全 文 ：第 29 卷 第 4期
2007 年 12 月
湘潭师范学院学报(自然科学版)
Journal of Xiangtan Normal University(Natural Science Edition)
Vol.29 No.4
Dec.2007
中国特有极度濒危植物猪血木
RAPD反应体系的探索①
欧阳蒲月1 , 2 ,苏应娟2 ,易 俗2
(1.广东化工制药职业技术学院 ,广东 广州 510520;2.中山大学 生命科学学院 ,广东广州 510275)
摘 要:采用改进的 CTAB 法提取中国特有极度濒危植物猪血木(Euryodendron excelsum H.T.Chang )嫩叶总 DNA ,进行
RAPD分析。分别研究了模板 DNA 、引物 、dNTPs、Mg2+和 Taq DNA 聚合酶用量对 RAPD PCR扩增反应结果的影响。 筛选并
建立了适合于猪血木 RAPD扩增的反应体系:总体积 25μL, 其中 10×PCR缓冲液(500 mmol/ L KCl , 100 mmol/ L Tris-HCl ,
1.0% Triton X-100 , 20 mmol/ L MgCl2)2.0μL ,引物(1.5μmol/ L)0.2μL , dNTPs(10 mmol/ L)0.3μL , 模板2μL(15 ng), Taq 酶
0.4μL(0.5 U),水 20.1μL。
关键词:猪血木(Euryodendron excelsum H.T.Chang );RAPD;反应体系;优化
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1671-0231(2007)04-0117-03
猪血木 Euryodendron excelsum H.T.Chang 为第三纪孑遗植物 ,在分类学上隶属于山茶科 Theaceae 猪血
木属 Euryodendron ,是我国特有的单属种 。猪血木已被列为国家二级保护濒危植物[ 1] ;然而 ,参照国际保护
协会(IUCN)的界定标准 ,它实际上属于极度濒危物种[ 2] 。应用 RAPD(random amplified polymorphicDNA)
技术对其进行遗传多样性分析 ,了解其遗传变水平可以为其制定保护策略 ,实施有效管理 ,直至为最终建
立可自我持续发展的种群提供必需的基础资料[ 3] 。随机扩增多态性 DNA(RAPD)技术现已成为在种内水
平上检测物种分子多态性的常规方法。RAPD标记使用的引物长度一般为 10个碱基 ,Tm 值较低 ,因而其
PCR反应易受实验条件的影响。对猪血木进行 RAPD分析 ,首先要建立一个稳定的反应体系 ,以确保
RAPD结果的可靠性 。为此 ,本文就猪血木 RAPD反应中的模板 DNA 、引物 、dNTPs 、Mg2+和 Taq DNA 聚合
酶用量以及退火温度对反应结果的影响进行了探讨 ,筛选并建立一个稳定的反应体系 ,为猪血木的遗传分
析提供一个标准化程序。
1 材料与方法
1.1 模板 DNA 的制备及其质量检测
将采自广东阳春八甲镇的猪血木个体的新鲜叶片 ,按改进的 CTAB法[ 4] 提取模板总 DNA 。紫外光吸
收以确定 DNA浓度和纯度 。
1.2 RAPD反应体系优化
以猪血木总 DNA为模板 ,采用S1290(ACCC CTGG CA)为引物 ,在 GeneAmp PCR System 2400(Perkin
ElmerCorporation)上进行 RAPD扩增反应。初始条件为:总体积 25μL ,其中 10×PCR缓冲液(500 mmol/LK-
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① 收稿日期:2007-05-14
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30271094)
作者简介:欧阳蒲月(1978-),女 ,湖南邵阳人 ,硕士 ,研究方向:药用植物资源和药用植物分子生物学。
Cl ,100 mmol/L Tris-HCl ,1.0 %Triton X-100 ,20 mmol/L MgCl2)2.0 μL ,引物(1.5 μmol/L)0.2 μL ,dNTPs
(10 mmol/L)0.4 μL ,模板 2μL(15 ng),Taq 酶 0.3μL (0.5 U)。扩增条件:94 ℃200 s 预变性;94 ℃60 s ,
36 ℃60 s;72 ℃120 s ,40 个循环;72 ℃延伸10 min ,之后 4 ℃保存。扩增产物用 100 bp DNA ladder 作为相
对分子量标准 ,用 1.0%琼脂糖凝胶(配制时已经加了溴化乙锭)于 3 V/cm 电场中电泳 。254 nm 紫外灯下
观察 、照像记录 。RAPD反应体系优化时 ,固定扩增程序 ,每次改变 RAPD反应中的 1个参数 ,以确定该参
数对 RAPD结果的影响 。筛选的参数包括:(1)模板 DNA质量浓度;(2)TaqDNA聚合酶用量;(3)引物用
量;(4)dNTPs 浓度;(5)Mg2+浓度。上述所用 RAPD引物 、酶及相关试剂均购自上海Sangon公司 。
2 结果与分析
2.1 模板 DNA质量浓度对 RAPD的影响
图 1 模板 DNA 量的影响
模板DNA质量浓度是影响 RAPD扩增产物产率与特异性的一个重要因
子。模板质量浓度太低 ,则扩增产物产量低或不稳定;模板质量浓度太高 ,则
可能增加非特异产物的扩增。图 1泳道 1 ～ 6是不同模板 DNA 质量浓度(50
ng/uL 、25 ng/uL、10 ng/uL 、7 ng/uL 、4 ng/uL 、1 ng/uL)下 ,以引物 S1290进行
RAPD扩增的结果。从图 1可以看出 ,模板DNA用10 ng/uL 以下 ,带很弱 ,几
乎看不到;而 10 ng/uL 与 25 ng/uL 相比 ,最大的 3 000 bp带不能得到有效扩
增。模板 DNA质量浓度高的(50 ng/uL)则扩增结果产生弥散现象 ,背景有点
模糊。说明对于猪血木的 RAPD扩增 ,较适的模板 DNA质量浓度范围为 25
ng 左右 ,这与 Lowe等[ 5]的研究结果基本一致。Lowe 等认为50 uL的反应体积 ,模板 DNA的量在 5 ～ 500 ng
之间常可以得到较好的结果 ,10 ～ 50 ng 是最适宜的。
2.2 TaqDNA聚合酶用量对 RAPD的影响
图 2 Tap 酶量的影响
在PCR反应中 ,Taq DNA聚合酶用量受到反应体积 、酶活 、酶的耐热性及
反应程序等因素的影响。为了确定猪血木的 RAPD反应中 Taq DNA 聚合酶
的适宜用量 ,试验选择 6个酶梯度 ,分别为 0.1 u 、0.2 u 、0.5 u 、1 u 、1.5 u 、2 u
(图 2泳道 1 ～ 6)。结果表明 Taq DNA聚合酶的用量在 0.5 ～ 2.0 u反应范围
内扩增结果差异不大(图 2泳道 1 ～ 6),因此 0.5 u的酶量对 25 uL 的反应体
积已足够 。
2.3 引物浓度对 RAPD的影响
分别以 0.036 、0.030 、0.024 、0.018 、0.012 、0.006 umol/L 5 个引物浓度梯
度图 3(泳道 1 ～ 6)进行 RAPD扩增 。结果表明引物浓度对 RAPD扩增结果有较大的影响。从图 3(泳道 1
～ 6)可以看出 ,当引物 S1209浓度为 0.006 umol/L 时 ,所得的扩增带较弱 ,基本上看不到。当引物浓度为
0.012 umol/L时 ,最小的那条带有点弱 。然而当浓度为 0.036 、0.030 、0.024 、0.018 umol/L 这个范围内 ,扩
增结果较为一致 。所以 0.018 umol/L 就已经足够 ,从而 1.5μmol/L的引物就只需要 0.3 μL。
2.4 dNTP 浓度对 RAPD的影响
dNTPs是 TaqDNA聚合酶的底物 ,其浓度将直接影响 RAPD扩增产物的量 ,同时也可能影响 TaqDNA聚
合酶的活性和扩增的特异性。用引物S1209对 50 、100 、150 、200 、250 、300 umol/L 6个水平的 dNTPs浓度进
行的试验(图 4中 1 ～ 6泳道)结果表明 ,当 dNTPs浓度低于150 umol/L时 ,扩增条带相对来说比较弱 ,且有
二条大小为800 bp以下的带不能有效扩增。在200 ～ 300 umol/L 范围内扩增带则基本一致 ,但带的强度有
明显的不同。考虑到带的强度和清晰度两方面 ,选择 250 umol/L dNTPs浓度进行猪血木的 RAPD扩增 。
2.5 Mg2+浓度对 RAPD的影响
Mg2+是 Taq DNA 聚合酶的激活剂 , 太低或太高都将影响酶的活性 ,此外其浓度还影响引物与模扳的
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解链与退火 。图 5中 1 ～ 6泳道分别表示 1.5 、2.0 、2.5 、3.0 、3.5 、4.0 mmol/L Mg2+显示了不同Mg2+浓度对
RA PD扩增结果的影响。结果表明 ,以 S1209 为引物 ,Mg2+浓度为 1.5 ～ 2.5 mmo/L 时 ,能扩增出清晰的
DNA条带 ,随着 Mg2+浓度的进一步提高 ,扩增条带逐渐减弱 ,且变得难以识别。因此 2.0 mmol/L的 Mg2+
浓度是进行猪血木 RAPD扩增的最适浓度 。
图 3 引物量的影响 图 4 dNTPs 量的影响 图 5 Mg2+量的影响
综合考虑上述各因素对 RAPD扩增的影响 ,最后选定猪血木的 RAPD扩增反应体系为:总体积 25 μL ,
其中 10×PCR缓冲液(500 mmol/LKCl ,100 mmol/L Tris-HCl , 1.0%Triton X-100 , 20 mmol/L MgCl2)2.5
μL ,引物(1.5μmol/L)0.3μL ,dNTPs(10 mmol/L)0.5μL ,模板 2 μL(25 ng),Taq酶 0.2μL(0.5U)。扩增条
件:94 ℃200 s预变性;94 ℃60 s ,36 ℃60 s;72 ℃120 s ,40个循环;72 ℃延伸 10 min ,之后 4℃保存 。
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