全 文 ：国药鉴别
收稿日期:2013-04-01; 修订日期:2013-09-20
基金项目:山东省农业良种工程项目( No． 2011LZ01 － 03)
作者简介:刘 杨( 1981-) ，女( 汉族) ，山东潍坊人，山东中医药大学实验
师，主要从事中药资源与质量控制研究工作．
女贞与日本女贞的 ＲAPD分析
刘 杨，包华音，李巧玉
(山东中医药大学，山东 济南 250355)
摘要:目的 利用 ＲAPD技术从分子水平对女贞和日本女贞进行鉴定。方法 采用改良 CTAB 法提取女贞和日本女贞叶
片 DNA，从 S系列 20 对引物中筛选出能稳定扩增的 3 对引物，对 DNA进行 PCＲ扩增，采用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物
进行分离。结果 女贞与日本女贞在 DNA方面有共同特征，也存在显著差异。结论 ＲAPD 分子标记技术显示了女贞和
日本女贞之间明显的种间差异，可以用于二者的鉴定，为女贞的进一步研究提供实验依据。
关键词:CTAB; ＲAPD; 女贞; 日本女贞
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 01． 043
中图分类号:Ｒ282． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2014) 01-0103-02
The ＲAPD analysis of Ligustrum lucidum and Ligustrum japonicum
LIU Yang，BAO Hua-yin，LI Qiao-yu
( Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China)
Abstract: Objective The ＲAPD technique was applied to identify Ligustrum lucidum and Ligustrum japonicum at molecular lev-
el． Methods The total DNA was extracted by improved CTAB method from young leaves of Ligustrum lucidum and Ligustrum ja-
ponicum． Three pairs of primers selected from 20 pairs of ＲAPD primers were applied for the amplification on the materials men-
tioned above． The amplified products were separated by agarose gel electrophoresis． Ｒesults Despite the similarity，there were
significant differences between Ligustrum lucidum and Ligustrum japonicum in the DNA character． Conclusion ＲAPD markers
could be used to identify the difference between Ligustrum lucidum and Ligustrum japonicum，and the research provided experi-
mental basis for the further studies of Ligustrum lucidum．
Key words: CTAB; ＲAPD; Ligustrum lucidum; Ligustrum japonicum
女贞 Ligustrum lucidum Ait． 和日本女贞 Ligustrum japonicum
Thumb．均为木犀科女贞属常绿灌木或小乔木，二者叶子及花的
形态极为相似。其中，女贞的成熟果实晒干后为中药女贞子，其
性凉，味甘苦、可明目、乌发、补肝肾。而日本女贞的果实、树皮和
叶均有毒，其种子可为强壮剂，叶捣烂可敷肿毒，常被作为绿化树
种［1］。近年来日本女贞的果实被误采误用为女贞子的情况时有
发生，二者仅凭传统的性状、显微鉴别等方法较难区分。
ＲAPD分子标记技术具有快速简便、准确性较高等优点，广
泛应用于植物种质资源遗传多样性的检测、种质与品种鉴定、种
间关系的确定和种下划分等分类学问题的研究［2］。本实验通过
ＲAPD技术对女贞和日本女贞进行种间鉴别，以保证女贞药材来
源的准确，并为女贞的进一步研究提供实验依据。
1 材料、仪器和试剂
1． 1 材料 女贞和日本女贞分别采自山东中医药大学经十路校
区和长清校区，实验材料经山东中医药大学李峰教授鉴定。
1． 2 仪器 96 孔 PCＲ仪，移液枪，水平电泳槽，FＲ － 200A全自动
紫外与可见分光装置，Bio Sens凝胶成像系统，H － 1850Ｒ台式高
速冷冻离心机，DYCP － 31BM型电泳槽，DYY － 8B型稳压稳流电
泳仪，BCD － 215T BDZ冰箱，恒温水浴锅等。
1． 3 试剂 核糖核酸酶液、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、β －巯基乙
醇、乙二胺四乙酸二钠、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、DNA METEＲ
DL2000(TIANGEN公司生产)、EB、三羟甲基氨基甲烷、CTAB(十
六烷基三甲基溴化铵)、氯化钠、盐酸、琼脂糖、异戊醇、正戊醇、
无水乙醇、氯仿、ＲAPD随机引物(赛百威公司生产)。
2 方法
2． 1 总 DNA的提取 称取女贞和日本女贞的新鲜叶片各 1 g，采
用改良 CTAB法提取叶片总 DNA［2，3］。步骤如下:取 10 ml 离心
管加入 2 ml 2% CTAB提取缓冲液，加入 50 μl β －巯基乙醇，65
℃水浴中预热 20 min。把称取的样品放入研钵中，加 0． 1 g PVP，
加入液氮，迅速研磨成细末，并转移至预热的 10 ml离心管中，65
℃保温 15 min，轻轻颠倒数次，取出冷至室温。加入等体积氯仿
－乙醇 －戊醇(20∶ 4∶ 1)的混合液，轻轻振荡混匀，10 000 r·
min －1离心 10 min。将上清液转至新的离心管中，重复上一步操
作。取上层水相 1 ml，加入 3 ml － 20 ℃的无水乙醇，挑出白色絮
状物放入 1． 5 ml 离心管中，用 600 μl 70%乙醇漂洗 2 ～ 3 次，瞬
时离心。将沉淀置于超净工作台风干至透明状，加入 200 μl TE
缓冲液溶解，并分别测量并记录二者的吸光度。
2． 2 PCＲ 反应体系 25 μl 反应总体积中含有 10 × PCＲ buffer
2． 5 μl，2 mmol·L －1 dNTPs 4． 0 μl，0． 5 μmol·L －1随机引物 2． 0
μl，1 U Taq DNA 聚合酶 1． 0 μl，20 ng·μl － 1模板 DNA 2． 0 μl，
ddH2O 13． 5 μl
［3］。
2． 3 ＲAPD扩增与电泳分析 ＲAPD 扩增程序:94 ℃预变性 2
min，然后进入 40 个循环(94 ℃变性 1 min、36 ℃退火 40 s、72 ℃
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延伸 2 min)，后 72 ℃延伸 10 min。1%琼脂糖凝胶电泳分离 PCＲ
扩增产物，样品上样量为 10 μl，Marker上样量为 6 μl，1 × TAE缓
冲液，以溴酚蓝为电泳指示剂，电压 25V，电泳约 3 h。结束后凝
胶成像并计算谱带 Ｒf 值。
3 结果与结论
3． 1 DNA含量与纯度 由表 1 可见，采用同样的提取方法，日本
女贞提取的 DNA量比女贞多且提 DNA纯度高，但二者所提取的
DNA中都有少量蛋白质和酚的污染。
表 1 女贞和日本女贞 DNA提取结果的比较
样品 浓度 /μg·μl － 1 纯度
女贞 1． 026 ～ 1． 328 1． 60 ～ 1． 85(80%介于 1． 7 ～ 1． 9)
日本女贞 0． 900 ～ 1． 824 1． 61 ～ 1． 90(60%介于 1． 7 ～ 1． 9)
3． 2 ＲAPD扩增结果 从 20 对随机引物中筛选出谱带清晰稳定
的引物 3 对:SBSD2、SBSD8、SBSD11，用这 3 对引物对两组实验材
料分别进行 ＲAPD扩增。
3． 2． 1 电泳图谱 见图 1 ～ 3。
图 1 SBSD2 引物扩增结果 图 2 SBSD8 引物扩增结果
图 3 SBSD11 引物扩增结果
3． 2． 2 泳动率 按下列公式计算女贞和日本女贞的主要鉴别谱
带泳动率。泳动率(Ｒf)= 谱带泳动距离 / 示踪指示剂泳动距
离［4］。实验结果见表 2 ～ 4。
表 2 引物 SBSD2 扩增 DNA谱带的 Ｒf 值
样品 1 2 3 4 5
女 贞 0． 61 0． 67 0． 75 0． 79 0． 87
日本女贞 0． 59 0． 65 0． 71 0． 74 0． 78
表 3 引物 SBSD8 扩增 DNA谱带的 Ｒf 值
样品 1 2 3 4 5
女 贞 0． 30 0． 46 － 0． 63 －
日本女贞 0． 30 0． 46 0． 55 0． 63 0． 70
表 4 引物 SBSD11 扩增 DNA谱带的 Ｒf 值
样品 1 2 3 4 5
女 贞 0． 51 0． 62 0． 65 0． 72 0． 79
日本女贞 0． 51 0． 60 0． 66 0． 72 0． 79
根据电泳图谱和不同随机引物扩增条带的 Ｒf值数据可以看
出，女贞和日本女贞分别用 SBSD2 引物扩增出的 DNA 条带有差
异最显著。二者分别用 SBSD8 引物扩增出的 DNA 条带也表现
出较大差异，其中，1、2、4 号条带是女贞和日本女贞的共有谱带，
Ｒf 值相同，但是女贞没有 3 号和 5 号条带。二者用 SBSD11 引物
扩增出的谱带差异较小，只有 2 号谱带 Ｒf 值不同，其余谱带均为
共有谱带。
从条带的明亮度来看，谱带色深者为一级条带，色浅者为二
级条带，色极浅者为三级条带。SBSD2 引物扩增出的女贞谱带具
有四条二级条带，一条三级条带。日本女贞存在两条一级谱带，
三条二级谱带，且二级谱带的位置与女贞的二级谱带有较大差
异，二者的差异性最大。SBSD8 引物扩增出的日本女贞谱带具有
一级条带一条，二级条带四条;女贞只存在二级谱带三条，且这三
条谱带也是女贞和日本女贞的共有谱带。SBSD11 引物扩增出的
女贞和日本女贞的谱带都有一级条带和二级条带，无三级条带，
且条带位置差异较小。
4 讨论
ＲAPD技术已被广泛应用于药用植物种质资源鉴定研究，是
一种较为有效的中药鉴定方法。本研究利用 ＲAPD 技术从分子
水平鉴别女贞和日本女贞，不仅可以体现二者的亲缘关系，还可
以方便、准确的鉴别二者，方法简便，结果可靠，效果较好。此外，
DNA样品的纯度在一定程度上会对 DNA 琼脂糖凝胶电泳产生
影响，在实验操作过程中应尽可能减小或消除。本研究为女贞的
进一步研究提供了实验依据。
参考文献:
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