全 文 ：50
第 1 6卷 第 3 期
2014 年 3 月
辽 宁 中 医 药 大 学 学 报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol. 16 No. 3
Mar .，2014
狼毒大戟（Euphorbia fischeriana steud）为大
戟科植物，用药部分为其根，主要分布在黑龙江、
内蒙古、吉林、辽宁、河北等地。据《本草纲目》的
引证，狼毒大戟在《神农本草经》、南北朝时期陶
弘景的《本经集注》和《名医别录》、唐代苏恭等
的《唐本草》、五代时期韩保升的《蜀本草》、宋代
马志等的《开宝本草》及苏颂的《图经本草》等著
作中均有记载。此外，狼毒大戟在清代吴其浚的
《植物名实图考》亦有记述。狼毒大戟其味辛，性
平，有毒。入肺、肝、脾，具有逐水祛痰、散结杀虫
的功效。
现代医学和中医学研究均发现其有抗肿瘤作
用。近年来，对狼毒大戟的研究在化学成分、生物
农药、抗肿瘤作用等方面均有进展[1]。月腺大戟
（Euphorbia ebracteolata Hayata），又名狼毒，为大戟
科大戟属植物，始载于《神农本草经》，其味辛，性
平，有大毒[2]。月腺大戟具有逐水祛痰和破积杀虫
的功效，可治水肿腹胀、淋巴结核、慢性气管炎等
症[3]。临床多用于癌症和结核病的治疗[4-5]。但是
近几年来研究发现不同产地大戟科狼毒的药效和其
中的化学成分不一样，甚至有比较明显的差异。众
多文献显示大戟科的植物产生这样的差异可能是因
为种质资源的不同。种质资源是影响农作物产量和
质量的一个重要因素，现已有学者对大戟科的植物
例如蓖麻、麻疯树等种质资源建立了分子标记鉴定
方法。[6-7]
分子标记技术已经广泛的运用于现在的药
物基因组DNA的分析之中，主要有ISSR、RAPD、
ISSR标记不同产地的大戟科狼毒种质资源多样性分析
李伟1，李莉1，陈振江2
（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600 ；2.湖北中医药大学药学院，湖北 武汉 430065）
摘 要：目的：利用ISSR分子标记技术对不同产地的大戟科狼毒进行了遗传多样性分析。方法：从100条引物
中挑选出12条合适的引物对不同产地的大戟科狼毒进行遗传多样性分析。结果：12条引物一共扩增出353条带，用
SPSS16.0软件分析，建立了Jaccard相关系数矩阵，构建了遗传树状图，从该图中可知各产地大戟科狼毒的相似系数
在0.258~0.845 ；大戟科狼毒遗传变异与地理分布呈现较明显的相关性。结论：ISSR标记适合于大戟科狼毒基因组
DNA多样性分析；ISSR分子标记技术对于大戟科狼毒种质资源划分上有十分重要的影响。
关键词：大戟科狼毒；遗传多样性；ISSR
中图分类号：R282.2 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2014) 03- 0050- 03
收稿日期：2013-08-26
作者简介：李伟（1962-），男，辽宁沈阳人，实验师，学士，研究方向：中药制剂研发。
通讯作者：陈振江（1953-），男，湖北武汉人，教授，学士，研究方向：药物制剂新技术新方法及制剂质量控制。
Genetic Diversity of Germplasm Resources of Euphorbia
Fischeriana Steud Based on ISSR Makers
LI Wei1，LI Li1，CHEN Zhenjiang2
（1.Liaoning Univerestiy of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，Liaoning，China ；
2. Hubei Univerestiy of Traditional Chinese Medicine，Wuhan 430065，Hubei，China）
Abstract ：Obejective ：Population genetic diversity of Euphorbia fischeriana steud with different
habitats was assessed by inter-simple sequence repeat（ISSR）technique. Methods ：Twelve appropriate
primers were selected out from a total of one hundred ones for ISSR PCR amplification，and population
genetic structures were assessed by using SPSS 16. 0 software. Results ：The twelve primers could amplify
three hundreds and fifty three bands. Based on them，a Jaccards genetic similarity matrix and a dendrogram
were established using SPSS 16. 0 software. The dendrogram showed that Pinellia ternata in different
habitat similarity coefficients was between 0.258 and 0.845. The Euphorbia fischeriana steud showed a
clear correlation between genetic variation and geographic distribution. Conclusion ：These results suggest
that ISSR markers could be used as an effective molecular technique for the diversity study of Euphorbia
fischeriana steud ；ISSR molecular marker technology has an important impact on Euphorbia fischeriana
steud germplasm resources division.
Key words ：Euphorbia fischeriana steud ；genetic diversity ；ISSR
DOI ：10.13194/j.issn.1673-842x.2014.03.018
51
1 6 卷 辽 宁 中 医 药 大 学 学 报
RFLP、AFLP。本实验采用了ISSR分子标记技术，
ISSR技术具有操作简单、模板需要量少、多态性
丰富、结果记录方便、实验成本低、操作简单等优
点，因此该分子标记技术目前被广泛应用于植物
遗传多样性的评价及种质资源鉴定中[8-9]。植物群
体遗传结构及影响因子的研究工作对植物资源的
利用、保护及植物的遗传改良有着重要意义[10-11]。
ISSR分子标记技术已经被广泛地运用于大戟科植
物种质资源多样性的分析，但是目前关于大戟科
狼毒种质资源多样性的分析资料却很少，故本实
验采用ISSR分子标记技术研究大戟科狼毒基因组
DNA多样性的分析。
1 材料与仪器
1.1 材料
9种不同产地的大戟科狼毒分别采自：四川成
都、安徽亳州、甘肃宁夏、黑龙江哈尔滨、山东济南、
湖北蕲春、内蒙古锡林郭勒盟、河北保定、吉林长春。
具体编号产地见表1。
表1 不同产地的大戟科狼毒采集时间
编号 品种 产地 采集时间
1 狼毒大戟 黑龙江哈尔滨 2011.09
2 狼毒大戟 安徽毫州 2011.11
3 狼毒大戟 甘肃宁夏 2011.11
4 狼毒大戟 四川成都 2011.06
5 狼毒大戟 河北保定 2011.07
6 狼毒大戟 湖北蕲春 2011.12
7 狼毒大戟 内蒙古锡林郭勒盟 2011.05
8 狼毒大戟 吉林长春 2011.07
9 月腺大戟 山东济南 2011.08
1.2 试剂与仪器
PCR的相关试剂：植物基因组DNA提取试剂盒
（离心柱型）包括（Genclean Column、PCL Solution、
PB Solution、Ext Solution、Wash Solution、Elution
Buffer、RnaseA）（上海捷瑞生物工程有限公司），
dNTPS、ISSR引物、Mark（上海捷瑞生物工程有限
公司）。主要实验仪器：GDS-8000凝胶成像分析系
统（UVP公司，美国），PCR扩增仪（Tcradient，德国），
DYY2 Ⅲ28A 型夹芯式垂直电泳槽、DYY2 Ⅲ26B
型稳压电泳仪（北京六一仪器厂）。
2 实验方法
2.1 大戟科狼毒总DNA的提取与浓度测定
采用上海捷瑞生物工程有限公司植物DNA
提取试剂盒提取基因组DNA，利用20%的变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据样品OD260/OD280
分析纯度，以1.8为宜，根据OD260计算DNA浓
度。
2.2 ISSR扩增及产物检测
ISSR引物序列参考University of British Columbia
提供的标准序列，通过预实验从100个引物中筛选
出12个能稳定扩增且背景清晰的引物（见表2）。
ISSR的最佳反应体系为：DNA模板量：10 ng，10×
PCR buffer 3 μL，MgCl ：2 μL，dNTPs（2.5 mM/L）：
2 μL，引物（10 μm/L）：2 μL，Taq酶（5 U/μL）：
1 μL。PCR扩增程序为：（1）94 ℃预变性5 min ；（2）
94 ℃变性30 s ；（3）48 ℃复性45 s ；（4）72 ℃延伸
2 min ；（5）进行38个循环；（6）循环结束后72 ℃延
伸7 min ；（7）4 ℃ 10 min即终止反应。
表2 稳定扩增且背景清晰的引物
编号 引物序列 退火温度（℃）
UBC811 GAG AGA GAG AGA GAG AT 48
UBC818 CAC ACA CAC ACA CAC Ag 44
UBC835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC 41
UBC840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT 48
UBC842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG 47
UBC848 CAC ACA CAC ACA CAC ARG 46
UBC850 GTG TGT GTG TGT GTG TYC 42
UBC873 GAC AGA CAG ACA GAC A 41
UBC886 VDV CTC TCT CTC TCT CT 45
UBC889 DBD ACA CAC ACA CAC AC 49
UBC891 HVH TGT GTG TGT GTG TG 41
UBC895 AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC 48
PCR产物在20%的聚丙烯酰胺凝胶电泳中检
测，以100 bp Marker作为标准分子量对照，先以
40 V的电压电泳1 h，再以80 V的电压电泳4 h。在
凝胶成像仪上观测分析并且照相。
2.3 数据统计与分析
根据ISSR扩增条带的有无，以1和0表示。
具体而言在相同迁移位置，有条带记为1，无条带
记为0。用SPSS16.0计算样品间的Jaccard 相似
系数，并进行聚类分析，建立样品间的亲缘关系
树。
3 结果与分析
对表1中9个不同产地大戟科狼毒进行ISSR
扩增，结果见表3和图1。Jaccard 相似系数矩阵和
聚类系统树见图2和表4。共扩增出353条带，其中
308条具有多态性，多态位点百分率为87.3%。各
引物扩增的条带数为13~43条，平均扩增条带数为
25。
表3 不同产地大戟科狼毒ISSR扩增结果
引物编号 总条带数（个） 多态条带数（个） 多态百分率（%）
UBC811 37 37 100
UBC818 26 26 100
UBC835 43 43 100
UBC840 17 15 88
UBC842 31 30 97
UBC848 27 13 48
UBC850 28 17 61
UBC873 29 19 66
UBC886 32 30 94
UBC889 35 31 89
UBC891 33 33 100
UBC895 15 14 93
M ：100 bp DNA谱带，0为阴性对照品，1~9 代表
物种顺序。
图1 引物UBC835扩增谱带
52
辽 宁 中 医 药 大 学 学 报 1 6 卷
图2 不同产地大戟科狼毒聚类树状图
表4 不同产地大戟科狼毒的相似系数
Cosine of Vectors of Values
项目 VAR00001 VAR00002 VAR00003 VAR00004 VAR00005 VAR00006 VAR00007 VAR00008 VAR00009
VAR00001 1.000 0.655 0.516 0.516 0.667 0.516 0.258 0.436 0.707
VAR00002 0.655 1.000 0.845 0.845 0.655 0.676 0.676 0.857 0.772
VAR00003 0.516 0.845 1.000 0.800 0.775 0.600 0.600 0.676 0.730
VAR00004 0.516 0.845 0.800 1.000 0.516 0.400 0.400 0.676 0.548
VAR00005 0.667 0.655 0.775 0.516 1.000 0.516 0.258 0.436 0.707
VAR00006 0.516 0.676 0.600 0.400 0.516 1.000 0.800 0.676 0.730
VAR00007 0.258 0.676 0.600 0.400 0.258 0.800 1.000 0.845 0.730
VAR00008 0.436 0.857 0.676 0.676 0.436 0.676 0.845 1.000 0.772
VAR00009 0.707 0.772 0.730 0.548 0.707 0.730 0.730 0.772 1.000
从Jaccard 相似系数矩阵中可知各产地大戟科
狼毒的相似系数在0.258~0.845。聚类树状图上显
示9种不同产地大戟科狼毒共聚为3支，第1支为6
号（湖北蕲春狼毒大戟）、7号（内蒙古锡林郭勒盟狼
毒大戟）、8号（吉林长春），其中7号与8号先聚为1
支，而后与6号聚为1支。第2支为2号（安徽亳州狼
毒大戟）、4号（四川成都狼毒大戟）。第3支为1号（黑
龙江哈尔滨狼毒大戟）、3号（甘肃宁夏狼毒大戟）、5
号（河北保定狼毒大戟）、9号（山东济南月腺大戟）。
这一支中3号和5号先聚为1支然后与1号和9号聚
为一支。最后这1支与2号和4号共聚为1支。结果
显示地理距离相对比较近的同一产地的药材部分聚
在一起，表明大戟科狼毒遗传变异与地理分布呈现
较明显的相关性，说明大戟科狼毒产区之间的遗传
分化较明显。
4 讨 论
不同产地大戟科狼毒的药效和其中的化学成
分不一样，甚至有比较明显的差异。众多文献显示
大戟科的植物产生这样的差异是因为生长的地域不
同，但是大戟科狼毒产生这样差异的原因尚未探明。
本研究综合分析大戟科狼毒各居群的Jaccard相似
系数，发现不同产地的大戟科狼毒间相似性较高，但
是南方和北方产的大戟科狼毒之间的基因组DNA
还是有明显的差异，产生差异的原因除了不同的地
域关系之外，还可能与栽培样品的种质来源较多有
关。
正交法运用于PCR反应条件的优化：PCR反应
中所应用的各种试剂都有一个最佳的使用范围，用
量过多或者用量过少都会直接影响PCR扩增的效
果。此外，各种试剂之间都会存在相互影响的特点，
每种试剂如果单独调整其使用量，不但需要多次的
反应，而且可能与各种试剂的最佳用量相互产生冲
突。ISSR-PCR是一种随即引物所引导的非特异性
扩增，需要引物与基因组DNA既可以高效地结合，
又能稳定的引导扩增，对扩增体系的要求更为精确，
反应体系的优化是该实验的实验重点部分。本实验
使用正交设计，仅仅重复了5次，就得到了能高效稳
定扩增的反应体系。
分子标记技术已经广泛的运用于现在的药
物基因组DNA的分析之中，主要有ISSR、RAPD、
RFLP、AFLP。本实验采用ISSR是因为其重复性稳
定性较RAPD更好，而且可以很好的将不同产地大
戟科狼毒的基因组DNA区分开来。虽然采用ISSR
需要更长的时间去筛选DNA引物和PCR的扩增
条件，但是其PCR扩增出来的产物能有更好的重
现性，这对于该实验来说是至关重要的，一般采用
RAPD经PCR扩增出来的产物会在12 h内在聚丙烯
酰胺凝胶电泳下产生条带，而采用ISSR则经过PCR
扩增出来的产物可以在48 h内产生条带，并且条带
可以稳定的存在，这样对于以上结果来说更有说服
力。ISSR引物的专一性要比RAPD强，在选择引物
上需要更加的严谨。◆
参考文献
[ 1 ] 章振东，徐德昌. 狼毒大戟的研究进展[ J ] .中国甜菜糖业，
2007 ( 4 ) ：18.
[ 2 ] 陈学文，吴文君.月腺大戟抑菌活性成分的研究[ J ] .江苏农
业科学，2010 ( 2 ) ：118-119.
[ 3 ] 王文祥，丁杏苞. 月腺大戟的化学成分研究[ J ] . 中草药，1999
( 30 ) ：1.
[ 4 ] 曹春林.中药制剂汇编[ M ] .北京：人民出版社，1983.
[ 5 ] 刘寿山.中药研究文献摘要[ M ] .北京：科学出版杜，1959.
[ 6 ] Sa rdana J，A Ba t ra . In v i t r o p l an t l e t f o rma t i on and
micropropagation ofJatropha curcas[ J ] .Advances in Plant
Sciences，1998，11 ( 2 ) ：167-169．
[ 7 ] Sujatha M，N Mukta. Morphogenesis and plant regeneration from
tissue cultures of Jatropha curcas[ J ] .Plant Cell Tissue and Organ
Culture，1996，44 ( 2 ) ：135-141．
[ 8 ] 陈冀胜，郑硕.中国有毒植物[ M ] .北京：科学出版社，1987 ：
258.
[ 9 ] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志[ M ] .北京：
科学出版社，1996 ：148．
[ 10 ] Adolf W，Opferkuch HJ，Hecher E. Irritant Phorbol Derivatives
from Four Jatropha Species[ J ] .Phytochemistry，1988，23 ( 1 ) ：
129-132．
[ 11 ] Khafagy SM，Mohamed YA，AbdeI-Salarn NA.Phytochemisty
Study of Jatropha curcas[ J ] .Planta medica，1977，31 ( 3 ) ：
274-277.
《辽宁中医药大学学报》2014年征订启事
《辽宁中医药大学学报》，月刊，2008年入选中国科技论文统计源期刊CSTPCD（中国科技核心期刊），为辽宁省一级期
刊。本刊坚持以中医中药为主体，以教学科研为先导，以基层实用为根本，及时报道新理论、新技术、新思路、新成果。重
点为中医药高中等院校教师、学生及医药人员服务。主要栏目：博导讲坛、论著聚焦、药理研究、方药纵横、基金项目纵览、
基础医学研究、博士视点、临床报道、中西医结合、针灸推拿、实验研究等。本刊为A4开本，224页，每册定价10.00元，全年
120.00元。国际标准刊号：ISSN 1673-842X，国内统一刊号：CN 21-1543/R，国内邮发代号：8-179，国外代号：M4817。电话：
024-31207232。E-mail ：zyxb@vip.163.com。