全 文 ：基础医学研究
毛蒟水提物对 CCl4 所致小鼠肝损伤的保护作用
＊
吴 芹1，金美林2，徐亚沙1，沈 刚1，陶 娜1，陆远富1，徐云燕1，刘 杰1，石京山1
(1．遵义医学院 基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州 遵义 563099;2．遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563099)
［摘 要］目的 研究毛蒟水提物对 CCl4 所致小鼠急性肝损伤的保护作用及其机制。方法 雄性昆明种小鼠随机分为空白
对照组，模型组，毛蒟水提物低、高剂量组，采用 CCl4 建立急性肝损伤模型。观察毛蒟水提物对模型组小鼠血清中天冬氨
酸转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性，小鼠肝脏指数和肝组织中 Egr － 1、TNF － α mＲNA 表达的影响，以及肝组
织的病理学改变。结果 毛蒟水提物给药组可明显降低 CCl4 所致肝损伤小鼠血清中 AST、ALT 的活性(P ＜ 0． 01) ，降低肝
脏组织中 Egr － 1 和 TNF － α mＲNA的表达水平(P ＜ 0． 05) ;可明显改善 CCl4 所致肝脏病理细胞损伤，炎症细胞明显减少，
且高剂量组更为显著。结论 毛蒟水提物对 CCl4 所致小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用，其机制可能与抑制 Egr － 1 和
TNF － α等炎症通路因子的表达有关。
［关键词］毛蒟水提物;急性肝损伤;四氯化碳;Egr － 1;TNF － α
［中图法分类号］Ｒ285． 5;Ｒ965． 1 ［文献标志码］A ［文章编号］1000-2715(2016)01-0014-04
Protective effects of aqueous extract of Piper puberulum against acute hepatic
injury induced by CCl4 in mice
Wu Qin1，Jin Meilin2，Xu Yasha1，Shen Gang1，Tao Na1，Lu Yuanfu1，Xu Yunyan1，Liu
Jie1，Shi Jingshan1
(1． Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education，Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou
563099，China;2． Pharmacy School of Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China)
［Abstract］Objective To study the protective effects and mechanisms of aqueous extract of Piper puberulum
against carbon tetrachloride (CCl4)－ induced acute hepatic injury in mice． Methods The male kunming mice
were divided into four groups:normal，model，low dose and high dose of aqueous extract of P． puberulum
groups． The acute liver injury in mice was induced by ip injection of CCl4 ． Sixteen hr after CCl4 intoxication，the
hepatic indices were calculated． The activities of serum ALT and AST were determined． ＲT － qPCＲ was per-
formed to determine the gene expression of Egr － 1 and TNF － α． Histopathological changes of liver tissue slices
stained by HE staining were observed under light microscope． Ｒesults The activities of ALT，AST were signifi-
cantly decreased by aqueous extract of P． puberulum pretreatment (P ＜ 0． 01) ，and the gene expression of Egr －
1 and TNF － α in hepatic tissues was also markedly decreased (P ＜ 0． 05)． Histopathological results showed the
obvious improvement of liver injury in aqueous extract of P． puberulum pretreatment groups． Conclusion Aque-
ous extract of P． puberulum has protective effects against CCl4 － induced acute hepatic injury in mice，and the
mechanisms might be associated with the inhibition of expression of Egr － 1 and TNF － α．
［Key words］aqueous extract of Piper puberulum (PPE) ;acute hepatic injury;carbon tetrachloride (CCl4) ;
early growth response gene － 1 (Egr － 1) ;tumor necrosis factor alpha (TNF － α)
·41·
第 39 卷 第 1 期
2016 年 2 月 遵 义 医 学 院 学 报Journal of Zunyi Medical University
Vol． 39 No． 1
Feb． 2016
* ［基金项目］国家自然科学基金资助项目(NO:81560682) ;贵州省教育厅招标项目(NO:黔科教 KY － 2012 － 055) ;贵州省中
医药管局资助项目(NO:QZYY20) ;贵州省科技厅药物代谢动力学平台项目(NO:黔科 2008 － 002)。
［通信作者］刘杰，男，博士，研究员，研究方向:药物代谢与毒理学研究，E-mail:jie@ liuonline． com。
DOI:10.14169/j.cnki.zunyixuebao.2016.0004
黔产毛蒟［Piper puberulum(Benth) ］为胡椒科
(Piperaceae)胡椒属植物，别名小墙风、小毛蒌、石
楠藤等，药用其干燥全株。主要分布于我国的四
川、云南、贵州、广西、广东等地［1］。具有行气止
痛，祛风活血之功效，可治疗风湿性痹痛、风寒头
痛、胃脘痛等症［2］。有研究报道表明，毛蒟具有抗
血小板聚集、抗炎、抗肿瘤及镇痛等药理作用［3 － 5］。
在贵州民间应用毛蒟干燥全株煎剂，对治疗急、慢
性肝损伤疗效较好，但其机制尚不明确。本实验采
用 CCl4 诱导小鼠急性肝损伤动物模型，观察毛蒟
水提物对肝损伤的保护作用，并初步分析其作用机
制，为进一步开发利用黔产毛蒟提供药理学实验依
据。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
1． 1． 1 药品与试剂 毛蒟药材采自贵州省黔东南
州锦屏县，经贵州省遵义医学院附属医院药剂科杨
建文副教授鉴定为胡椒科胡椒属植物毛蒟的全株。
ＲNA提取试剂盒、ＲNA 纯化试剂盒(上海华舜生
物技术有限公司) ，引物设计(大连宝生物工程有
限公司) ;High Capacity Ｒeverse Transcriptase Kit
(Applied Biosystems，USA) ，SYBＲ  PCＲ Master
Mix (美国 ABI 公司) ;谷丙转氨酶(GPT /ALT)测
试盒，谷草转氨酶(GOT /AST)测试盒(南京建成生
物工程研究所) ;四氯化碳(重庆市九龙化学试剂
厂) ，其他试剂均为国产分析纯。
1． 1． 2 毛蒟提取物的制备 取干燥的毛蒟全株干
品，粉碎成粉末，过 10 目筛，称取 100． 0 g 置于
5 000 mL圆底烧瓶中，加入 3 000 mL(30 倍量)蒸馏
水，浸泡 2 h，每次煎煮2 h，共 3次。真空抽滤，合并
水煎滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏状，冷冻
干燥机干燥，得 17． 62 g 干燥物。将其总提物经 D
－101 大孔树脂分离，减压回收得到水提浸膏。
1． 1． 3 动物 雄性昆明种小鼠 40 只，SPF 级，体
重(20 ± 2)g，从重庆第三军医大学实验动物中心
购买，许可证号:SCXK(军)2012 － 0011。
1． 1． 4 仪器 通用酶标仪(美国 Bio － Ｒad 公
司) ，5417Ｒ 型冷冻离心机(德国 Eppendorf) ，
BS100S型电子分析天平(北京德赛公司) ，Ｒ － 200
旋转蒸发仪(瑞士 BUCHI 公司) ，SHZ －Ⅲ型循环
水真空泵，ＲE － 2000 旋转蒸发仪(上海亚荣生化
仪器厂) ，TU －1810 紫外可见分光光度计(北京普
析通用仪器有限责任公司) ，X － 15Ｒ 型冷冻离心
机(美国贝克曼公司) ，Icycler IQ 型实时荧光定量
PCＲ仪(美国 BIO － ＲAD公司)。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 动物分组、制模及给药 将 40 只健康雄性
昆明种小鼠随机分为 4 组:空白对照组、模型组、毛
蒟水提物低剂量组(0． 5 g /kg)、毛蒟水提物高剂量
组(1． 0 g /kg) ，每组 10 只。毛蒟各剂量组分别按
0． 1 mL /10 g灌胃给药，空白对照组和模型组给予
等体积生理盐水，连续灌胃 7 d，于末次给药 1 h
后，除空白对照组外，模型组和毛蒟各给药组按
0. 1 mL /10 g 剂量腹腔注射 0． 2% CCl4 溶液建立
急性肝损伤模型，禁食不禁水，制模 24 h 后称量小
鼠体重，收集血液及取肝脏进行相关指标检测。
1． 2． 2 小鼠肝脏指数的计算 剖取肝脏，称其重
量，按肝脏指数 =肝脏重量(g)/体重(g)× 100%，
计算小鼠肝脏指数。
1． 2． 3 血清中 AST 和 ALT 活性检测 采用眼眶
取血，小鼠全血在室温静置 2 h，3 000 r /min 离心
10 min，制备血清，按照试剂盒说明书的操作方法，
于全自动生化仪上测定 ALT和 AST活性。
1． 2． 4 肝脏组织形态学观察 切取相同部位肝组
织置 10%甲醛溶液中固定 48 h，进行石腊包埋，切
片，常规 HE 染色。光镜下观察肝脏组织形态学变
化。
1． 2． 5 Ｒeal － Time ＲT PCＲ 检测相关基因的表达
取肝组织 50 ～ 100 mg 置于 1 mL Trizol 中，提取
肝脏总 ＲNA，测定其浓度及纯度，然后将其逆转录
为 cDNA并稀释，进行聚合酶链式反应。以 β肌动
蛋白(β － actin)为参照，用相对量法计算早期生长
反应基因 － 1(Egr － 1)、肿瘤坏死因子 α (TNF －
α)mＲNA的表达水平。以 Ct值为统计参数，采用
目的基因及 β － actin 基因相对含量的比值作为评
价标准，对实验中目的基因进行相对定量，引物序
列(见表 1)。
表 1 实时荧光定量 PCＲ引物序列
基因 基因编号 上游引物 下游引物
β － actin V01217 TGACCGAGCGTGGCTACAG GGGCAACATAGCACAGCTTCT
Egr － 1 M20157 AGGTTCCCATGACCCTGACT GGTACGTTCTCCAGACCCTG
TNF － α NM_013693． 2 GGTTCTCTTCAAGGGACAAGG TGGAAGACTCCTCCCAGGTAT
·51·
1 期 吴 芹等·毛蒟水提物对 CCl4 所致小鼠肝损伤的保护作用
1． 3 统计学处理 实验数据以均数 ±标准差(x
± s)表示，采用 SPSS 17． 0 统计软件分析，组间比
较采用单因素方差分析(One Way ANOVA) ，方差
齐采用 LSD法检验，方差不齐则采用 Dunnett’s 法
检验，P ＜ 0． 05 表示有统计学意义。
2 结果
2． 1 毛蒟水提物对 CCL4所致急性肝损伤小鼠的
体重和肝脏指数的影响 各组间小鼠体重无明显
差别。与正常对照组比较，模型组小鼠肝脏指数显
著升高(P ＜ 0． 05) ，结果提示，小鼠肝脏受损;与模
型组比较，毛蒟水提物各剂量组的肝脏指数均显著
降低(P ＜ 0． 05，见表 2)。
表 2 毛蒟水提物对小鼠体重、肝脏指数的影响(x ±
s，n = 10)
组别 给药剂量(g /kg)体重(g) 肝重指数(%)
空白对照组 — 26． 7 ± 2． 50 5． 0 ± 0． 21
模型组 — 28． 6 ± 0． 20 5． 6 ± 0． 20#
毛蒟低剂量组 0． 5 28． 1 ± 2． 00 4． 3 ± 0． 18*
毛蒟高剂量组 1． 0 26． 8 ± 2． 40 5． 2 ± 0． 50*
#:P ＜ 0． 05，与空白对照组比较;* :P ＜ 0． 05，与模型
组比较。
2． 2 毛蒟水提物对 CCL4所致急性肝损伤小鼠血
清中 ALT、AST活性的影响 与空白对照组比较，
模型组小鼠血清中 ALT、AST 活性均明显升高(P
＜ 0． 05) ;与模型组比较，毛蒟水提物低剂量组和
高剂量组均明显降低 CCl4 所致肝损伤小鼠血清中
ALT、AST活性(P ＜ 0． 05) ，且高剂量给药组更为显
著(见表 3)。
表 3 毛蒟水提物对急性肝损伤小鼠血清中 ALT、AST
活性的影响(x ± s，n = 10)
组别
给药剂量
(g /kg) AST (U/L) ALT (U/L)
空白对照组 — 54． 51 ± 14． 43 206． 40 ± 22． 64
模型组 — 225． 68 ± 12． 36# 412． 50 ± 73． 60#
毛蒟低剂量组 0． 5 148． 57 ± 32． 24* 247． 41 ± 77． 46*
毛蒟高剂量组 1． 0 109． 75 ± 8． 40* 180． 41 ± 6． 60*
#:P ＜ 0． 05，与空白对照组比较;* :P ＜ 0． 05，与模型
组比较。
2． 3 毛蒟水提物对 CCL4所致急性肝损伤小鼠肝
脏组织病理学的影响 小鼠肝组织 HE 染色，光镜
下观察显示，空白对照组小鼠的肝脏结构正常，肝
索排列规则，肝细胞形态正常。模型组中央静脉向
四周呈片状病灶性坏死，肝小叶中央静脉区有炎症
细胞浸润，肝小叶结构被破坏。给药组肝组织病灶
性坏死消失，在高剂量组中肝小叶结构基本完整，
炎症细胞浸润明显减轻，仅见中央静脉周围细胞轻
微水肿(见图 1)。
A:空白对照组;B:模型组;C:毛蒟低剂量组;D:毛蒟高剂量组。
图 1 毛蒟水提物对小鼠肝组织形态学变化的影响(HE，× 200)
2． 4 毛蒟水提物对 CCL4所致急性肝损伤小鼠肝
组织中 Egr － 1 和 TNF － α mＲNA 表达的影响 与
空白对照组比较，模型组小鼠肝组织中 Egr － 1 和
TNF － αmＲNA的表达均明显升高(P ＜ 0． 05) ;与
模型组比较，给药组小鼠肝组织中 Egr － 1 和 TNF
－ α mＲNA表达明显降低(P ＜ 0． 05) ，且高剂量组
更显著(见图 2)。
·61·
遵 义 医 学 院 学 报 39 卷
#:P ＜ 0． 05，与空白对照组比较;* :P ＜ 0． 05，与模型组比较。
图 2 毛蒟水提物对小鼠 Egr － 1(A)和 TNF － α(B)mＲNA表达的影响(x ± s，n = 10)
3 讨论
CCl4 肝损伤动物模型是实验性肝损伤的经典
模型［6］，当 CCl4 进入体内后，在肝细胞色素 P450
激活下生成自由基，CCl4 通过氢吸附而攻击内质
网膜上的磷脂分子，引起膜的脂质过氧化，导致细
胞膜结构和功能的破坏。CCl4 还可以抑制细胞膜
和微粒体膜上钙泵的活性，使 Ca2 +内流增加，引起
细胞中毒死亡。胞质内 ALT、AST大量释放进入血
液，使血液中 ALT、AST 异常升高［7 － 9］，故血清中
ALT和 AST活性可反映肝脏受损伤的程度。本实
验 CCl4 模型组小鼠 ALT和 AST活性显著升高，同
时组织形态学可见肝小叶病灶性坏死，并伴有炎症
细胞浸润，肝小叶结构被破坏，说明造模成功。给
予毛蒟水提物后，与模型组比较，毛蒟水提物可使
小鼠血清中 ALT活性明显降低，AST 呈下降趋势，
形态学见肝小叶结构基本较完整，炎症细胞浸润明
显减轻，提示毛蒟水提物对 CCl4 诱导的肝损伤具
有保护作用。
Egr － 1 是炎症通路的重要因子，文献报道 Egr
－ 1 能促进脂多糖介导的 TNF － α 的表达，同时还
可以调控众多炎症介质［10 － 12］如 ICAM － 1A、MCP
－1 的表达，促进炎症发生。本实验采用 CCl4 诱
导肝损伤后，模型组 Egr － 1 和 TNF － α 的基因表
达明显上调，毛蒟水提物给药组则可明显下调小鼠
Egr － 1 基因的表达。提示毛蒟水提物对 CCl4 所致
急性肝损伤的保护作用机制可能与其抑制炎症通
路因子 Egr － 1、TNF － α的表达有关。
［参考文献］
［1］谢万宗． 全国中草药汇编［M］． 北京:人民卫生出版
社，1975:271 － 272．
［2］向多庆． 石南藤类中药的研究［J］． 中医药导报，
2005，11(7) :88 － 91．
［3］枉前，张恩娟． 胡椒属植物药理作用的研究概况［J］．
药学实践杂志，2006，24(3) :139 － 141．
［4］周亮，许旭东，杨峻山． 胡椒属植物生物碱及木脂素
类化合物研究新进展［J］． 中国药学杂志，2002，37
(3) :161 － 163．
［5］杨燕，吴芹，龚其海，等． 黔产毛蒟提取物的制备及化
学成分的定性分析［J］． 中国生化药物杂志，2015，35
(5) :169 － 173．
［6］陆远富，Connic W，刘杰，等． Nrf抗氧化损伤通路在四
氮化碳所致小鼠肝毒性的保护作用［J］． 遵义医学院
学报，2015，38(1) :1 － 9．
［7］周琼，刘芳萍，刘颖姝，等． 四氯化碳致小鼠急性肝损
伤动物模型建立方法的研究［J］． 东北农业大学学报，
2012，43(6) :77 － 81．
［8］Zhang J Q，Shi L，Xu X N，et al． Therapeutic detoxifica-
tion of quercetin against carbon tetrachloride － induced a-
cute liver injury in mice and its mechanism［J］． Biomedi-
cine ＆ Biotechnolog，2014，15(12) :1039 － 1047．
［9］田琳，龚其海． 鸭儿芹总黄酮对四氯化碳致急性肝损
伤小鼠的保护作用［J］． 遵义医学院学报，2008，31
(1) :8 － 10．
［10］秦冬梅，胡利萍，文志萍，等． 维药毛菊苣提取物对小
鼠四氮化碳急性肝损伤的保护作用［J］． 中国药理学
通报，2012，28(8) :1180 － 1181．
［11］祁慧，薛斌． EGＲ － 1 在肝损伤中的作用［J］． 世界华
人消化杂志，2011，19(18) :1914 － 1921．
［12］McMullen M Ｒ，Pritchard M T，Wang Q，et al． Early
growth response － 1 transcription factoris essential foreth-
anol － induced fatty liver injury in mice［J］． Gastroen-
terology，2005，128(7) :2066 － 2076．
［收稿 2015 － 12 － 15;修回 2016 － 01 － 10］
(编辑:王静)
·71·
1 期 吴 芹等·毛蒟水提物对 CCl4 所致小鼠肝损伤的保护作用