全 文 ：基于氧化应激探讨溪黄草总二萜保护肝脏线粒体、抗氧化作用研究*
何国林1，林 曦1，吴仕娇1，王碧君1，熊天琴1＊＊，祝晨蔯2
(1广州中医药大学中药学院，广州 510006;2广州中医药大学临床药理研究所，广州 510405)
摘 要 目的:观察溪黄草总二萜的保肝作用。方法:制备乙醇损伤 L-02 细胞模型，考察总二萜对受损细胞 ALT、AST泄漏量
的影响。复制两种急性肝损伤动物模型，分离血清检测转氨酶活性，取肝组织进行病理学观察。提取肝脏线粒体检测 MMP、MPTP
开放程度、Mn-SOD活力、8-OHdG水平、呼吸链复合物Ⅰ、复合物Ⅲ活性。肝匀浆测定 MDA 水平和 GSH、GSH-Px 活力。ＲT-PCＲ 检
测大鼠肝组织中 Nrf2、Bach1、HO-1 mＲNA表达水平;Western Blot检测大鼠肝组织 HO-1 总蛋白的表达水平。结果:细胞实验显示，
溪黄草总二萜 5． 00、10． 00、20． 00 μg /ml给药组有降低受损 L-02 细胞转氨酶泄漏的趋势。动物实验显示，溪黄草总二萜 25． 0、50．
0、100． 0 mg /kg治疗组动物血清转氨酶水平均明显下降，肝细胞水肿减轻，病理分级下降。溪黄草总二萜 25． 0、100． 0 mg /kg治疗组
动物肝脏线粒体 Mn-SOD、Complex Ⅰ、Complex Ⅲ活性上升;50． 0 mg /kg 治疗组 MPTP开放被抑制、8-OHdG水平下降。溪黄草总二
萜 25． 0、50． 0、100． 0 mg /kg治疗组动物肝匀浆中 MDA水平下降，GSH、GSH-Px活力升高。溪黄草总二萜 50． 0、100． 0 mg /kg治疗组
大鼠肝组织中 HO-1 mＲNA、总蛋白表达水平上升。结论:溪黄草总二萜在细体内外实验中显示均具有明确的保肝作用，其保肝作用
与保护肝脏线粒体、调控肝脏内源性抗氧化酶系统有关。
关键词 溪黄草总二萜;急性肝损伤;氧化应激;肝脏线粒体
氧化应激是肝损伤的重要发病机制，氧化应激引起的肝损
伤可造成多方面的病理性改变，如肝脏线粒体的损伤、内源性
抗氧化酶系统失衡、炎性反应、细胞凋亡等。溪黄草为唇形科香
茶菜属溪黄草(Isodon serra (Maxim．)Hara)的干燥全草［1］，溪
黄草含有二萜类、黄酮类等多种成分，对于多种肝脏疾病有良
好的保护作用［2］。本研究拟从保护线粒体、调控内源性抗氧化
酶系统两个角度，观察、评价溪黄草总二萜的保肝作用，指出其
可能的作用靶点，为溪黄草的合理应用提供客观参考。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 溪黄草总二萜(广州中医药大学临床药理研
究所祝晨蔯研究员提供，其植物基源为唇形科香茶菜属溪黄草
Isodon serra (Maxim．)Hara的干燥全草，主要成分及含量:黄花
香茶菜甲素(sculponeatin A)29． 64 mg /g，延命素(enmein)11．
57 mg /g，诺多星(nodosin)191． 42 mg /g，毛栲利素(lasiokaurin)
5． 48 mg /g，其成分分析已明确并已经发表［3］。水飞蓟素(陕西
西安小草植物科技有限责任公司，批号:XC20150812)，以水飞
蓟宾计算，含量为 53． 7%。
1． 2 动物 SD 大鼠，6 周龄，体质量 160 ～ 180 g，雄性，SPF
级，购于广州中医药大学实验动物中心，实验动物生产许可证
编号:SCXK(粤)2013-0034，实验动物使用许可证编号:SYXK
(粤)2013-0085，实 验 动 物 质 量 合 格 证 编 号:No．
44005800002706，广东省动物实验证明编号:No． 00119199。KM
小鼠，8 周龄，雄性，SPF级，体质量 18 ～ 22 g，购于广州中医药大
学实验动物中心，实验动物生产许可证编号:SCXK(粤)2013-
0034，实验动物使用许可证编号:SYXK(粤)2013-0085，实验动
物质量合格证编号:No． 44005900002198。
1． 3 细胞 人胚肝细胞 L-02，购自上海基尔顿生物科技有限
公司。
1． 4 试剂 DMEM高糖培养基、PBS(HyClone);胎牛血清(Fe-
tal Bovine Serum，FBS)(Gibco，货号:10099-141);刀豆蛋白 A
(Concanavalin A，Con A)(Sigma，批号:C2010);组织线粒体分
离试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(江苏碧云天生物
技术，批号:20151105);纯化线粒体 MPTP 比色法检测试剂盒、
线粒体呼吸链复合物Ⅰ、复合物Ⅲ活性比色法定量检测试剂盒
(上海杰美基因医药科技有限公司，批号:GZYD0007);SOD 分
型测试盒(南京建成生物工程研究所，批号:20151225);大鼠、
小鼠 8-OHdG ELISA 检测试剂盒(美国 Ｒ＆D 公司，批号:
20151001A);SYBＲ?Premix Ex TaqTM(Tli ＲNaseH Plus)(宝生物
工程(大连)有限公司);Ｒeverse Transcriptase M-MLV (ＲNase
H-) (宝生物工程(大连)有限公司);兔抗 HO-1 多克隆抗体(美
国 Abcam公司，ab82219);兔抗 GAPDH 多克隆抗体(美国 Bio-
world Technology公司，AP0063)。
1． 5 仪器 SANYO MCO-20AIC CO2培养箱(日本三洋电机株
式会社);1510 型 Multiskan GO(Thermo Fisher scientific) ;Infinite
M1000 PＲO多功能酶标仪(瑞士帝肯);7500 型实时荧光定量
PCＲ系统(美国 ABI公司);6200 型发光成像工作站(上海天能
科技有限公司)。
1． 6 方法 L-02细胞复苏后，接种于完全培养基中，置于 37℃，
5% CO2 培养箱内培养。待细胞生长良好，呈贴壁状后，调整细
胞浓度为 1 ×105 个 /ml，取适量细胞悬液接种于培养瓶。
1． 6． 1 MTT法筛选乙醇损伤 L-02 细胞浓度 取对数期生长细
胞，按 1 × 105 /孔的浓度接种于 96 孔板。培养 24 h后弃去培养
基。除空白组外，各孔依次加入 100μl 乙醇工作液和空白培养
基，使酒精最终浓度为 1%、1． 5%、2%、3%、5%、8%、10%、
15%，培养 4 h后取出。每孔加入 20μl MTT孵育 4 h后，490 nm
处测定各孔 OD 值，根据公式［细胞抑制率(%)= (对照组
OD490 －实验组 OD490)/对照组 OD490 × 100%］计算细胞抑制
率。
1． 6． 2 MTT法测定溪黄草总二萜对正常 L-02 细胞的细胞毒性
实验设空白对照组、0． 2% DMSO 溶剂对照组、溪黄草总二萜
121中药药理与临床 2016;32(6)
* 基金项目:广东省中医药局科研课题(20141114);国家自然科学基金项目(81173535) ＊＊通讯作者
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2016.06.033
各工作液组。取对数期生长细胞，按 1 × 105 个 /孔的密度接种。
培养 24 h后弃去培养基，各给药组加入分别加入 100 μl空白培
养基和溪黄草总二萜工作液，终浓度分别为 7． 81、15． 63、31．
25、62． 50、125． 00、250． 00、500． 00、1000． 00 μg /ml。共培养 12 h
后，每孔加入 20 μl MTT，继续孵育 4 h。后续流程同上。
1． 6． 3 培养上清 ALT、AST水平测定 实验分为空白对照组、0．
2%DMSO溶剂对照组、乙醇损伤模型组、溪黄草总二萜高、中、低
剂量组。按 1 ×106 个 /孔的浓度接种于 24 孔板。培养 24 h 后，
除空白对照组外，各孔依次加入 1000 μl 空白培养基和乙醇工作
液(乙醇终浓度为 3%)共培养。4 h后弃去培养基，总二萜各剂
量组加入 1000 μl空白培养基和总二萜工作液，终浓度分别为 5．
00、10． 00、20． 00 μg /ml。共培养 12 h 后，收集培养上清，测定其
ALT、AST水平，检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。
1． 6． 4 动物分组与给药 72 只 SD大鼠、72 只 KM小鼠适应性
饲养 3 天后，按体重随机分为正常对照组，模型对照组，阳性对
照组，溪黄草总二萜 25． 0、50． 0、100． 0 mg /kg组，共 6 组。各组
大鼠上午灌胃 55%(v /v)乙醇造模，下午正常对照和模型对照
组灌胃蒸馏水、阳性对照组灌胃 46． 7 mg /kg 水飞蓟素、溪黄草
总二萜组灌胃相应剂量的药物，共 10 d。末次给药后，禁食不禁
水 16 h，麻醉后进行取材。各组小鼠预防性给药 7 d，末次给药
后 1 h，除正常对照组外，各组小鼠按 25 mg /kg 剂量，尾静脉注
射 Con A造模，4 h后取材。所有动物取材完成后，所得血清于-
80℃保存;一部分肝脏暂存于冰浴中，用于分离线粒体;一部分
保存于 4%多聚甲醛，用于病理学检测;其余肝脏裁切并分装
后，于-80℃保存。
1． 6． 5 肝脏线粒体的制备 取暂存于冰浴中的肝组织，冷 PBS
洗涤后，加入 10 倍组织重量的线粒体分离试剂，冰浴中匀浆 10
次。匀浆液 4℃、3000 rpm 离心 5 min，取上清液。上清液 4℃、
12000 rpm，离心 10 min，所得沉淀即为线粒体。沉淀以适量线
粒体储存液重悬。重悬液于-80℃冰箱中保存备用。
取大鼠肝脏线粒体检测线粒体膜电位，MPTP开放程度、Mn-
SOD活力、ComplexⅠ、Complex Ⅲ活性;ELISA 法检测肝脏线粒体
8-OHdG水平;取小鼠肝脏线粒体检测线粒体膜电位、Mn-SOD活
力，ELISA法检测肝脏线粒体 8-OHdG 水平;检测肝匀浆 MDA、
GSH、GSH-Px。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。
1． 6． 6 ＲT-PCＲ法测定肝组织中 Nrf2、Bach1、HO-1 mＲNA表达
水平 目的基因引物设计如表 1 所示，由广州天晴生物科技有
限公司合成。反应条件如下:预变性，95℃，30 s(1 个循环);
PCＲ 反应，95℃，5 s;60℃，34 s(45 个循环)，每个样本设 3 个
复孔。反应结束后，计算平均 Ct 值，每一次反应均设定阴性对
照。采用 2-(ΔΔCt)计算各目的基因相对反应起始拷贝数，以
GAPDH 基因为内参。
表 1 各基因名称与引物序列
基因名称 引物序列(5＇--3＇)
引物长度
(bp)
扩增产物
长度(bp)
Nrf2 Forward GGCCCTCAATAGTGCTCAGA 20 144
Ｒeverse GTTCCCGCAACCTTTTAGGC
Bach1 Forward GGTGCTGTGAGGGAAGAGAAA 21 100
Ｒeverse CAAGAGGCTACCTGTCTCCC
HO-1 Forward AGGGGCCTGAACTTGGAAAC 20 71
Ｒeverse GCCTCTACCGACCACAGTTC
GAPDH Forward AGACAGCCGCATCTTCTTGT 20 376
Ｒeverse TGATGGCAACAATGTCCACT
1． 6． 7 Western blot 法测定肝组织中 HO-1 总蛋白表达水平
取冻存肝组织，提取总蛋白。BCA法进行蛋白定量后，取 40 μg
蛋白进行凝胶电泳。5%聚丙烯酰胺凝胶(浓缩胶)，在 80V 条
件下电泳 0． 5 h，8%聚丙烯酰胺凝胶(分离胶)，在 105V条件下
电泳 1 h;300 mA 条件下 PVDF 膜转膜 1 h，含 5%脱脂奶粉的
TBST 缓冲液室温封闭 2 h，HO-1 一抗(1∶ 1000)室温孵育 2 h，
清洗后辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶ 2000)室温孵育 1 h，
清洗后 ECL显色，扫描胶片，利用 Quantity One软件分析目标条
带的平均灰度值。
2 结果
2． 1 乙醇造模浓度筛选 实验结果表明，终浓度为 2 ～ 15%
(v /v)的乙醇作用于 L-02 肝细胞，均可抑制细胞生长，细胞存活
率明显下降，详见表 2。
表 2 不同浓度乙醇对正常 L-02 细胞存活能力的影响(珋x ± s，n =
6)
组别 浓度(%) 吸光度值 细胞存活率(%)
空白对照 0． 855 ± 0． 029 100． 0 ± 3． 4
乙醇 1 0． 963 ± 0． 050＊＊ 112． 6 ± 5． 9＊＊
1． 5 0． 837 ± 0． 099 97． 9 ± 11． 6
2 0． 588 ± 0． 032＊＊ 67． 9 ± 3． 8＊＊
3 0． 455 ± 0． 043＊＊ 53． 4 ± 5． 0＊＊
5 0． 122 ± 0． 031＊＊ 14． 2 ± 3． 6＊＊
8 0． 099 ± 0． 005＊＊ 11． 6 ± 0． 5＊＊
10 0． 107 ± 0． 003＊＊ 12． 6 ± 0． 4＊＊
15 0． 160 ± 0． 010＊＊ 18． 7 ± 1． 2＊＊
与空白对照组比较 * P ＜0． 05，＊＊P ＜0． 01(下同)
2． 2 溪黄草总二萜对正常 L-02 细胞的影响 实验结果显示，
溪黄草总二萜对 L-02 细胞增殖和生长无明显影响，经过推算，
溪黄草总二萜对正常 L-02 细胞的 IC50值为:138． 10 μg /ml，详见
表 3。
表 3 不同浓度溪黄草总二萜对正常 L-02 细胞存活能力的影响(珋x
± s，n = 6)
组别 浓度(μg /ml) 吸光度值 细胞存活率(%)
空白对照 0． 508 ± 0． 023 100． 0 ± 4． 6
溶剂对照 0． 478 ± 0． 025 94． 2 ± 4． 8
溪黄草总二萜 7． 81 0． 487 ± 0． 020 96． 0 ± 3． 5
15． 63 0． 504 ± 0． 019 99． 3 ± 2． 4
31． 25 0． 510 ± 0． 034 100． 4 ± 3． 3
62． 5 0． 539 ± 0． 051 106． 0 ± 6． 5
125 0． 263 ± 0． 070＊＊ 51． 4 ± 12． 0＊＊
250 0． 082 ± 0． 008＊＊ 16． 1 ± 1． 1＊＊
500 0． 087 ± 0． 003＊＊ 17． 2 ± 0． 5＊＊
1000 0． 104 ± 0． 007＊＊ 20． 5 ± 0． 7＊＊
2． 3 溪黄草总二萜对乙醇损伤 L-02 细胞培养上清 ALT、AST
泄漏量的影响 实验结果表明，溪黄草总二萜不能降低乙醇损
伤 L-02 所引起的 ALT、AST泄漏，详见表 4。
表 4 溪黄草总二萜对氧化损伤 L-02 细胞培养上清 ALT、AST水平
的影响(珋x ± s，n = 6)
组别 浓度(μg /ml) ALT(U /L) AST(U /L)
空白对照 2． 6 ± 1． 1* 1． 7 ± 0． 5*
溶剂对照 3． 2 ± 1． 6 4． 6 ± 1． 1
模型对照 4． 5 ± 1． 6 5． 6 ± 3． 6
溪黄草总二萜 20． 00 3． 3 ± 3． 0 3． 3 ± 2． 1
10． 00 3． 4 ± 3． 0 2． 9 ± 1． 7
5． 00 2． 4 ± 2． 3 4． 1 ± 1． 0
与模型对照组比较 * P ＜0． 05，＊＊P ＜0． 01(下同)
2． 4 溪黄草总二萜对酒精性肝损伤大鼠的影响 实验结果表
221 中药药理与临床 2016;32(6)
明，溪黄草总二萜可保护大鼠肝功能，保护大鼠肝脏线粒体，调
控大鼠肝脏内源性抗氧化酶系统，实验结果见表 5 至表 7、图 1
至图 4。
表 5 溪黄草总二萜对酒精性肝损伤大鼠各项指标的影响(珋x ± s)
组别
剂量
(mg/kg)
n = 8
ALT
(U/L)
AST
(U/L)
JC-1荧光
强度比值
Mn-SOD
(U/mg)
8-OHdG
(μg /mg)
n = 7
Complex Ⅰ
(× 10-3 U/mg)
Complex Ⅲ
(× 10-3 U/mg)
MDA
(nmol /mg)
GSH
(nmol /mg)
GSH-Px
(U/mg)
n = 6
MPTP
ΔA540(× 10-1)
正常对照 3． 3 ± 2． 6* 17 ± 5＊＊ 1． 359 ± 0． 029* 1． 79 ± 0． 36＊＊ 1． 68 ± 0． 24＊＊ 8． 4 ± 3． 5＊＊ 4． 9 ± 2． 7＊＊ 1． 94 ± 0． 18＊＊ 19 ± 4* 278 ± 51＊＊ 0． 08 ± 0． 05*
模型对照 11． 7 ± 7． 5 40 ± 10 1． 294 ± 0． 062 0． 70 ± 0． 48 2． 79 ± 0． 61 3． 0 ± 1． 9 1． 2 ± 0． 8 4． 55 ± 1． 64 14 ± 4 190 ± 19 0． 28 ± 0． 19
水飞蓟素 46． 7 4． 0 ± 3． 8* 26 ± 8＊＊ 1． 362 ± 0． 029* 1． 80 ± 0． 71＊＊ 1． 71 ± 0． 29＊＊ 10． 1 ± 7． 4* 6． 0 ± 2． 2＊＊ 2． 59 ± 0． 76* 44 ± 13＊＊ 373 ± 81＊＊ 0． 09 ± 0． 05*
溪黄草总二萜 100 7． 7 ± 3． 8* 37 ± 14 1． 261 ± 0． 045 1． 03 ± 0． 44 1． 43 ± 0． 33＊＊ 8． 9 ± 3． 0＊＊ 6． 4 ± 4． 3* 2． 38 ± 0． 61* 22 ± 4＊＊ 223 ± 15＊＊ 0． 12 ± 0． 04
50 5． 0 ± 1． 2* 28 ± 7* 1． 267 ± 0． 028 0． 83 ± 0． 24 1． 56 ± 0． 39＊＊ 9． 1 ± 2． 7＊＊ 8． 8 ± 1． 7＊＊ 2． 68 ± 0． 74* 18 ± 5 285 ± 102* 0． 10 ± 0． 04*
25 4． 4 ± 2． 6* 21 ± 8＊＊ 1． 373 ± 0． 039＊＊ 1． 15 ± 0． 28* 1． 79 ± 0． 41＊＊ 8． 6 ± 2． 3＊＊ 3． 9 ± 2． 2* 2． 77 ± 0． 69* 18 ± 6 310 ± 61＊＊ 0． 12 ± 0． 07
表 6 各组大鼠肝组织病理分级结果(n = 5)
组别
剂量
(mg /kg)
分级
0 + + + + + +
评分
正常对照 5 0 0 0 6＊＊
模型对照 0 0 1 4 27
水飞蓟素 46． 7 3 1 1 0 11＊＊
溪黄草总二萜 100 1 3 1 0 15*
50 0 4 1 0 17
25 1 2 1 1 18
表 7 溪黄草总二萜对大鼠肝脏 Nrf2 、Bach1、HO-1 mＲNA，HO-1 总
蛋白表达水平的影响(珋x ± s，n = 3)
组别
剂量
(mg/kg)
Nrf2 mＲNA Bach1 mＲNA HO-1 mＲNA
HO-1总蛋白
相对灰度
正常对照 0． 84 ± 0． 17* 0． 99 ± 0． 27＊＊ 0． 9 ± 0． 3* 1． 52 ± 0． 03*
模型对照 1． 81 ± 0． 44 2． 66 ± 0． 23 2． 1 ± 0． 4 1． 60 ± 0． 03
水飞蓟素 46． 7 4． 98 ± 1． 66* 1． 97 ± 0． 50 4． 2 ± 0． 7* 2． 02 ± 0． 08＊＊
溪黄草总二萜 100 3． 39 ± 1． 33 5． 88 ± 3． 69 4． 8 ± 0． 6＊＊ 1． 90 ± 0． 11＊＊
50 9． 55 ± 6． 56 4． 70 ± 1． 96 4． 5 ± 1． 5* 1． 93 ± 0． 09＊＊
25 3． 50 ± 2． 29 1． 97 ± 0． 87 1． 3 ± 0． 3 1． 91 ± 0． 42
图 1 各组大鼠肝脏病理图片(HE，200 ×)
A:正常对照，B:模型对照，C:水飞蓟素 46． 7 mg /kg，D:总二萜 100． 0 mg /kg，E:总二萜 50． 0 mg /kg，F:总二萜 25． 0 mg /kg
图 2 酒精性肝损伤大鼠肝脏 Nrf2、Bach1、HO-1 基因的熔解曲线图
A:Nrf2;B:Bach1;C:HO-1
图 3 酒精性肝损伤大鼠肝脏 Nrf2、Bach1、HO-1 基因的扩增曲线图
A:Nrf2;B:Bach1;C:HO-1
321中药药理与临床 2016;32(6)
图 4 酒精性肝损伤大鼠肝组织 HO-1 总蛋白条带
1:正常对照;2:模型对照;3:水飞蓟素 46． 7 mg /kg;4:总二萜 25． 0 mg /
kg;5:总二萜 50． 0 mg /kg;6:总二萜 100． 0 mg /kg
2． 5 溪黄草总二萜对免疫性肝损伤小鼠的影响 实验结果表
明，溪黄草总二萜可保护小鼠肝功能，保护小鼠肝脏线粒体，调
控小鼠肝脏内源性抗氧化酶系统，结果见表 9、表 10，图 5。
表 9 溪黄草总二萜对免疫性肝损伤小鼠各项指标的影响(珋x ± s)
组别
剂量
(mg /kg)
n = 8
ALT(U/L) AST(U/L) JC-1荧光强度比值 Mn-SOD(U/mg) 8-OHdG (μg /mg)
n = 7
MDA(nmol /mg) GSH(nmol /mg) GSH-Px(U/mg)
正常对照 15． 3 ± 2． 1＊＊ 9 ± 3＊＊ 0． 724 ± 0． 015* 1． 36 ± 0． 31＊＊ 2． 8 ± 0． 6* 2． 2 ± 0． 7＊＊ 21． 8 ± 7． 3＊＊ 306 ± 38＊＊
模型对照 61． 6 ± 13． 7 36 ± 9 0． 691 ± 0． 028 0． 50 ± 0． 25 4． 1 ± 1． 2 5． 3 ± 1． 4 9． 7 ± 1． 9 221 ± 30
水飞蓟素 46． 7 17． 3 ± 5． 1＊＊ 13 ± 6＊＊ 0． 744 ± 0． 043* 1． 10 ± 0． 35＊＊ 3． 1 ± 0． 6* 2． 7 ± 1． 3＊＊ 29． 1 ± 18． 6* 329 ± 40＊＊
溪黄草总二萜 100． 0 25． 8 ± 16． 1＊＊ 19 ± 6＊＊ 0． 702 ± 0． 024 0． 93 ± 0． 44* 3． 1 ± 0． 8 2． 6 ± 0． 6＊＊ 17． 5 ± 7． 9* 255 ± 31*
50． 0 16． 8 ± 5． 3＊＊ 22 ± 9* 0． 699 ± 0． 039 0． 72 ± 0． 37 2． 9 ± 0． 3* 2． 7 ± 0． 9＊＊ 19． 1 ± 5． 4＊＊ 251 ± 60
25． 0 18． 5 ± 6． 3＊＊ 27 ± 11 0． 672 ± 0． 039 0． 76 ± 0． 26 3． 6 ± 0． 9 2． 7 ± 1． 1＊＊ 13． 3 ± 3． 9 263 ± 29*
图 5 各组小鼠肝脏病理图片(HE，200 ×)
A:正常对照;B:模型对照;C:水飞蓟素 46． 7 mg /kg;D:总二萜 100． 0 mg /kg;E:总二萜 50． 0 mg /kg;F:总二萜 25． 0 mg /kg
表 10 各组小鼠肝组织病理分级结果(n = 5)
组别
剂量
(mg /kg)
分级
0 + + + + + +
平均秩
正常对照 5 0 0 0 4＊＊
模型对照 0 0 0 5 27
水飞蓟素 46． 7 1 1 3 0 15*
溪黄草总二萜 100 0 4 1 0 13＊＊
50 0 1 3 1 19
25 0 3 1 1 16*
3 讨论
溪黄草总二萜可对抗乙醇损伤 L-02 细胞引起的 ALT、AST
泄漏，降低肝损伤动物模型血清中转氨酶活性、减轻肝细胞水
肿，具有一定的保肝作用。其保肝作用与保护肝脏线粒体、调控
肝脏内源性抗氧化系统有关。对肝脏线粒体的保护作用可表
现为保护线粒体膜完整性、提高线粒体抗氧化能力、减轻线粒
体 DNA氧化损伤、恢复线粒体氧化磷酸化系统，对肝脏内源性
抗氧化系统的调控作用可表现为减轻脂质过氧化反应、提高抗
氧化酶活力、HO-1 的 mＲNA和总蛋白表达水平上升。
当体内发生氧化应激时，作为体内 ＲOS 的主要来源，线粒
体也最容易遭受攻击［4］，从结构和功能层面表现出多方面的损
伤。线粒体膜通透性转换孔(MPTP)可在氧化应激状态下受
ＲOS影响被诱导开放［5］，引发线粒体内膜通透性增加，线粒体
膜电位(MMP)下降。随着 MPTP的开放程度的增加，可引起线
粒体 膜 通 透 性 转 换 (Mitochondrial Permeability Transition，
MPT)，更多分子量小于 1． 5 kDa的小分子溶质通过孔道进入线
粒体，引起线粒体的能量代谢障碍［6，7］，加剧 MMP 的下降。最
终造成线粒体功能受损，甚至破裂。因此，控制 MPTP 的开放、
保持线粒体膜电位，对于维持线粒体正常的形态以及功能具有
重要意义。本研究结果表明，溪黄草总二萜抑制肝损伤动物肝
脏线粒体 MPTP的开放，恢复 MMP，可保护线粒体膜的完整性。
8-羟基脱氧鸟苷(8-Hydroxy-2＇-deoxyguanosine，8-OHdG)是 mtD-
NA的氧化损伤产物之一，可导致鸟嘌呤优先与腺嘌呤发生错
配，导致碱基配对出现颠换，mtDNA 发生突变，mtDNA 功能受
损。其生成途径单一，且容易被检测［8］，因此可作为一种有效
的生物标志物，反映氧化应激对 mtDNA的损伤程度。锰超氧化
物歧化酶(Manganese Superoxide dismutase，Mn-SOD)主要存在
于线粒体的基质中。作为唯一的线粒体内的超氧阴离子清除
剂，大量研究证实，Mn-SOD在防止氧化应激上发挥着关键的作
用，其水平会影响细胞对抗 ＲOS 引起的氧化损伤的能力，对于
421 中药药理与临床 2016;32(6)
机体具有重要的生物学意义［9］。本研究结果表明，溪黄草总二
萜降低肝损伤动物肝脏线粒体内 8-OHdG 水平，提高 Mn-SOD
活力，有助于恢复线粒体抗氧化能力、减轻 mtDNA 氧化损伤。
呼吸链复合物Ⅰ(NADH-辅酶 Q 还原酶)和复合物Ⅲ(辅酶 Q-
细胞色素 C还原酶)［10］是线粒体氧化磷酸化系统(OXPHOS)的
重要组成部分。在发生氧化应激时，ＲOS 可直接攻击呼吸链复
合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分子中的铁-硫(Fe-S)中心，使催化三羧酸循环的
顺乌头酸酶失活，导致线粒体产能停止，引发线粒体能量代谢
障碍［11］。此外，氧化损伤后未经修复的 mtDNA 可以导致复合
物Ⅰ和(或)复合物Ⅲ的功能缺陷，导致电子生成减少，超氧阴
离子生成增多［12，13］，ＲOS 的增加又会反过来进一步损伤 mtD-
NA，导致对电子传递具有重要作用的关键性蛋白合成减少，形
成恶性循环。实验结果表明，溪黄草总二萜可明显提高肝损伤
动物肝脏线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ活性，提示总二萜可能通
过修复 OXPHOS，改善线粒体的能量代谢障碍，发挥保护线粒体
的作用。
Nrf2 /Bach1-AＲE-抗氧化酶通路是机体内重要的内源性
抗氧化酶通路，通过核因子 E2 相关因子 2(nuclear factor ery-
throid-related factor 2，Nrf2)和 Kelch样 ECH相关蛋白 1(Kelch-
like ECH-associated protein 1，Keap1)在核内外的动态平
衡［14，15，16］，直接或间接地调控包括 HO-1、GSH、SOD、CAT 在内
的多种抗氧化基团的表达，发挥抗氧化作用［17］。本研究结果表
明，氧化应激发生后，Nrf2、Bach1、HO-1 的 mＲNA 表达明显上
升，HO-1 总蛋白表达水平有所上升。提示在氧化应激损伤的早
期，Nrf2 /Bach1-AＲE-抗氧化酶通路可被激活，参与机体的抗
氧化过程，这一结果与部分文献报道基本吻合［18，19］。经过治疗
后，大鼠肝组织 Nrf2、Bach1、HO-1 mＲNA 表达水平、HO-1 总蛋
白表达水平有了不同程度的上调，提示溪黄草总二萜的保肝作
用可能与影响 Nrf2 /Bach1-AＲE-抗氧化酶通路有关。然而，
HO-1 的表达可受到其他通路的调控［20，21］，因此，溪黄草总二萜
对Nrf2 /Bach1-AＲE-抗氧化酶通路是否具有调控作用仍有待
商榷。
综上所述，溪黄草总二萜在细胞实验和动物实验中显示均
具有明确的保肝作用，动物实验显示其保肝作用与保护肝脏线
粒体、调控内源性抗氧化酶系统有关。以上结果丰富了溪黄草
保肝研究的成果。为进一步提升溪黄草的药用开发价值，为治
疗肝损伤的新型药物的开发提供了参考。
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521中药药理与临床 2016;32(6)
The study of total diterpenoids extracted from Isodon serra (Maxim．)Hara on hepatic mitochondria
protection and antioxidation based on oxidative stress
He Guolin1，Lin Xi1，Wu Shijiao1，Wang Bijun1，Xiong Tianqin1＊＊，Zhu Chenchen2
(1 School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510006;
2 Institute of Clinical Pharmacology，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405)
Objective:to investigate the hepatoprotective effect of total diterpenoids extracted from Isodon serra (Maxim．)Hara． Methods:We
prepared the ethanol-damaged L-02 cells and measured the ALT and AST levels in culture media． Two types of acute liver injuries were re-es-
tablished in animals． Transaminases activities were measured in serum，HE stain and pathological observation were performed in liver tissue．
The liver mitochondria were separated from fresh liver tissue and multiple indexes were examined． MDA，GSH，GSH-Px were detected in liv-
er homogenate． Along with the expression of HO-1 total protein，the mＲNA expression of Nrf2，Bach1 and HO-1were checked in rats＇ liver．
Ｒesults:There was a trend on cutting down the leakage of ALT and AST from ethanol-damaged L-02 cells treated with 5． 00，10． 00，20． 00
μg /ml total diterpenoids． Compared with model group，ALT and AST levels in total diterpenoids 25． 0，50． 0，100． 0 mg /kg group were re-
markably lowered，followed by the relief of liver cells edema and improvement of pathology classification． The results of examination on hepat-
ic mitochondria showed that Mn-SOD，complex Ⅰ，complex Ⅲ activities significantly increased in total diterpenoids 25． 0，100． 0 mg /kg
group;the opening of MPTP was inhibited and 8-OHdG levels dropped in total diterpenoids 50． 0 mg /kg group． With the recovery of GSH and
GSH-Px activities，the MDA levels were significantly lower in total diterpenoids 25． 0，50． 0，100． 0 mg /kg group． Both mＲNA and total pro-
tein expressions were considerably up-regulated in total diterpenoids 50． 0，100． 0 mg /kg rats． Conclusion:Total diterpenoids extracts from
Isodon serra (Maxim．)Hara had a considerable hepatoprotective effect both in vivo and in vitro． The animal experiment indicates that its
effect is related to hepatic mitochondria protection and endogenous antioxidative system adjustment．
Key words Isodon serra (Maxim．)Hara;acute hepatic injury;oxidative stress;hepatic mitochondria
621 中药药理与临床 2016;32(6)