全 文 ：收稿日期:2008 01 07
基金项目:华南热带农业大学科技基金资助(Rnd0710)
作者简介:陈　萍(1977 ), 女 ,湖北新洲人 , 讲师 ,在读博士研究生 ,主要从事热带果树教学和研究工作。
人心果 DNA提取方法比较
陈　萍 ,代　琴 ,曾　珍
(海南大学 园艺园林学院 ,海南 儋州 571737)
摘要:采用 SDS 法 、CTAB 法及其改进的各种方法提取人心果基因组 DNA ,并对提取的 DNA 进
行质量比较 。结果表明:改良 CTAB 方法二提取的 DNA 产率高 , 无明显降解 , 杂质少 , OD260/
OD2 80接近 1.80 ,是有效提取人心果基因组 DNA的方法 。
关键词:人心果;DNA;提取方法
中图分类号:S667.9　　文献标识码:A　　文章编号:1004 3268(2008)05 0098 03
Comparison betw een Dif ferent M ethods of
DNA Ex traction f rom Sapodilla
CHEN Ping ,DA I Qin ,ZENG Zhen
(Horticultural Depar tment o f Hainan Univer sity , Danzhou 571737 , China)
Abstract:Genomic DNA of Manilkara zapota was ex t racted using six different methods:CTAB ,
SDS and o ther improved methods , and compared in quali ty.The result show ed that the improved
CTAB in tw o w ay was the best , with high throughput , lit t le deg radation , less impurity and an
OD2 60/OD280 ratio of around 1.8.
Key words:Manilkara zapota;DNA;Extract ion method
　　人心果(Manilkara zapota)原产墨西哥及中美
洲 ,属于山榄科人心果属热带常绿乔木 ,是一种具有
广泛用途的热带果树 ,有十分重要的开发利用价值 。
人心果是一种热带名优水果 ,且具有药用的特性和
较高的观赏价值[ 1] 。又由于人心果抗逆性强 ,适应
性广 ,栽培成本较低 ,这就决定了人心果栽培具有较
高的经济效益[ 2] 。
国内学者虽然已在人心果引种及栽培方面开展
了一定的工作 ,但与国外仍有较大差距 ,有关人心果
细胞学 、分子生物学等方面的研究尚属空白 ,积极开
展此项研究工作 ,对人心果分类及优良品种选育有
重要意义 ,也可以此为基础 ,利用分子标记技术对人
心果品种进行分类研究 ,在此基础上运用远缘杂交
或其他高新技术育种方法培育适应我国气候特征的
优良人心果品种[ 1 , 2] 。
1　材料和方法
1.1　试验材料
1.1.1　材料与主要生化试剂　试验材料人心果的
新鲜叶片采自原华南热带农业大学园艺学院果园内。
主要生化试剂为巯基乙醇 、氯仿 、异戊醇 、无水乙醇 、
PVP-40 、乙酸铵等 ,均为国产分析纯及以上纯度。
1.1.2　主要仪器设备 　H -8数显恒温水浴锅 、
UV-1601PC 紫外可见分光光度计 、产自德国的
UNIV ERSAL -32R 高速冷冻离心机 、产自英国
UVI公司的 GAS7401X胶凝成像系统 。
1.2　试验方法
1.2.1　DNA 提取液　①CTAB 提取液:2×CTAB
提取缓冲液 [ 100mmol/ L T ris -HCl(pH8.0),
20mmol/ L EDTA , 1.4mmo l/L NaCl , 2%CTAB ,
5%PVP , β -巯基乙醇] , 1 ×CTAB 沉淀缓冲液
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2008年第 5期
DOI :10.15933/j.cnki.1004-3268.2008.05.026
[ 50mmol/ L Tris-HCl(pH8.0), 10mmol/L ED-
TA ,1%CTAB ,20mmol/ L , β-巯基乙醇] 。 ②SDS
提取液:提取缓冲液[ 50mmol/ L T ris-HCl(pH
8.0), 10mmol/L EDTA (pH8.0), 140mmol/ L
NaCl , 5%SDS ,5%PVP , 5%的 β -巯基乙醇(现加
现用)] 。 ③TE 缓冲液:10mmol/ LTris-HCl(pH
8.0),1mmo l/L EDTA(pH8.0),高压灭菌备用 。
1.2.2　DNA 提取方法　方法一(CTAB法):参考
王家保[ 3] 、牛建新[ 4] 、段中岗[ 5] 等的方法 。基本步骤
如下:(1)取 0.2 g 新鲜的人心果叶片 ,用蒸馏水把
叶片冲洗干净 ,吸水纸吸去表面水分。加部分液氮
快速研磨成粉末状 ,转入到已准备好的预冷的离心
管中 。(2)立即加入等体积(质量浓度)的用 65℃预
热的 2×CTAB 提取缓冲液 ,再加入等体积的氯仿
-异戊醇(24∶1)充分混匀 , 在 65℃水浴中保温
30min ,间或上下颠倒离心管几次 。(3)将离心管取
出 ,冷却至室温 ,装入离心机中 ,12 000 r/min ,离心 5
min。(4)取出后缓慢吸取上清液转入另一离心管
中 ,加入等体积的氯仿 -异戊醇(24 ∶1), 4℃,
12 000 r/min ,离心 5min。(5)吸取上清液后加入等
体积的冰冷的异丙醇 , 室温放置 30min , 然后
10 000 r/min ,离心 10min。(6)倒掉上清液 ,70%乙
醇洗 2 次 , 第 2次洗的时候离心 3min ,为 4 000 r/
min。(7)待 DNA 在室温干燥后 ,加 100μL T E 溶
解 ,再加 RNase(20μg/mL), 在 37℃水浴中保温
30min。(8)加 2倍体积的无水乙醇和 1/10倍体积
的 3mol/ L NaAc(pH5.2), 放在 20℃的冰箱中
2h 。(9)取出后 ,4 ℃、10 000 r/min离心 10min ,倒
掉上清液 ,在室温下吹干 ,加 30μL TE 缓冲液溶解 ,
在 20 ℃冰箱中保存。
方法二(改良 CTAB 法一):步骤基本同方法
一 ,水浴时间减少到 20min ,且 70%乙醇洗 1次 。
方法三(改良 CTAB 法二):步骤基本同方法
一 ,只是在加缓冲液的同时加入预过热的 120μL 的
10%SDS提取缓冲液;在 37℃水浴中水浴 10min 。
方法四(SDS 法一):参考牛建新[ 4] 、段中岗等[ 5]
的方法有改进。步骤基本同方法一 ,第 1步缓冲液
改为加 500μL 65℃预热的 SDS 提取缓冲液 , 置
65℃水浴锅中温育 15min , ;还有第 1次 DNA 沉淀
所用的化学试剂改为无水乙醇和醋酸钠相结合的沉
淀方法。
方法五(SDS 法二):与方法四的区别在于第 1
步多加入 6μL 巯基乙醇 ,第 2步在加氯仿-乙戊醇
前 ,加入 1/10倍体积的冰的 5mo l/L KAc ,混匀 ,在
冰上 放置 30min 。并 4℃, 12 000r/min , 离 心
15min。
方法六(改良 SDS 法):在方法四的基础上进行
改进 。只是沉淀 DNA 改为异丙醇沉淀 1 次的
方法。
1.3　DNA纯度的测定
吸取10μL 的 DNA 溶液 ,加入3mL 蒸馏水中 ,
转入分光光度计的石英比色杯中 ,用紫外分光光度
计测量 260 nm 和 280 nm 处的 OD 值 , 根据公式
DNA 浓度(ng/μL)=50 ×OD260 ×301 ,计算 DNA
浓度 ,根据 OD260/OD280判断 DNA 的大致纯度 。
1.4　凝胶电脉分析
0.8%琼脂电泳凝胶(内加核酸染料),70V 恒压
电泳 2h 。在凝胶成像系统上观察电泳结果 ,拍照 。
2　结果与分析
2.1　6种方法提取的 DNA 浓度及纯度比较
将上述方法制备的人心果 DNA 经全自动紫外
分光光度计检测其浓度及纯度 ,纯净的 DNA 溶液
其 OD260/OD 280应为 1.80 ,所提取的 DNA 样品在
260nm , 280 nm 波长的紫外吸收值结果如表 1。从
表 1可以看出 , 6 种方法提取的 DNA ,其紫外吸收
值有较明显的差异 ,提取的人心果 DNA 效果不同 ,
以改良 CTAB 方法二的效果最好 ,其 OD260/OD280
比值为 1.76 ,比值最接近 1.80 ,表明 DNA 所得纯
度较高 ,污染少;其他方法的 OD260/OD280都小于
1.50。
表 1　不同方法提取的 DNA OD260/OD280值比较
方法 OD260 OD 280 OD260/OD280
一 0.13 0.071 1.07
二 0.155 0.109 1.42
三 0.030 0.017 1.76
四 0.110 0.076 1.45
五 0.234 0.181 1.29
六 0.150 0.109 1.38
2.2　DNA的电泳检测结果
图 1为 6种方法提取人心果基因组 DNA 的电
泳照片。由图 1 可见 , 6 种方法均可提出 DNA ,无
明显拖尾 ,说明提取的 DNA 完整性较好。利用改
进的 CTAB方法二所提取的人心果 DNA 无拖尾 、
模糊现像 ,主带的亮度最亮 ,表明 DNA 纯度较高 ,
没有降解 ,满足试验的要求 ,说明该方法提取人心果
DNA 效果最好 ,这与紫外分光光度计测定的结果一
致 。这主要是加入了 CTAB , β -巯基乙醇和部分
SDS 的结果 ,CTAB是去污剂 ,它能与 DNA 形成复
合物而溶解于高盐溶液中 ,当盐浓度降低时此复合
物将析出 ,蛋白质和糖类不会因为 (下转第 103页)
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河南农业科学
种的大 、中型果所占比例增长较明显 ,果实的单果重
及果形指数都有了不同程度的提高 ,果实的糖酸含
量可能更适合鲜食要求 ,风味有所改善 。
2)果园实行生草覆盖 ,不仅改善了果园环境 ,
减少了病虫害的发生 ,同时可以抑制杂草生长 ,避免
因使用农药 、化肥而造成的果品品质下降 ,为生产绿
色无公害果品奠定了基础[ 2] 。
3)果园实行生草覆盖 ,一定程度上提高其观光
效果 ,同时劳力投入减少 ,降低了生产成本 ,有效提
高了果园的经济效益 。
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(上接第 99页)
1:方法一;2:方法二;3:方法三;4 , 5:方法四;6, 7:方法五;8 , 9:方法六
图 1　人心果 DNA琼脂糖凝胶电泳结果
盐浓度的降低而形成沉淀 ,因此可以达到良好地分
离 DNA 和蛋白质及糖类的目的。
　　CTAB法提取的 DNA 主带较弱;改良 CTAB
方法一提取的 DNA 主带很弱;方法四提取的 DNA
电泳结果与改良 CTAB 方法一相似 。方法五和方法
六采用 SDS法提取的DNA ,存在通道现象(图 1),均
含有一定量的 RNA ,且 DNA 主带的亮度较亮。这几
种方法提取效果均不佳。
3　讨论
本试验所采用的 6种方法都可以提取出人心果
基因组 DNA ,但各种方法提取的 DNA产量和纯度存
在较大差别 ,经电泳分析 、紫外检测 ,其中改良 CTAB
方法二能较好地除去多糖 、多酚及蛋白质杂质 ,提取
的DNA产量和纯度均较高 ,提取效果较为理想 ,可作
为人心果 DNA提取以开展分子生物学研究的首选提
取方法。
提取植物 DNA的方法虽然很多 ,提取过程中的
许多操作对获得高质量的基因组DNA 有非常重要的
影响 ,但每种方法最关键的有 3步 。第 1 步 ,样品要
充分研磨 ,破碎细胞壁和细胞膜使 DNA释放到提取
缓冲液中 ,研磨充分的样品可以保证温育时样品和提
取缓冲液的充分混匀和 DNA 的充分释放 ,从而得到
理想的 DNA得率。第 2步 ,消除蛋白质 、多糖 、色素
等杂质的污染 ,这一步直接关系到提取的质量。用氯
仿/异戊醇抽提时动作要轻柔 ,以避免DNA受到外界
机械力的剪切而断裂成小片段。吸取离心的上清液
时要使用剪去尖端的吸头且注意不能吸入中间的蛋
白层 ,否则会严重影响 DNA 的纯度 。第 3步 , DNA
洗涤要充分。这一步是为了去除DNA 中的小分子杂
质以保证其纯度 ,充分洗涤后的 DNA 样品要充分干
燥以去除其中残留的乙醇 ,防止其抑制后续的酶切及
PCR反应。但要注意不要过度干燥 ,否则 DNA 会很
难溶解 。
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