全 文 ：· 栽培与育种 ·
抗除草剂基因导人四倍体藉蓝
许铁峰 , 唐克轩
(l
. 第二军医大学药学院 , 上海 2 0 0 4 3 ;3
张汉明 ` 郭美丽 ` 张 磊 , 李富鹏 ,
2
. 上海交通大学植物生物技术研究中心 ,上海 2 0 0 0 30)
摘要 以 C a M V 35 5 为启动子 ,将带有抗除草剂基因 ( bar 基因 ) 的 pC A MBI A 330 植物双元表达载体 ,导人根
癌农杆菌菌株 E H A 105 ,作为基因工程菌转化四倍体落蓝 , 选出 s m留 L 的草丁磷 ( P )t 为适宜的筛选压 。 筛选得到
的抗性植株经 CP R 鉴定 ,结果表明 b ar 基因已转移到四倍体秘蓝的基因组 ,从而建立了农杆菌介导的四倍体秘蓝
的遗传转化系统 , 为利用基因工程进一步改良秘蓝品质奠定了基础 。
关键词 四倍体藉蓝 遗传转化 抗除草剂基因
落蓝 sI a ist in d妙 ict a oF rt . 为我国历代常用 中药
板蓝根和大青叶的主要基原植物 ,有清热解毒 、凉血
利咽的功效 , 可防治病毒性感染 , 对流行性乙型脑
炎 、 流行性感冒 、 急慢性肝炎 、 流行性腮腺炎等均有
效 。 本种人工四倍体 ( Z n = 28 ) 的抗内毒素及抗病
毒作用显著强于二倍体 ,是优质高效的新品系 ,具有
很大的开发利用价值〔`〕 。 由于 国内外对蓓蓝需求
量很大 , 因此各地广为栽培 。 在栽培过程中 ,常因除
草剂的侵害 ,造成质量和产量下降 。
基因工程技术的发展为培育抗除草剂药用植物
新品种提供了新的手段 。 农杆菌扭 g 了。 bac et ir u m )介
导的遗传转化是目前应用最广泛的方法 。 它具有操
作简单 、费用较少 、 拷贝数低 、 表达稳定等优点川 。
b ar 基因是 19 8 6 年由 M u r a k a m i 等从链霉菌 ( S tepT t o -
m ,℃ es )中分离和克隆得到的 。 由它编码的乙酞 C o A
转移酶能使草丁嶙 ( p t , 是非选择性 、 广谱除草剂
B as at 的活性成分 ) 乙酞化而失活 。 在 C a M V (花椰
菜花叶病毒 ) 3 5 5 启动子调节下 , B ar 基因被导人烟
草 、番茄 、马铃薯和水稻 , 转基因植株的 P t 抗性较
对照提高 4 一 or 倍 〔’ 〕 。 目前应用生物技术已将 b ar
基因导人 20 多种植物 〔’ ,4 一 6〕 , 占整个转基因植物总
数的 70 % 以上 。 含 ba r 基因的转基因油菜和大豆已
在北美大面积推广 ,取得了明显的经济效益 。 本文
报道通过农杆菌介导方法 ,成功地将 ha r 基因导人
四倍体落蓝 ,建立了四倍体落蓝的遗传转化系统 。
1 材料和方法
1
.
1 无菌外植体的获得 将四倍体落蓝种子 (第
二军医大学药学院生药教研室提供 )用 75 % 乙醇表
面消毒 1 m i n 后 ,在 0 . 1% H g C 12 溶液中浸泡 10 m i n
并轻轻摇动 ,最后用无菌水冲洗 5 次 ,在无菌操作台
上接到含蔗糖 3% 、 植物明胶 0 . 26 % 的 M S 培养
基〔7〕上培养 ( 2 5℃ ,光照 12 丫 d ,光强度 4 0 0 l u x ) , 5
d 后萌发 。 取萌发后 3 d 左右的无菌苗的子叶和下
胚轴作外植体 。
中药材第 26 卷第 5 期 2 0 3 年 5 月
1
.
2 外植体对 p p t 的耐受试验 配制含 o 、 2 、 3 、 5 、
8
、
10
、
15
、
20 m岁 L p p t 及 l m岁 L B A 、 0 . Z m岁 L NN A
的 M s 培养基陈 , 〕 。 每个培养皿接种 or 个外植体 ,
每个处理组设 3 培养皿 。 1 个月后根据各处理组的
外植体生长状况 ,找出落蓝外植体敏感的 p tP 浓度 。
1
.
3 工程菌的获得及活化 将 3 0 质粒 ( 含
C a MV 35 5 植物特异表达启动子 、 b ar 基 因 ) 通过冻
融法 〔’ 〕导人农杆菌菌株 E H A or s ,构成本实验用的
工程菌 。 27 ℃ 、 20 rp m 条件下 ,在 L B 培养液【含利
福平 ( ir f ) 8 0 m酬 L , 卡那霉素 ( k a n ) S O m岁 L ,链霉
素 ( s t r ) 5 0 m岁 L」中 ,将工程菌摇至 60() n m 处的吸
收度 ( A , 值 )为 0 . 8 一 1 . 0时 , 5 0 0 0 印m 离心 5 m i n ,
去上清后以同样体积的 12/ M S 培养液 (大量元素
减半的 M S 培养液 )重悬 , 并加人乙酞丁香酮 ( A s )
至终浓度为 10 林m o F L ,继续摇菌 l h 后 即可用于
转化 。
,
.
4 叶盘法转化荻蓝 将生长 3 d 的落蓝无菌苗
的子叶和下胚轴分别剪下 ,再将子叶剪成 0 . 1 一 0 . 2
c m Z 小片 ,下胚轴剪成 1 一 1 . 5 Cm 小段 ,并在子叶周
围和下胚轴上剪出迪伤 口 , 浸人活化好的工程菌菌
液 巧 功 in ,然后用无菌滤纸吸去多余的菌液 , 置 于
MS 固体培养基上 , 25 ℃ 暗培养 。 3 d 后将培养的外
植体用无菌水冲洗 3 次 , 再用含头抱霉素 ( C ef ) 2 50
m岁 L 的 M S 培养液冲洗 1 次 ,用无菌滤纸 吸干 , 接
种于选择分化培养基 ( M S + 6 一B A l m岁 L + a 一N AA
0
.
Z m酬 L + PP t s m岁 L + C e f 3X() m岁 L + A s 10()
林m o F L )上培养 ( 25 ℃ , 光照 12 h/ d , 光强度 4 00()
lu x)
,每 2 周继代一次 。 以未转化外植体作为对照 。
约 1 . 5 一 2 个月 ,将高 2 c m 左右的幼苗转到生根培
养基 ( l / 2 M S + p p t 2 . s m岁 L + C e f l X() m岁 L + N AA
0
.
l m酬)L 上生根 。
1
.
5 杭性植株的 PC R 检测 剪取各抗性植株的
一小块叶片 (约 0 . 1 9 ) ,用 s D s 法 3j[ 提取植物基因
组 D N A 作 为模板 , 用 ba r 基 因引物 ( 14 693 和
·
3 13
·
DOI : 10. 13863 /j . i ssn1001 -4454. 2003. 05. 001
4 1 6 94 )进行 Pe R扩增检测 b a :基因 〔 4〕。 以基 因工
程菌为阳性对照 , 以未转化的秘蓝基因组 DN A 为阴
性对照 。
14 6 9 3 : 5
’ 一
T C G A G T C T A C C A T G A G C C C A
G AA C
一
3
’ 。
14 6 9 4 : 5
` 一
C G A GT C A A AT C T C G G T GA C G
GG C A
一
3
` 。
2 5 林l 反应 体系含 : 引物 ( 5 0 n群林l ) 各 l 协l ,
dN T p ( 5 m m
o F L ) l 林l , 模板 2 林l , T a q 酶 ( S U / 林l )
0
.
25 协l , M g C I: ( 2 5 m m o F L ) 1
.
5 卜l , 10 x P C R b u fe r
2
.
5 协l ,超纯水 1 5 . 7 5 林l 。
P C R 反应条件 : 9 4℃ / 3 m i n 、 〔9 4℃ / 5 0 5 。
6 5℃ / 5 0 5升7 2℃ / 5 0 5丑x 3 0 e y e l e s弓 7 2℃ / 10 m i n 、
4℃ 保存 。
电泳检测条件 : 1% 的琼脂糖凝胶 , 1 x TA E 电
泳缓冲液 , 6 0 V , 6 0 m i n 。 在 UV p 型凝胶电泳成像系
统上进行观察并拍照 。
2 结果
2
.
1 荻蓝对 p t 敏感浓度的确定 在含一 系列浓
度 P t 的 M S 培养基上 , 30 天后落蓝外植体的形态
发生了比较大的变化 。 在夕tP 浓度为 2 和 3 m岁 L
的培养基上 , 秘蓝子叶和下胚轴与不含 p t 的培养
基上的相同 ,均能不经愈伤组织直接分化出芽 。 在
p tP 浓度为 s m岁 L 和 s m岁 L 的培养基上 ,秘蓝子叶
和下胚轴没有分化 ,也没有生长 , 颜色略微变黄 。 而
在 P t 浓度大于 or m岁 L 的培养基上 , 秘蓝外植体
颜色变得枯黄直至褐色而死去 。 因此选择 s m岁 L
的 p tP 作为秘蓝的筛选压 。
2
.
2 转化外植体在筛选培养基上的分化 在筛选
培养基上培养约 20 d 后 ,转化的秘蓝子叶和下胚轴
有部份开始分化 ,丛伤 口处逐渐长出小芽 ,而对照则
除了颜色变黄以外没有其它变化 。 从再生能力看 ,
下胚轴高于子叶 (表 1 ) , 所以更适合做秘蓝转基因
的材料 。
表 , 落蓝转化外植体在筛选培养基
(含 s m岁 L p tP )上的再生频率
侵染的外植体数 生芽的外植体数 再生频率 (% )
子叶 34 7 5 3 15 . 3
下胚轴 46 3 107 2 3 . 1
2
.
3 转化植株的 P C R 检测 P C R 产物的琼脂糖
凝胶电泳结果显示 , 抗性植株的 P C R 结果为阳性
(见图 ) ,同阳性对照一样在 60 b p 左右有一条明显
的条带 , 而未转化的落蓝 P C R 没有扩增出任何条
带 ,可以初步说明 b ar 基因已整合到秘蓝基因组 。
3 讨论
·
3叹4 ·
20 (、 (、 b p
10 0 0卜价
SOOb p
图 转 bar 基因荻蓝的 P C R 检测结果
1 一 6 : 转 b盯 基因的秘蓝抗性植株 N C : 阴性对照 P C : 阳
J性对照 M : 分子量标准
本试验选用秘蓝四倍体优良品系作为材料 , 利
用植物基因工程的方法 , 以期获得对除草剂具有抗
性的新品系 。
四倍体落蓝的子叶和下胚轴在特定植物激素的
诱导下能直接再生出芽 ,是比较理想的转基因受体 。
有报道 , 由丛生芽直接分化得到的再生植株在遗传
性状上较通过诱导愈伤组织获得的再生植株更加稳
定 〔’ 。〕 。
在农杆菌介导的遗传转化中 ,适当的菌液浓度
是转化成败的关键之一 。 菌液浓度过低 ,会使工程
菌细胞数 目不足导致转化效率降低 ;菌液浓度过高 ,
则菌液中死菌数目过多 、工 程菌活力不足也会导致
转化效率降低 。 对秘蓝 的子叶和下胚轴而言 , 菌液
的 A 60 值为 0 . 8 较好 。 为避免 L B 培养基对植物材
料的伤害 ,本试验在临用前将工程菌用 1 2/ M S 培养 ;
液重悬 ,效果比较好 。
农杆菌 iT 质粒的 iV r 区 ( 毒性 区 , 由 iV rA -
iV r G 组成 )基因对 T 一D N A 的转移起介导作用 。 当
农杆菌在生长培养基中大量繁殖时 ,所有的 iV r 基
因均处于非转录活性状态 。 iV r 基因可 以被一些酚
类化学物质 (如乙酞丁香酮等 )所激活 〔’ 〕 , 因此在转
化前 l h 向培养液中加人 10 0 卜m ol / L 的乙酞丁香
酮激活 iV r 基因可提高转化效 : 率 。
参 考 文 献
王寅 ,等 . 四倍体秘蓝体外抗内毒素 、抗病毒作用评价 .
中国中药杂志 , 2 0 0 0 , 25 ( 6 ) : 32 7
王关林 ,等 . 植物基因工程原理与技术 . 北京 : 科学出
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( 2X() 3
一 0 1 一 13 收稿 )
T r a n s fo mr
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黄茂多倍体的诱导与鉴定
吴玉香 高建平 赵晓明
( 山西农业大学农学院 , 山西太谷 0 3 0 801 )
摘要 本试验采用改良琼脂涂抹法 ( 0 . 2% 的秋水仙碱与 0 . 1% 的琼脂混合成半固体 ) 处理黄蔑 sA t r a g a l。
me m bar ~
us va
L
nID
刀 g ho l ic us 幼苗顶芽 ,得到的诱导株 , 经生物学性状鉴定和染色体鉴定为四倍体 。
关键词 黄茂 多倍体 诱导
黄蔑又称黄着 ,始载于 《神农本草经》 , 性微温 ,
味甘 ,能补气固表 、利尿 、托毒排脓 、生肌 ,疗效显著 ,
已有 20 0 多年的应用历史 ,在国内外享有盛誉 〔` 〕 。
多倍体植物由于其基因的剂量效应 ,植物的营
养器官变大 ,有效成分增加 , 抗逆性增强 , 但种子发
芽率低 ,对收获根 、茎 、 叶 、花的药用植物来说不致成
为主要缺点 〔’ 〕。 本研究以多倍体诱变育种 , 以期获
得多倍体黄蔑 ,增加中药材的种质资源 。
1 材料与方法
1
.
, 试验材料 黄茂采自于山西省浑源县 , 经鉴
定为蒙古 黄蔑 态 t r a g a lo enI m b ar an ce us ( iF sc h . )
B u n g e v a .r mo 鳍 h o l ic 。 ( Bg e . ) H s i a o 。
1
.
2 多倍体的诱导 将黄蔑种子经温汤 ( 60 ℃ )浸
种处理 24 h 后播于营养钵 。 于两片子叶展开期 , 以
0
.
2% 浓度的秋水仙碱与 0 . 1% 的琼脂混合成半固
体涂抹顶芽 ,再罩 50 ml 烧杯以防止秋水仙碱溶液
蒸发 , 同时设置对照 ,分别在 1 、 2 、 3 天后去掉罩杯 ,
中药材第 26 卷第 5 期 200 3 年 5 月
并浇水 、管理 。 在适当苗龄期移栽进大田 , 以获得多
倍体黄茂 。
1
.
3 生物学性状观察 定期观察记录幼苗生长发
育状况 , 于花期测量叶长 、叶宽 、 株高 、茎直径 ,并记
录花期 、果期和果实形态 , 测量果实大小 , 统计结实
率 。
1
.
4 染色体鉴定 将处理后得到的诱导株种子和
未处理的对照黄蔑种子 , 用 60 ℃ 温汤浸种后 , 置培
养箱发芽 ,约 5 天后胚根长至 1 一 2 c m 时 , 剪下用
对 一二氯苯饱和溶液于室温下预处理 (最好上午 8 -
9 点 ) 2 . s h 左右 。 然后用卡诺固定液 (无水乙醇一冰
乙酸 , 3 : 1) 固定 2 一 24 h氏4〕 ,经固定后的材料转入
50 % 酒精 ,然后用蒸馏水清洗 ,再用 I N 盐酸于室温
下解离 10 m in 。 解离后 的材料用蒸馏水洗 3 次 , 转
人 45 % 醋酸中软化 10 m in , 卡宝品红染色压片 。 经
镜检挑选染色体分散良好的细胞 ,用光学树胶封片 ,
观察并摄影 。
·
3 15
·