全 文 ：赤楠(SyzygiumbuxifoliumHook.et.Arn)为桃金娘科蒲桃
属常绿灌木,多生于低山疏林或灌丛中,广泛分布于广东、
广西、贵州、福建、湖南、中国台湾、江西、浙江、安徽等省[1],
资源十分丰富。有研究表明,赤楠叶具有健脾、利湿、平喘之
功效[2],从叶中提取的极性提取物具有较强的抗菌活性[3],其中
叶黄酮含量丰富[4]。
黄酮类化合物是一类具有抗癌、抗衰老、抗炎、降血糖、
降血压、调节内分泌、清除活性氧自由基等药理功能的天然
成分。近年来,不少研究者热衷于从植物体内提取黄酮类化
合物的研究,逐步形成了水提法、有机溶剂提取法、微波法、
超声波法、酶解法、大孔树脂吸附法、超临界萃取法、半仿生
法等多种提取方法与工艺[5-6]。各种提取方法均有其优劣点,
但从工业化生产的角度来看,水提法与有机溶剂提取法是
比较节约成本的 2种方法。其中,水提法成本更低廉、安全
性高[5],但是存在提取时间长、杂质含量较高、提取率较低的
缺点。据此,张志信等根据微波对细胞有强的破碎作用,碱
水对黄酮类化合物有助溶作用的特点,提出了黄酮提取的
微波-碱水法[7]。
鉴于微波-碱水法具有省时、节能、节约成本、高效且操
作简单的优点,笔者采用以该法为主的工艺流程提取赤楠
叶总黄酮,选择具有现实意义的因素水平进行正交试验优
选提取条件,并采用较为简便的紫外分光光度法[8]测定总黄
酮含量的月动态变化,旨在为确定赤楠叶黄酮的提取生产
工艺及适宜的采收期等提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料 赤楠叶分别于每月 25日采自福建省泉州市惠
安笔架山,洗净,阴干,粉碎,过80目筛后密封装袋,-25℃
冷藏备用。标准品芦丁(中国药品生物制品检定所提供),
105℃干燥至恒重;NaOH、HCl等其余试剂均为分析纯。
752型紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司生
产);微波炉(格兰仕,最大功率 750W);电子天平(德国赛
多利斯生产)等。
1.2 方法
1.2.1 赤楠叶总黄酮(LFSB)提取的工艺流程。鲜叶→清洗
除杂→阴干→粉碎、过80目筛→石油醚处理→加碱水浸渍
24h→微波处理→过滤→滤液酸析→粗黄酮。
石油醚处理具体操作:质量足够的赤楠叶粉末分别以
石油醚(30～60℃)为溶剂索氏抽提至提取筒浸出液无色为
止,以去除叶绿素,脱脂、脱蜡之后回收石油醚,计算石油醚
提取物得率,经处理的粉末作为样品备用。
微波处理具体操作:取上述样品与碱水以一定的料液
比混合,浸渍吸胀 24h后,微波间断处理累积一定时间,取
滤液,加HCl酸析得粗黄酮。
1.2.2 单因素试验。分别对微波处理时间、碱水的 pH值、
微波功率和料液比等进行单因素试验与分析,以确定各因
素对LFSB提取率的影响效果及适宜范围。
(1)微波处理时间的影响。精确称取 6份 1.000g赤楠
叶粉末,分别与60倍原料重的pH值为8的碱水混合。浸渍
24h后,在微波功率 450W的条件下,微波间断处理累积
0、3、6、9、12、15min,以提取率为指标考察微波处理时间对
LFSB提取率的影响。
(2)碱水的pH值的影响。精确称取6份1.000g赤楠叶
粉末,分别与 60倍原料重的不同 pH值(7、8、9、10、11、12)
的碱水混合。浸渍24h后,在微波功率 450W的条件下,微
波间断处理累积6min,以提取率为指标考察pH值对LFSB
提取率的影响。
赤楠叶总黄酮微波-碱水法提取工艺及其含量动态研究
黄晓冬,黄晓昆,张月琼 (泉州师范学院教育科学学院,福建泉州 362000)
摘要 [目的]探索赤楠叶总黄酮的提取工艺及含量动态变化。[方法]采取微波-碱水法提取赤楠叶总黄酮,通过单因素试验与正交试
验对其工艺条件进行正交优选,以优选工艺条件提取不同月份的赤楠叶总黄酮,紫外分光光度法测定与考察其含量动态变化。[结果]
微波功率对赤楠叶总黄酮提取率有显著影响,碱水pH值有极显著影响,优化的微波-碱水法提取工艺条件为:以原料50倍量的pH
值为12的碱水,在微波功率300W的条件下提取8min,提取次数为1次;赤楠叶总黄酮含量在11月份左右达到最高,8月份左右降
到最低。[结论]微波-碱水法提取工艺是一种高效的、节约成本的赤楠叶黄酮提取方法,叶黄酮提取的最佳采叶期以11～12月为宜。
关键词 赤楠;叶;黄酮;微波-碱水法;含量动态
中图分类号 S567.1+5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)11-04382-04
StudyonMicrowave!alkaliWaterExtractionTechnicsandDynamicContentofTotalFlavonoidsinSyzyginmbuxifoliumLeaves
HUANGXiao!dongetal(InstituteofEducationalScience,QuanzhouNormalColege,Quanzhou,Fujian362000)
Abstract[Objective]ThestudyaimedtodiscovertheextractiontechnicsanddynamiccontentoftotalflavonoidsinSyzyginmbuxifoliumleaves.
[Method]TotalflavonoidsofSyzyginmbuxifoliumleaveswasextractedbythemicrowave!alkaliwatermethod.Anditsoptimumconditionswere
foundbythesinglefactorsexperimentsandorthogonaltest,andthechangetrendofcontentinoneyearwasfoundbyultraviolet
spectrophotometry.[Result]Microwavepowerhadsignificantefectontheextractionrateoftotalflavonoids,andAlkaliwaterpHvaluehadmore
significantefect.Theoptimumextractionconditionsofmicrowave!alkaliwatermethodwereasfolows:Theratioofmaterialtoliquidwas1∶50,the
alkaliwaterpHvaluewas12,microwavepowerwas300W,microwavetreatmenttimewas8minutes,extractingtimeswas1times.Around
November,theleafflavonecontentreachedthepeak,butaroundAugustitreachedthelowestpoint.[Conclusion]Themicrowave!alkaliwater
extractingtechnicswasthemoreefectiveandeconomicalmethodtoextractSyzyginmbuxifoliumleafflavonoids,andtheperiodofbest!
colecting!leafwasfromNovembertoDecember.
Keywords Syzyginmbuxifolium;Leaves;Flavonoids;Microwave!alkaliwaterextractionmethod;Dynamiccontent
基金项目 福建省教育厅科技项目(JA05318)资助。
作者简介 黄晓冬(1973-),男,福建南安人,硕士,讲师,从事植物资源
学方向的研究。
收稿日期 2008!01!21
安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2008,36(11):4382-4385 责任编辑 姜 丽 责任校对 马君叶
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2008.11.130
(3)微波功率的影响。精确称取 6份 1.000g赤楠叶粉
末,分别与60倍原料重的pH值为8的碱水混合。浸渍24h
后,用不同功率(0、150、300、450、600、750W)的微波间断处
理累积6min,以提取率为指标考察微波功率对LFSB提取
率的影响。
(4)料液比的影响。精确称取6份1.000g赤楠叶粉末,
分别与 pH值为 8的碱水按不同料液比(W/V)(1∶30、1∶40、
1∶50、1∶60、1∶70、1∶80)混合。浸渍 24h后,在微波功率 450
W的条件下,微波间断处理累积6min,以提取率为指标考
察料液比对LFSB提取率的影响。
1.2.3 正交试验。在单因素试验的基础上,考虑各因素间
可能的交互作用,从节约成本、降低能耗、提高提取率的角
度确定4个水平。按L16(45)正交设计与试验,并结合提取次
数的筛选,最终确定最适的提取条件。正交试验因子水平设
计见表1。
1.2.4 赤楠LFSB提取率测定。总黄酮含量测定采用紫外分
光光度法[8],以芦丁为标准品,用最小二乘法对浓度(C,g/L)
与吸光度值(A265)进行线性回归,得方程 A=29.2838C+
0.0052,相关系数r=0.9992,线性范围为0～0.075g/L。
精确称取处理过的1.000g赤楠叶粉末样品,按设定工
艺流程提取,粗黄酮用 60%乙醇定容至 250ml,作为样液;
精确吸取样液0.5ml,用60%乙醇稀释并定容至50ml,作为
测试液,测定A256,代入回归方程求得C,计算黄酮提取率:
提取率(得率∥%,以芦丁计)=CV1V3/WV2×1/10
式中,C为测试液中黄酮浓度(g/L);V1为样液的定容体积
(ml);V2为取样体积(ml);V3为稀释定容体积(ml);W为称
样量。此外,进行精密度试验与回收率试验。
1.2.5 赤楠LFSB含量的季节动态。以优化的工艺条件按工
艺流程提取不同月份的赤楠 LFSB,同时按“1.2.4”测定得
率,考察与分析LFSB含量的月动态变化。
2 结果与分析
2.1 检测波长的确定 在 220～285nm波长范围内测定样
液最大吸收波长。结果显示,赤楠叶黄酮样液的吸收曲线在
(265±10)nm处有最大吸收峰,与芦丁的最大吸收波长265
nm相似。因此,确定265nm为样液的测定吸收波长。
2.2 测定方法的检验
2.2.1 重复性试验。平行试验 10次,测得相对标准偏差
RSD为1.87%。这说明该测定方法的重现性良好,精密度较高。
2.2.2 回收率试验。取 2个具塞试管。1号管为 1ml60%乙
醇+0.5ml样液,2号管为 1ml芦丁标样+0.5ml样液。分别
以60%乙醇定容至50ml,作空白参比,于265nm波长处测
A值,代入回归方程得黄酮含量。以加标测得黄酮含量减去
样品黄酮量,除以加标量,所得的值即回收率。其结果见表
2。由表 2可知,平均回收率为 95.85%。这说明试验所采用
的提取纯化技术及测定方法具有较高的准确性。
2.3 单因素试验
2.3.1 微波处理时间对LFSB提取率的影响。由图1可知,
LFSB提取率在0～6min内随时间的延长有较明显的提高,
此后随时间延长提取率变化不大。这与微波萃取银杏叶黄
酮类化合物[9]的研究结果相似。因此认为,长时间的微波处
理并不足以大幅提高提取率,6min左右的处理时间是较好
的选择。与传统加热回流提取赤楠 LFSB的时间约 1h[4]相
比,微波处理方法充分体现了省时、节能的优点。
2.3.2 pH值对 LFSB提取率的影响。由图 2可知,LFSB提
取率在 pH值为 7～10时增幅不大,当碱度继续增大时,
LFSB提取率骤然上升,并在pH值为12时得率达到12.42%。
但由于强碱下加热提取易破坏黄酮类化合物母核[10],因而,
碱水的碱度不宜过大或者可加硼酸保护[6]。
2.3.3 微波功率对 LFSB提取率的影响。由图 3可知,LFSB
提取率基本上随微波功率增大而增大。这说明微波功率越
大对叶细胞的破碎作用越强,胞外溶剂容易进入细胞内,溶
解并释放出黄酮类化合物;但过大的功率,容易使提取体系
短时间达到高温,导致提取体系压力升高,造成样品与提取
液的溅出,从而产生误差。因而,提取时可采取分次间断微
表2 回收率试验结果
Table2 Testresultoftherecoveryrate
试验号
Test
No.
样品黄酮
量Flavone
amountin
sample
mg
加标量
Standard
adding
amount
mg
加标后样品黄
酮量Sample
flavoneamount
afteradding
standard∥mg
回收率
Recovery
rate∥%
平均回收
率Average
recovery
rate∥%
1 0.2973 0.1000 0.3959 98.60 95.85
2 0.3053 0.1000 0.3984 93.10
表1 正交设计的因子水平设计
Table1 Factorleveloforthogonaldesign
水平
Level
微波处理时间A
Microwavetreatment
time∥min
pH值B
pHvalue
微波功率C
Microwave
power∥W
料液比D(W/V)
Solid!liquidratio
1 4 9 150 1∶30
2 6 10 300 1∶40
3 8 11 450 1∶50
4 10 12 600 1∶60
黄晓东等 赤楠叶总黄酮微波36卷11期 4383
表3 正交试验结果与分析
Table3 Resultsandanalysisoforthogonaltest
试验号
TestNo.
微波处理
时间A
Microwave
treatment
time
pH值B
pHvalue
微波功率
C
Microwave
power
料液比D
Solid!
liquid
ratio
空白
E
Blank
提取率
Extraction
rate∥%
1 1 1 1 1 1 6.03
2 1 2 2 2 2 7.08
3 1 3 3 3 3 7.14
4 1 4 4 4 4 9.28
5 2 1 2 3 4 7.65
6 2 2 1 4 3 6.60
7 2 3 4 1 2 6.16
8 2 4 3 2 1 11.61
9 3 1 3 4 2 6.60
10 3 2 4 3 1 6.58
11 3 3 1 2 4 7.24
12 3 4 2 1 3 12.86
13 4 1 4 2 3 5.78
14 4 2 3 1 4 6.49
15 4 3 2 4 1 8.63
16 4 4 1 3 2 12.21
R 0.937 4.975 2.105 0.618 0.548
波辅射的方法。
2.3.4 料液比对LFSB提取率的影响。由图 4可知,料液比
越大越有利于 LFSB的提取,料液比越小提取率越低。其原
因可能是提取剂用量的增大使微波加热的负荷增大,大部
分微波能被溶剂吸收,导致细胞破壁不理想所致;另外,料
液比越小越容易造成大量的物料上浮于溶剂表面,减小料
液接触面积,影响溶剂与溶质的传动;同时,溶剂用量增加
后,更多的其他化学成分溶出也会增加,从而干扰黄酮类化
合物与溶剂分子的结合。
2.4 提取条件的正交优化结果 从表 3可以看出,提取剂
的pH值对 LFSB提取率有极显著影响,微波功率对 LFSB
提取率有显著影响。4种因素影响LFSB提取率的大小顺序
依次为:pH值(B)>微波功率(C)>微波处理时间(A)>料液
比(D)。最佳提取工艺为 A3B4C2D3,即以原料 50倍量的 pH
值为12的碱水,在微波功率300W的条件下提取8min。在
优化条件下提取LFSB,得率为15.72%。
2.5 提取次数的确定 精确称取1.000g赤楠叶粉末3份,
采用A3B4C2D3工艺条件分别提取1次、2次、3次,试验结果
见表 4。由表 4可知,随着提取次数的增加,黄酮得率增幅
不大。考虑节约成本的经济性原则,提取次数以1次为宜。
2.6 赤楠LFSB含量的月动态变化 由图5可知,LFSB含
量在 11月份时最高,达 15.72%;8月份最低,为 5.58%。黄
酮类化合物的合成属于次生代谢,其含量水平与植物体初
生代谢、环境因子等因素相关。
根据赤楠植物体生长发育与笔架山生态因子的特点,
12月至翌年2月份笔架山处于冬季,低温使赤楠叶基本上
处于生长停滞期,此时,叶的次生代谢有所增强,黄酮的合
成与累积强于转化。因而,这些月份的黄酮含量相对较高。
3、4月份,赤楠正值新梢和叶芽的速生期,初生代谢渐
渐旺盛,累积的有效成分被消耗与分解,因此次生代谢的底
物不足;且这段时间是降水季节,持续的阴雨天气使光照强
度减弱,次生合成速率慢。因而,黄酮等次生物质的累积呈
下降趋势。
5～7月份,赤楠叶处于生长高峰期,初生代谢活动活
跃,产生了较多的中间产物,但大多供给营养生长的需要,
并没有充足到大量激活相关次生代谢调节酶,引起次生代
谢高峰的程度。因而,赤楠叶黄酮的次生合成虽有所加强,
含量较4月份有所增加,但总体上仍处于相对较低的水平,
并且在整个生长高峰期间含量变化不大。
8月份,赤楠转入花芽期,营养物质除了继续满足营养
生长的需要外,还大量供给生殖生长;再加上此时笔架山正
处于盛夏季节,天气炎热,昼夜温差较小,不利于叶总黄酮
的合成。因而,黄酮含量急剧下降,达到全年最低水平。
进入秋高气爽的9～11月份,较大的温差和充足的光照
加快诱导黄酮的合成与累积,同时,营养生长减弱,开花结
表4 提取次数对赤楠LFSB提取率的影响
Table4 EfectsofextractiontimesonLFSBextraction
rateofSyzygiumbuxifoliumHook.et.Arn
提取次数Extractiontimes∥次 提取率Extractionrate∥%
1 15.72
2 15.74
3 15.88
图5 不同月份赤楠叶总黄酮含量的变化
Fig.5 ChangesoftotalflavonoidscontentsinSyzygiumbuxifolium
Hook.et.Arnleavesatdiferentmonths
安徽农业科学 2008年4384
(上接第4378页)
纬度或同纬度下不同季节冠层受光状态的差异,以及直射
光和散射光的比率不同时造成的冠层光合作用的变化。
(3)太阳辐射在冠层内的传输和分布是冠层光合作用
的能量基础,因此可以在冠层光分布模型的基础上进一步
建立冠层光合作用的数值模型,进而估算作物的生产潜力,
为作物育种与栽培提供科学依据。
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实的生理过程需要部分初生代谢产物转化为总黄酮等次生
代谢产物发挥重要的生理调节功能。因而,黄酮含量持续上
升,并在11月份果实熟化期达到全年的最高峰。
3 结论与讨论
(1)目前,植物体内黄酮含量的测定方法有紫外分光光
度法[8]、硝酸铝比色法[11]、三波长-光谱法[12]、荧光光度法[13]、
高效液相色谱法(HPLC)法[14]和聚酰胺吸附-硝酸铝显色
法[4]等方法。同其他方法相比,紫外分光光度法相对较为简
便,但在碱性介质中,黄酮类化合物可以产生一些颜色变化,
其类型不同,呈现情况亦不同[10],再加上杂质的影响,使得
该测定法误差较大,并不具有普适性。为此,该试验对该测
定进行最大吸收波长的确定、重复性试验以及回收率试验,
试验结果均说明了该试验所采用的提取纯化工艺与紫外分
光测定法的相互结合可提高测定的精密度与准确性。
(2)试验表明,微波-碱水法是行之有效的提取赤楠叶
总黄酮的方法,其最适工艺条件为微波作用时间为 8min,
pH值为 12,微波功率为 300W,料液比为 1∶50,提取 1次。
微波强大的短时升温与细胞破碎功效,有利于细胞内成分
的快速提取,微波功率对赤楠 LFSB提取率有显著影响,但
是高功率易造成提取体系温度与压力短时升高,溶剂与物
料易溅出,因而,除了加入沸石防暴沸、提取容器打孔降压
外,生产上有必要发明与革新具有冷凝回流的大型微波装
置,并采取多次冷却、间断累积提取等措施来保证充分的提
取。由于黄酮分子大多具有酸性的酚羟基[10],碱水的应用显
然有利于黄酮类的溶解与浸出,碱水提取液经酸化沉淀可
以析出黄酮类化合物。这种碱溶酸析的方法操作简单,简化
了黄酮提取后的后续处理,降低了提纯成本。试验发现,碱
水的pH值对赤楠LFSB提取率有极显著影响,碱度越高提
取率也越高,但是黄酮类化合物母核在强碱下加热时容易
遭到破坏,因而,强碱环境提取所得的黄酮类化合物有待于
进行构效研究。
(3)黄酮类化合物是植物体内重要的次生代谢物质之
一,在不同植物中的积累动态不同,但一般符合次生代谢物
合成积累高峰与年生长速率高峰相互错位[15]的特点。从发
育进程的植物生理变化规律看,营养生长期初生代谢旺
盛,次生代谢处于低谷;到生殖生长期,由于开花传粉等生
理过程需要叶不断合成并转移一些生理调节物质,因而,次
生代谢渐渐加强;当生长高峰期过后,次生代谢在大量初生
代谢中间产物的激活下达到高峰,次生物质含量显著增加。
赤楠LFSB含量变化基本符合这一变化规律。在叶的营养生
长期,LFSB含量相对较低且变化幅度不大,并在生殖生长
初期(8月份左右)达到全年最低,此后,含量逐渐增加,并
在果实熟化期与冬季的生长停滞期间处于全年中的较高含
量水平。此外,从环境因子的影响来看,低温、较强的光照、
较大的温差与适当干旱均可以促进黄酮的合成和积累[16],
这也是赤楠 LFSB在秋季到冬季的较长时间内保持较高含
量的原因之一。可见,赤楠 LFSB含量的月动态变化是生长
发育的基因调控与环境因子影响等共同作用的结果。该研
究确定了赤楠LFSB适宜的采叶时期为11月份左右到翌年
1月份左右,即从果实熟化期到生长停滞期的较长时程;同
时提供了通过环境因子调控黄酮合成、提高黄酮含量的新
思路。
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黄晓东等 赤楠叶总黄酮微波36卷11期
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