全 文 ：提高草木犀遗传转化植株再生率技术的研究
刘玉冬 , 刘艳军 , 杨静慧　(天津农学院园艺系 ,天津 300384)
摘要　[目的]确定草木犀遗传转化植株的适宜的除草剂选择压力。[方法]分别以草木犀试管苗的子叶、下胚轴和破坏生长点的茎尖为
外植体 ,在含有 0、1、3、5、10 mg/ L除草剂草丁膦的分化培养基MS+BA 3 mg/L +IAA 0.2 mg/ L中对其进行分化培养 ,筛选适宜的除草剂
选择压力 ,在此选择压力下 ,对外植体进行遗传转化 ,并对转化芽进行分子水平检测。[ 结果] 当除草剂浓度为 3 mg/L时 ,所有外植体均
无再生芽;转化培养后 ,子叶、下胚轴和破环生长点的茎尖的再生率分别为 0.48%、4.29%和 10.8%;分子水平检测结果显示 ,外源基因已
成功转入草木犀转化芽中。[结论]除草剂对草木犀外植体的适宜选择压力为 3 mg/L ,破坏生长点的草木犀茎尖对外源基因的转化效率
较高。
关键词　草木犀;除草剂;再生率
中图分类号　S603.+6　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)15-06873-03
Study on Technology of Increasing Regeneration Rate of Genetic Transformation Plant of Melilotus suaveclens Leseb.
LIU Yu-dong et al　(Department of Horticulture, Tianjin Agicultural College , Tianjin 300384)
Abstract　[ Objective] The aim was to determine the optimal selection pressure of herbicide for genetic transformation plant of Melilotus suaveclens
Leseb..[Method] With the cotyledon , hypocotyl and stem tip with broken growing point of M.suaveclens plantlet as the explants , they were inoculated
into the differentiation mediums of MS+BA3 mg/ L+IAA0.2 mg/L that contained 0 , 1 , 3 , 5 , 10 mg/L herbicide basta for differentiation culture, and
then the optimal selection pressure of herbicide was screened out.Under the optimal herbicide selection pressure , the genetic transformation of explants
was conducted and the transformation buds were detected on molecular level.[ Result] When the herbicide concn.was 3mg/ L, all explants had no regen-
eration buds.After transformation cultivation , the regeneration rates of cotyledon , hypocotyl and stem tipwith broken growing point were 0.48%, 4.29%
and 10.8% resp.The result of molecular detection showed that exogenous gene had been transplanted into the transformation buds of M.suaveclens.
[ Conclusion] The optimal selection pressure of herbicide on explants of M.suaveclens was 3mg/ L and the exogenous gene transformation rate of stem tips
with broken growing point was higher.
Key words　Melilotus suaveclens Leseb.;Herbicide;Regeneration rate
基金项目　重盐碱地旱荒地改良植物选育(072CKFNCO1100)。
作者简介　刘玉冬(1967-),男 ,天津人 ,副教授 , 从事园艺方面的教
学与科研工作。
收稿日期　2009-02-11
　　草木犀(Melilotus suaveclens Ledeb.)属豆科草木犀属 1年
或 2年生草本植物 ,常被用做改良盐碱地的生物脱盐器 ,草
木犀不仅可以有效吸收土壤中的盐碱 ,还可增加土壤有机质
含量[ 1-4] 。笔者通过试验建立了草木犀离体再生技术 ,以期
为提高草木犀改良盐碱地的能力及其利用价值提供参考。
1　材料与方法
1.1　材料　草木犀(Melilotus suaveclens Ledeb.)试管苗 ,含抗
缺铁黄化FRO2基因的农杆菌 C58C1均由天津农学院园艺系
园林植物实验室提供;PCR引物由上海生物工程公司合成。
1.2　方法
1.2.1　除草剂浓度的筛选。取长出子叶且生长健壮的草木
犀试管苗 ,分别以子叶 、下胚轴 、破坏生长点的茎尖为外植
体 ,用含有 0、1、3、5、10 mg/L除草剂的分化培养基(MS+6-BA
4 mg/L+NAA 0.2 mg/L)诱导再生芽。其中叶片剪掉叶缘及
叶柄 ,下胚轴保留部分茎段组织 ,但不带腋芽 ,茎尖长约 2～ 3
mm ,用解剖针破坏其生长点。每种外植体在不同除草剂浓
度培养基上均接种 200块 ,培养条件为温度 28 ℃,光照 24 h ,
光强 2 000 lx。接种后每 7 d观察 1次 ,主要观察外植体及其
伤口部位颜色变化和愈伤 、再生芽的生长情况。培养 28 d后
统计各处理再生芽的诱导率。
1.2.2　不同外植体转化处理。取农杆菌 C58C1的 1个单菌
落 ,接种到LB液体培养基中过夜振荡培养 ,待其OD值为0.4
时取出 ,并用其浸染草木犀不同外植体[ 5] ,处理外植体数分
别为叶片 205片 ,下胚轴 256块 ,破坏生长点的茎尖 74块 ,将
外植体和C58C1单菌落接种在带有滤纸的MS 固体培养基
上 , 28 ℃、黑暗条件下共培养 2 d , 2 d后将外植体移至含有除
草剂(3 mg/L)、羧苄青霉素(500 mg/L)的分化培养基上 ,诱导
转化芽。培养条件为温度 28 ℃,光照 24 h ,光强 2 000 lx。接
种后每 7 d观察 1次 ,主要观察外植体及其伤口部位颜色变
化和愈伤 、再生芽的生长情况 。培养 28 d后 ,统计各处理外
植体的再生芽诱导率。
1.2.3　转化芽的分子水平检测 。将转化苗转入生根培养基
(1/2MS+IBA 0.5 mg/L)中 ,苗高 3 cm时随机选取 7株 ,各取
200 mg叶片 ,采用柱式DNA提取试剂盒提取转化苗的基因
组DNA ,以FRO2基因的两端保守序列为引物 ,进行 PCR扩
增 ,扩增产物用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。同时对其中 7
株转化苗的基因组DNA进行 Southern blot 检测 ,所用探针为
800 bp的 35S启动子基因片段 ,采用随机引物法 32 p dCTP10
～ 20 μCi对探针进行放射性标记 ,验证除草剂筛选转化植株
的可靠性。
2　结果与分析
2.1　不同浓度除草剂对不同外植体的筛选效果　由表 1可
知 ,培养基中无除草剂时 ,破坏生长点的茎尖的再生率最高 ,
子叶的再生率最低。从培养过程来看 ,在诱导再生的初期 ,
不同外植体的伤口部位均可长出愈伤组织 ,但叶片愈伤组织
多为白色 ,而下胚轴 、破坏生长点的茎尖的愈伤组织均为绿
色 ,随培养时间的延长 ,愈伤组织上很快长出再生芽。
当培养基中除草剂浓度为 1 mg/L时 ,对外植体的转化
率基本无影响 ,而除草剂浓度达到 3 mg/L时 ,所有外植体均
无再生芽产生 。诱导再生初期(大约 7 d),当培养基中除草
剂浓度为 1～ 5 mg/L时 ,所有外植体伤口部位均无变化 ,而当
除草剂浓度为 10 mg/L时 ,外植体开始变黄。培养 14 ～ 21 d
后 , 3、5 mg/L除草剂处理外植体开始变黄 ,伤口部位出现萎
缩 ,而 1 mg/L除草剂处理的外植体一直较绿 ,伤口部位有再
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2009 , 37(15):6873-6875　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　常俊香　责任校对　卢瑶
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2009.15.060
生芽分化 ,且外植体大小和颜色基本无变化。培养 28 d后 ,3
～ 10 mg/L除草剂处理的外植体颜色开始由黄变黑 ,最后枯
萎 、死亡 。
表 1　不同浓度除草剂对草木犀不同外植体的筛选效果
Table 1　The screening effects of different explants of Melilotus suaveclens
with different concentration of herbicide
除草剂浓度∥mg/L
Herbicide
concentration
再生率∥% Regeneration rate
子叶
Cotyledon
下胚轴
Hypocotyl
破坏生长点的茎尖
Stem tip with broken growing point
0 11.5 34.1 100.0
1 10.9 28.1 100.0
3 0 0 0
5 0 0 0
10 0 0 0
2.2　不同外植体对基因转化率的影响　由表 2可知 ,草木
犀试管苗不同部位外植体对FRO2基因的转化效率存在明显
差异。其中破坏生长点的茎尖对FRO2基因的转化率最高 ,
而子叶对 FRO2基因的转化率最低。
从诱导过程来看 ,接种初期(7 d),所有外植体均无较大
差异。培养 14～ 21 d后 ,接种的大部分叶片组织开始变黄 ,
少数叶片的伤口处有白色愈伤组织长出;下胚轴变黄数量较
叶片略少 ,愈伤组织多出现在叶柄与茎的连接处 ,且愈伤多
为绿色或淡绿色;破坏生长点的茎尖变黄外植体数最少 ,愈
伤均为绿色 ,且个别愈伤可长出转化芽。培养 28 d 后 ,大部
分没有再生芽或愈伤的外植体基本变黄 、变黑至死亡。
表 2　不同外植体对基因转化率的影响
Table 2　Effects of different explants on the gene transformation rate
不同接种部位
Different inocul-
ation parts
接种外植体数∥块
Number of inocu-
lated explants
再生芽数∥个
Number of regen-
erated buds
再生率∥%
Regeneration
rate
子叶 Cotyledon 　　　　205 　　1 　　0.48下胚轴Hypocotyl 256 11 4.29
破坏生长点的茎尖 74 8 10.80
Stem tip with broken
growing point
注:1为分子量Marker;9为对照草木犀 DNA;2～ 8为转化草木犀
DNA。
　Note:1 , Marker;9, Cont rol DNA of Melilotus suaveclens;2-8, Trans-
formed DNA of Melilotus suaveclens.
图 1　转化草木犀植株 PCR扩增0.8%琼脂糖凝胶电泳照片
Fig.1　0.8% agarose gel electrophoresis photograph for PCR ampli-
fication of transformed plants of Melilotus suaveclens
2.3　PCR及 Southern Blot 对转化苗的检测结果　由图 1可
知 ,未转化植株的DNA无扩增带。5株转化苗在 195 bp处有
1条特异性条带 ,说明外源基因已整合到草木犀基因组中。
　　由图 2可知 , 5株转化草木犀植株的基因组DNA均有很
强的杂交信号 ,而未转化草木犀的基因组 DNA无杂交信号 ,
说明外源FRO2基因已整合到草木犀基因组中。
　注:1～ 5为转化草木犀 DNA;6为阳性对照(转化质粒DNA);7
为未转化草木犀 DNA。
　Note:1-5 ,DNA of t ransformed plants of Melilotus suaveclens;6 ,Posi-
tive control(transformed plasmid DNA);7 , DNA from untrans-
formed Melilotus suaveclens plants.
图 2　转化草木犀植株 Southern blot检测照片
Fig.2　Southern blot detection photograph of transformed plants of
Melilotus suaveclens
3　讨论
3.1　除草剂筛选浓度的确定　含抗缺铁黄化 FRO2基因的
农杆菌C58C1的转化筛选标记为BAR基因 ,即除草剂可作为
转化芽的筛选标记 ,而除草剂对不同植物的筛选浓度存在差
异[ 6] 。据报道 ,筛选标记 BAR基因时 ,不同除草剂对 BAR基
因的筛选效果不同[ 7] 。
该试验结果表明 ,当所用除草剂浓度为 1 mg/L时 ,对外
植体再生基本无影响 ,而除草剂浓度为 3 mg/L时 ,无再生外
植体出现 ,故将 3 mg/L作为除草剂的筛选浓度 ,若除草剂浓
度高于合理筛选浓度 ,则对转化芽的生长具有抑制作用[ 8] 。
除草剂筛选转化芽时 ,若筛选时间过短 ,则筛选效果不
能充分表现出来;而筛选时间过长时 ,外植体再生因缺乏营
养受到抑制。该试验确定的除草剂对转化芽的合理筛选时
间为 28 d 。
3.2　不同外植体对基因转化效率的影响　不同外植体对
FRO2基因的转化率由大到小依次为子叶 、下胚轴 、破坏生长
点的茎尖。这些外植体中 ,基因转化率高的外植体再生率也
较高 ,说明高再生率是高转化率的前提。
试验结果表明 ,多数外植体均可产生愈伤 ,但仅有少数
愈伤组织可长出再生芽。且可再生芽的愈伤组织多为绿色 。
在不同外植体中 ,分生组织的多少是再生的关键。叶片中分
生细胞较少 ,因此其再生率较低 ,而茎尖中分生组织最多 ,再
生率也最高[ 9] 。绿色愈伤组织容易再生 ,这可能与细胞质浓
度有关 ,细胞质浓度较大时 ,营养充沛 ,利于细胞分化生长 。
采用分生组织较多的部位(如茎尖)为外植体时 ,由于原
生长点细胞分裂旺盛 ,筛选压力对其生长的抑制作用较弱 ,
易得到假转化苗(或嵌合体),故该研究对茎尖生长点进行了
破坏 ,同时保持了较高的除草剂筛选压力 。PCR及 Southern
blot检测结果表明 ,在 3 mg/L除草剂筛选压力下 ,采用破坏
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生长点的茎尖为外植体 ,可使草木犀的基因转化效率得到较
大提高。
4　结论
该试验采用草木犀试管苗的子叶 、下胚轴 、破坏生长点
的茎尖为外植体 ,在含有 0、1、3、5、10 mg/L除草剂草丁膦的
分化培养基MS+BA 3 mg/L+IAA 0.2 mg/L上诱导再生芽 ,
得出 3mg/L除草剂为适宜的筛选压力。在此筛选压力下 ,
对不同外植体进行遗传转化 ,其中破坏生长点的茎尖再生芽
的效率最高 ,对其部分再生苗进行 PCR及 Southern blot杂交
检测 ,再生苗均为转化苗(图 3～ 4)。
图3　移栽入土的再生转化草木犀
Fig.3　The regeneratecl and transformed M.suaveclens after trans-
planting
图 4　转化的草木犀外植体
Fig.4　The transformed explants of M.suaveclens
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(上接第 6872页)
2.2　琼脂糖电泳分析　不同方法提取 DNA的凝胶电泳检
测结果见图 1。由图 1可知 ,提取方法①、②、③、⑦、⑧、⑨、
⑩、 1所提取 DNA的电泳带很清晰 ,基本无降解拖尾现象 ,
在加样孔附近滞留的物质很少;而方法④、⑤、⑥电泳带不明
显 ,可能存在污染物。
2.3　RAPD检测　基因组 DNA是否可用 ,可直接用 PCR扩
增效果验证。在 PCR扩增反应中 ,对模板 DNA 的要求以
RAPD最低。由图 2可知 ,运用 11种不同方法通过 RAPD检
测都能扩增出清晰的带型。
图 2　RAPD扩增电泳图谱
Fig.2　RAPD amplification electrophotogram
3　讨论
(1)对于方法④,利用提高 CTAB 浓度的办法提取 DNA ,
未能获得满意效果。可能是因为CTAB 具有一定的黏性 ,浓
度过高 ,保温时材料与 CTAB缓冲液难以充分混匀 ,造成材料
发泡不均匀 ,需延长保温时间 ,增加DNA的降解 。
　　(2)分子生物学研究中 ,DNA的提取质量是影响试验分
析结果的关键因素之一。目前 ,植物基因组 DNA的提取方
法主要有CTAB 法 、SDS 法以及试剂盒提取法等。人们常根
据试验目的 、要求和植物种类或营养体的不同选用不同的方
法 ,具体操作也会存在较大差异。该试验中 ,由于枸杞叶片
组织含有较高的糖和酚类物质 ,利用适用于其他植物的提取
方法从枸杞叶片中也能得到枸杞基因组 DNA ,完全能满足
RAPD分析的需要。
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687537卷15期　　　　　　　　　　　　　　　　刘玉冬等　提高草木犀遗传转化植株再生率技术的研究