
弄依 LY 1.083 3 1.058 9 0.034 5 0.050 4 5 8.33
回龙 HL 1.283 3 1.207 9 0.115 3 0.167 5 17 28.33
植物园 ZWY 1.316 7 1.206 8 0.118 8 0.175 7 19 31.67
平均值 1.207 6 1.140 9 0.080 3 0.118 0 12 20.76
物种水平 1.850 0 1.449 7 0.273 2 0.415 5 51 85.00
自然种群中,遗传多样性较高的有维新(WX)
和灵屯(LT)种群。其中维新(WX)种群的最
高,多态性条带百分率(PPB)、Nei’s 遗传多样
性指数(H) 和 Shannon信息指数(I)值分别为
41.67%、0.156 9和 0.228 5;回龙(HL)、陇维
(LW)和马巷(MH)种群的 PPB、H和 I值处
于中间;孔婴村(KY)、爱布瀑布(AB)、定
夜村(DY)、弄依(LY)4个种群的遗传多样较低;
三叠岭瀑布(SDL)最低,其 PPB、H和 I分别
为 3.33%、0.010 0和 0.015 9。
迁地保护种群(ZWY)的等位基因数(Na)、
有效等位基因数(Ne)、Nei’s多样性指数(H)和
Shannon信息指数分别为 1.316 7、1.206 8、0.118 8
和 0.175 7,多态性条带百分率(PPB)为 31.67%,
介于自然种群中的灵屯(LT)与回龙(HL)之间。
2.2 合并后的种群遗传多样性和遗传结构
将自然种群(定夜村 DY、维新WX、弄依
69第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
LY、陇维 LW、马巷MH、灵屯 LT、三叠岭瀑布
SDL、爱布瀑布 AB、回龙村 HL和孔婴村 KY)
合并作为 1 个组( 77个单株),桂林植物园
ZWY种群(18个单株)单独作为一个组。合并后
的广西火桐自然种群、迁地保护种群的遗传多样
性分析结果和遗传分化结构见表 4。
表 4 广西火桐2个组的遗传多样性及结构分析
Table 4 Genetic diversity and genetic differentiation parameters between 2 groups of E. kwangsiensis
居群 Nei’s多样性指数 H Shannon多样性指数 I 多态位点百分率 /% Ht Hs Gst Nm
自然种群 0.2841 0.4285 85.00 0.281 5 0.076 4 0.731 9 0.183 2
迁地保护种群 0.1188 0.1757 31.67 0.118 8 0.118 8
总值 0.2732 0.4155 85.00 0.283 4 0.270 0 0.702 6 0.211 6
表 4显示:合并后,自然种群的 PPB、H和 I
分别为 85.00%、0.284 1和 0.428 5;迁地保护种群
的 PPB、H和 I分别为 31.67%、0.118 8和 0.175 7;
自然种群的遗传多样性高于迁地保护种群。
自然种群的总遗传变异 Ht为 0.281 5,种群内
遗传变异Hs为 0.076 4,种群间遗传变异为 0.205 1,
种群间遗传分化系数为 0.731 9。在总的遗传多样
性中,73.19%的遗传变异存在于种群间,26.81%
的遗传变异存在于种群内。基因流为 0.183 2。迁
地保护种群的 Ht和 Hs均为 0.118 8。
合并后,2个组的总遗传变异 Ht为 0.283 4,
种群内遗传变异 Hs为 0.270 0,种群间遗传变异为
0.013 4,种群间遗传分化系数 Gst为 0.702 6。在总
的遗传多样性中,70.26%的遗传变异存在于种群
间,29.74%的遗传变异存在于种群内,遗传变异
主要存在于种群间。基因流为 0.211 6。
2.3 种群遗传聚类
广西火桐 11个种群的遗传一致度为 0.622 0~
0.940 3,遗传距离 D为 0.061 6~ 0.474 9(表 5)。
其中弄依(LY)和陇维(LW)之间的遗传距离最
大,为 0.474 9,表明两者之间的遗传差异性最大,
且其相似度也最低,为 0.622 0。回龙(HL)和 植
物园(ZWY)之间的遗传距离最近,为 0.061 6,
同时相似度也是最高的,为 0.940 3,说明其亲缘
关系最近。
表 5 广西火桐11个种群遗传一致度(对角线以上)和遗传距离D(对角线以下)
Table 5 Genetic similarity coefficients (above diagonal) and genetic distance D(below diagonal) of E. kwangsiensis
种群 LT SDL AB WX MH LW DY KY LY ZWY HL
LT **** 0.865 6 0.784 7 0.809 1 0.775 4 0.719 6 0.770 3 0.794 1 0.784 6 0.842 3 0.861 9
SDL 0.144 3 **** 0.811 0 0.749 1 0.695 3 0.696 8 0.868 6 0.808 9 0.867 3 0.821 0 0.813 5
AB 0.242 5 0.209 5 **** 0.729 1 0.627 5 0.685 5 0.790 3 0.668 0 0.736 4 0.764 2 0.722 3
WX 0.211 9 0.288 9 0.315 9 **** 0.699 4 0.657 8 0.753 9 0.717 3 0.775 2 0.845 7 0.830 7
MH 0.254 3 0.363 4 0.466 1 0.357 6 **** 0.746 1 0.670 1 0.622 3 0.628 3 0.800 7 0.843 4
LW 0.329 1 0.361 3 0.377 6 0.418 9 0.292 9 **** 0.664 8 0.671 0 0.622 0 0.737 8 0.745 6
DY 0.260 9 0.140 8 0.235 4 0.282 4 0.400 3 0.408 3 **** 0.757 6 0.878 1 0.748 6 0.755 4
KY 0.230 6 0.212 1 0.403 4 0.332 3 0.474 3 0.399 0 0.277 6 **** 0.795 1 0.729 8 0.716 3
LY 0.242 6 0.142 3 0.306 0 0.254 7 0.464 7 0.474 9 0.130 0 0.229 3 **** 0.728 5 0.750 4
ZWY 0.171 6 0.197 2 0.268 9 0.167 6 0.222 3 0.304 1 0.289 5 0.315 0 0.316 8 **** 0.940 3
HL 0.148 6 0.206 4 0.325 3 0.185 5 0.170 3 0.293 6 0.280 5 0.333 7 0.287 1 0.061 6 ****
图 2 广西火桐 13个居群的 UPGMA聚类
Fig.2 UPGMA dendrogram of 13 pupulations of
Erythropsis kwangsiensis
基于 11个种群间遗传距离的 UPGMA聚类结
果显示(图 2),10个自然种群中靖西的灵屯(LT)
先和来宾的回龙(HL)聚在一起,再与靖西的维
新(WX)、马巷(MH)聚为一组;田阳的定夜
村(DY)和那坡的弄依(LY)先聚在一起,再和
靖西的三叠岭瀑布(SDL)、大新的孔婴村(KY)、
靖西的爱布瀑布(AB)聚为一组;靖西的陇维(LW)
单独聚为一组。可见,10个自然种群的亲缘关系
与其地理距离之间的相关性不强。而植物园迁地
保护种群(ZWY)是先与回龙(HL)聚在一起,
骆文华,等:广西火桐自然种群和迁地保护种群的遗传多样性比较70 第 2期
再与灵屯(LT)相聚,表明迁地保护种群与这两
个种群的亲缘关系较密切。
3 讨 论
3.1 广西火桐种群的遗传多样性
物种水平上,广西火桐自然种群维持较高
的遗传多样性(PPB、Nei’s多样性指数 H和
Shannon 信息指数 I 分别为 85.00%、0.273 2 和
0.415 5)。种群水平的遗传多样性则较低(PPB、
Nei’s多样性指数 H和 Shannon信息指数 I分别为
20.76%、0.080 3和 0.118 0)。其中,自然种群的
维新、灵屯和回龙种群的遗传多样性较高,而其
他种群的遗传多样较低。由于种群间的遗传多样
性不平衡,部分种群较低的遗传多样性使得整个
种群的遗传多样性水平降低。根据野外调查,维新、
灵屯和回龙种群的个体数量较多,而其他种群的个
体数量较少,这表明种群遗传多样性水平与种群大
小相关,较大的种群趋于具有更高的遗传多样性水
平,这与刘国彬对锥栗的研究结果一致 [9]。
广西火桐迁地保护种群的遗传多样性(PPB
为 31.67%、H为 0.118 8、I为 0.175 7)低于自然
种群的物种水平,遗传聚类分析表明其与来宾的
回龙(HL)和灵屯(LT)聚为一组。这主要与迁
地保护种群的种源有关,由于当时引种时,尚未
以遗传学理论为指导,且自然种群中的结实母株
数量极少,当年进行种子采集时仅灵屯和回龙两
个种群有母株结实,故迁地保护种群的种苗均来
自于这两个种群,从其遗传多样性研究结果来看
亦只基本涵盖了这两个自然种群。
3.2 广西火桐种群的遗传结构与分化
植物居群的遗传结构反映了种的长期进化史、
分布区转移、生境化片断和居群特化、突变、遗
传漂变、交配系统、基因流和选择等不同过程的
相互作用 [10]。广西火桐自然种群间的遗传分化系数
较高(Gst=0.731 9),表明广西火桐自然种群间存
在相当程度的遗传分化,主要遗传变异存在于种群
间。自然种群的基因流较低(Nm=0.183 2),意味
着种群间基因流动程度较低,种群间存在一定程
度的遗传漂变。Hamrick等 [11]认为,当 Nm< 1时,
遗传漂变可以导致种群间明显的遗传分化。广西
火桐种群间极低的基因流可能是导致较高遗传分
化的主要原因:残存的广西火桐种群在广西石灰
岩地区呈岛屿状零星分布,人为干扰严重,生境
极度破碎化。此外,广西火桐自然种群中的成龄
结实母树数量极少,结实量小,野外幼苗成活率低,
导致有效种群的不断减少,从而限制了种群间的
基因交流,增加了种群间的遗传分化。
3.3 广西火桐迁地保护建议
植物园是迁地保护稀有濒危植物最主要的场
所,据统计,约有 30%的受威胁植物已保存在全
球 1 800 个主要的植物园。我国植物园约有 200个,
占世界植物园的 1/10,引种保存了中国植物区系
的植物约 20 000种,其中第一批国家重点保护植
物已有 90%(约 350种)被引种保存 [8]。迁地保
护的核心问题是物种遗传完整性、种群生存力及
迁地种群遗传管理 [12]。就某一个种来说,其遗传
变异水平关系到种群的适应能力乃至决定着整个
种的进化与生存 [13-14]。因此,对于广西火桐这类
分布区狭窄、野生数量稀少的濒危物种,从进化
与保育的角度考虑更应该充分重视其遗传多样性
保护。本研究中,广西火桐迁地保护种群的遗传
多样性低于自然种群,未能涵盖整个种群,与引
种材料来源于少量自然种群有关。因此,为更好
地保护这一珍稀濒危植物,还应进一步加强该物
种的种质资源收集工作,尽可能多地从尚未进行
过收集的各自然种群中采集繁殖材料,尤其是遗
传多样性最高的维新(WX)种群。采集时要应用“多
基因库采样法”(multiplegenepool sampling)[15],
并分区育苗种植,以增加其遗传多样性水平。
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