全 文 ：　　第 28卷　第 1期　 吉首大学学报(自然科学版) Vol.28　No.1　　
　　2007年 1月 Journal of Jishou University(Natural Science Edition) Jan.2007　　
文章编号:1007-2985(2007)01-0095-04
极度濒危植物猪血木 RAPD反应体系的优化
欧阳蒲月1 ,苏应娟2
(1.广东化工制药职业技术学院 , 广东 广州　510520;2.中山大学生命科学学院 , 广东 广州　510275)
摘　要:采用改进的 CTAB 法提取中国特有极度濒危植物猪血木(Euryodendron excelsum H.T.Chang)嫩叶总 DNA , 并对
其进行 RAPD分析.分别检测了模板 DNA、引物 、dNTP、Mg2+和 Taq DNA聚合酶用量对反应结果的影响.筛选并建立了适合
于猪血木 RAPD扩增的反应体系:总体积25μL, 其中10×PCR缓冲液(500 mmol LKCl , 100 mmol L Tris-HCl , 110%Triton X-
100 , 20 mmol L MgCl2)2.5μL , 引物(1.5μmol L)0.3μL, dNTPs(10 mmol L)0.5μL ,模板 2μL(25 ng), Taq酶 0.2 μL(0.5 U).
关键词:猪血木(Euryodendron excelsum H.T.Chang);RAPD;反应体系;优化
中图分类号:Q943;Q347　　　　　　 文献标识码:A
猪血木(Euryodendron excelsum H.T.Chang)为第三纪孑遗植物 ,在分类学上隶属于山茶科Theaceae猪血
木属 Euryodendron ,是我国特有的单属种.猪血木已被列为国家二级保护濒危植物[ 5] .然而 ,参照国际保护
协会(IUCN)的界定标准 ,它实际上属于极度濒危物种[ 6] .应用 RAPD(random amplified polymorphic DNA)技
术对其进行遗传多样性分析 ,了解其遗传变水平可以为制定相应保护策略 、实施有效管理 、直至为最终建
立可自我持续发展的种群提供必需的基础资料[ 8] .随机扩增多态性 DNA(RAPD)技术现已成为在种内水
平上检测物种分子多态性的常规方法.RAPD 标记使用的引物长度一般为 10个碱基 ,Tm 值较低 ,因而其
PCR反应易受实验条件的影响.对猪血木进行 RAPD分析 ,首先要建立一个稳定的反应体系 ,以确保 RAPD
结果的可靠性.为此 ,本文就猪血木 RAPD反应中的模板 DNA 、引物 、dNTP 、Mg2+和 Taq DNA聚合酶用量以
及退火温度对反应结果的影响进行了探讨 ,筛选并建立一个稳定的反应体系 ,为猪血木的遗传分析提供一
个标准化程序.
1　材料与方法
1.1 模板DNA的制备及其质量检测
将采自广东阳春八甲镇的猪血木个体的新鲜叶片 ,按改进的 CTAB法提取模板总 DNA.紫外光吸收以
确定 DNA 浓度和纯度.
1.2 RAPD反应体系优化
以猪血木总 DNA为模板 ,采用 S1290(ACCC CTGG CA)为引物 ,在GeneAmp PCR System 2 400 (Perkin
Elmer Corporation)上进行 RAPD 扩增反应.初始条件为:总体积 25 μL , 其中 10 ×PCR 缓冲液
(500 mmol L KCl ,100 mmol L Tris-HCl ,110%Triton X-100 , 20 mmol L MgCl2)2.5 μL ,引物(1.5 μmol L)
0.3 μL ,dNTPs(10mmol L)0.5μL ,模板 2μL(25 ng),Taq酶0.2μL(0.5 u).扩增条件:94 ℃200 s预变性;
94 ℃60 s ,36 ℃60 s;72 ℃120 s ,40个循环;72 ℃延伸10min ,之后 4 ℃保存.扩增产物用 100 bp DNA lad-
der作为相对分子量标准 ,用 1.0%琼脂糖凝胶(配制时已经加了溴化乙锭)于 3 V cm 电场中电泳.254 nm
收稿日期:2006-12-12
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30271094)
作者简介:欧阳蒲月(1978-),女 , 湖南邵阳人 ,硕士 , 主要从事药用植物资源和药用植物分子生物学研究;苏应娟 ,通
讯作者 , ls97@zsu.edu.cn.
紫外灯下观察 、照像记录.Taq酶和主要试剂购自上海生工公司.RAPD反应体系优化时 ,固定扩增程序 ,每
次改变 RAPD反应中的 1个参数 ,以确定该参数对 RAPD结果的影响.筛选的参数包括:(1)模板 DNA 质
量浓度;(2)TaqDNA聚合酶用量;(3)引物用量;(4)dNTP 浓度;(5)Mg2+浓度.上述所用 RAPD引物 、酶及
相关试剂均购自上海 Sangon公司.
2　结果与分析
2.1 模板DNA质量浓度对 RAPD的影响
模板 DNA质量浓度是影响 RAPD扩增产物产率与特异性的一个重要因子.模板质量浓度太低 ,则扩
增产物产量低或不稳定;模板质量浓度太高 ,则可能增加非特异产物的扩增.图 1泳道 1—5是不同模板
DNA质量浓度(50 ,25 ,10 , 5 ,1 ng μL)下 ,以引物 S1290进行 RAPD扩增的结果.从图 1可以看出 ,模板 DNA
用10 ng μL以下 ,带很弱 ,几乎看不到;而 10 ng μL 与 25 ng μL 相比 ,最大的 3 000 bp 带不能得到有效扩
增.模板DNA质量浓度高的(50 ng μL)则扩增结果产生弥散现象 ,背景有点模糊.说明对于猪血木的RAPD
扩增 ,较适的模板 DNA 质量浓度范围为 25 ng 左右 , 这与 Lowe 等[ 3] 的研究结果基本一致.Lowe 等认为
50 μL的反应体积 ,模板 DNA的量在 5 ～ 500 ng 之间常可以得到较好的结果 ,10 ～ 50 ng 是最适宜的.
图 1　模板 DNA 质量浓度对 RAPD扩增的影响 图 2　TaqDNA聚合酶用量对 RAPD扩增的影响
2.2 TaqDNA聚合酶用量对 RAPD的影响
在PCR反应中 ,TaqDNA聚合酶用量受到反应体积 、酶活 、酶的耐热性及反应程序等因素的影响.为了
确定猪血木的 RAPD反应中 TaqDNA聚合酶的适宜用量 ,试验选择 6个酶梯度 ,分别为 0.1 ,0.2 , 0.5 , 1 ,
1.5 ,2 u.结果表明:TaqDNA聚合酶的用量在 0.5 ～ 2.0 u反应范围内扩增结果差异不大(图 2泳道 1—6).
因此 0.5 u的酶量对 25μL 的反应体积已足够.
2.3 引物浓度对 RAPD的影响
分别以 0.036 ,0.030 ,0.024 ,0.018 ,0.012 ,0.006 μmol L 5个引物浓度梯度进行 RAPD 扩增 ,结果表明
引物浓度对 RAPD 扩增结果有较大的影响.从图 3(泳道 1—6)可以看出 , 当引物 S1209 浓度为
0.006 μmol L时 ,所得的扩增带较弱 ,基本上看不到.当引物浓度为 0.012 μmol L时 ,最小的那条带有点弱.
然而当浓度为 0.036 ,0.030 ,0.024 ,0.018 μmol L这个范围内 ,扩增结果较为一致.所以 0.018 μmol L 就已
经足够 ,从而 1.5μmol L的引物就只需要 0.3μL.
图 3　引物浓度对 RAPD扩增的影响 图 4　dNTP 浓度对 RAPD扩增的影响
2.4 dNTP 浓度对 RAPD的影响
dNTP是 TaqDNA聚合酶的底物 ,其浓度将直接影响 RAPD扩增产物的量 ,同时也可能影响 TaqDNA 聚
合酶的活性和扩增的特异性.用引物S1209 对 50 , 100 ,150 ,200 ,250 ,300μmol L 6个水平的 dNTP 浓度进行
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的试验(图 4中 1—6泳道),结果表明:当 dNTP浓度低于150 μmol L 时 ,扩增条带相对来说比较弱 ,且有 2
条大小为 800 bp以下的带不能有效扩增.在200 ～ 300μmol L范围内扩增带则基本一致 ,但带的强度有明显
的不同.考虑到带的强度和清晰度两方面 ,选择 250 μmol L dNTP 浓度进行猪血木的 RAPD扩增.
2.5 Mg2+浓度对 RAPD的影响
图 5　Mg2+浓度对 RAPD扩增的影响
Mg
2+是Taq DNA 聚合酶的激活剂 ,太低或太高都
将影响酶的活性 ,此外其浓度还影响引物与模扳的解
链与退火.图 5中 1—6泳道分别表示 1.5 , 2.0 , 2.5 ,
3.0 ,3.5 ,4.0 mmol L Mg2+显示了不同 Mg2+浓度对
RAPD扩增结果的影响.结果表明:以 S1209 为引物 ,
Mg
2+浓度为 1.5 ～ 2.5 mmo L时 ,能扩增出清晰的 DNA
条带 ,随着 Mg2+浓度的进一步提高 ,扩增条带逐渐减
弱 ,且变得难以识别.因此 2.0 mmol L的Mg2+浓度是进
行猪血木 RAPD扩增的最适浓度.
3　结语
综合考虑上述各因素对 RAPD扩增的影响 ,最后选定猪血木的 RAPD扩增反应体系为:初始条件为:
总体积25 μL ,其中10×PCR缓冲液(500 mmol L KCl ,100 mmol L Tris-HCl , 110%Triton X-100 ,20 mmol L
MgCl2)2.5μL ,引物(1.5 μmol L )0.3 μL ,dNTPs(10 mmol L)0.5 μL ,模板 2 μL (25 ng), Taq 酶 0.2 μL
(0.5μ).扩增条件:94 ℃200 s预变性;94 ℃60 s ,36 ℃60 s;72 ℃120 s ,40个循环;72 ℃延伸 10 min ,之
后4 ℃保存.
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Optimal Choice for Reaction System in RAPD Analysis of
Euryodendron Excelsum H.T.Chang
OUYANG Pu-yue1 ,SU Ying-juan2
(1.Guangdong Vocational &Technical College of Pharmaceutical Engineering , Guangzhou 510520 , China;
2.School of Life Sciences , Sun Yat-sen University , Guangzhou 510275 , China)
Abstract:The DNA templates of Euryodendron excelsum H.T .Chang extracted from young leaf were amplified by
RAPD.Effects of the content of DNA temlates , primers ,dNTP ,Mg2+ and Taq DNA polymerase on experimental results
were tested and the optimal reaction system of RAPD for Euryodendron excelsum H.T.Chang was determined as fol-
lows:25 ng DNA template ,2.0mmol L Mg2+ ,0.018μmol L primer ,250μmol L dNTP ,0.5 u Taq DNA polymerase in
total 25μL reaction volume.
Key words:Euryodendron excelsum H.T.Chang;RAPD;reaction system;optimal choice (责任编辑　易必武)
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