全 文 ：　　基金项目:国家 “ 863”项目(2006AA09Z446)和青岛市科技局项
目(07-2-1-8-NSH-1)
　　作者单位:266042山东省青岛大学第二附属医院普外科(宋修
岐 ,邢智远);青岛大学第一附属医院(郭云良 ,姚如永)
·论著 ·
角果木提取物 Tagalsin对 H22荷瘤小鼠 Survivin
和 Caspase-3表达的影响
宋修岐　邢智远　郭云良　姚如永
　　【摘要】　目的　探讨角果木提取物 Tagalsin对 H22肝癌细胞的抑制作用及其机制。 方法　将 H22肝癌细胞原位
接种于小鼠肝脏 , 建立小鼠原位移植性肝癌模型 , 建立模型第 10天将小鼠随机分为食用油空白对照组 、卡莫氟阳性对
照组和 Tagalsin低 、中 、高剂量治疗组 ,末次给药 24 h后处死小鼠;观察各组荷瘤小鼠的生存状态及体重变化 , 并计算
各组小鼠的肿瘤近似体积和脾脏指数;观察肿瘤组织病理学变化;免疫组化方法检测各组 Caspase-3、Survivin蛋白的
表达;逆转录-酶链聚合反应(RT-PCR)技术检测 Caspase-3、Survivin基因的表达。结果　Tagalsin能有效抑制 H22肝癌
细胞的生长 , 高剂量可使荷瘤小鼠的脾脏指数降低(P<0.01)。 Tagalsin低 、中 、高剂量治疗组的抑瘤率分别为
17.89%、63.11%、71.78%,卡莫氟组的抑瘤率为 63.12%;阳性对照组及 Tagalsin中 、高剂量治疗组 Caspase-3蛋白的
表达高于空白对照组(P均 <0.05), 而 Survivin蛋白的表达低于空白对照组(P均 <0.05);与空白对照组相比 , Tagal-
sin各治疗组及阳性对照组 Caspase-3基因水平显著上调(P<0.05或 P<0.01),而高剂量组及阳性对照组 Survivin基
因水平下调(P均 <0.01)。病理变化:Tagalsin高剂量组及阳性对照组肿瘤细胞体积缩小 , 胞浆浓染 ,核固缩 , 核仁不
清 , 肿瘤细胞可见破碎 ,有较多凋亡细胞分布。结论　Tagalsin对 H22肝癌细胞具有明显抑制作用 , 其机制可能与上调
Caspase-3基因表达而下调 Survivin基因的表达有关。
【关键词】　Tagalsin;原位肝癌移植瘤模型;免疫组化;逆转录-酶链聚合反应;Caspase-3;Survivin
中图分类号:R73-36　文献标识码:A　文章编号:1674-8182(2010)09-0748-04
　　TheeffectofceriopstagalextractsTagalsinonSurvivinandCaspase-3expressionofH22 tumor-bearingmice　　
SONGXiu-qi＊ , XINGZhi-yuan, GUOYun-liang, YAORu-yong.＊DepartmentofGeneralSurgery, TheSecondAfiliatedHospi-
tal, QingdaoUniversity, Qingdao266042, China
　　【Abstract】　Objective　ToinvestigatetheinhibitoryefectofTagalsin(ceriopstagalextracts)onH22 hepatomacels.
Methods　OrthotopictransplantationtumormodelofmousewasestablishedbytransplantingH22 mousehepatomacelsto
mouseliver, andtendaysafterthemice(n=60)wererandomlydividedintofivegroups:edibleoilblankcontrolgroup, carmo-
fur(HCFU)positivecontrolgroupandTagalsintreatmentgroupincludinglowdose, middledoseandhighdosesubgroups(n=
12each).Allmicewerekiled24 hoursafterlastmedication.Survivalconditions, weightchanges, calculatedtumorsimilar
volume, spleenindexandtumorinhibitionrateoftumor-bearingmicewerecompared, andpathologicalchangesoftumorwere
observed.ApoptosisfactorsCaspase-3 andSurvivinproteinweredetectedbyimmunohistochemicalmethod, andexpressionof
Caspase-3andSurvivingenesweredetectedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction.Pathologicalspecimenwasob-
servedunderopticalmicroscopebyHEstaining.Results　HepatomagrowthcanbeefectivelyinhibitedbyTagalsin.Spleenin-
dexoftumor-bearingmicewasdecreasedinhighdoseTagalsin(P<0.01).Thetumorinhibitionratesoflow, middleandhigh
dosegroupofTagalsinwere17.89%, 63.11% and71.78% respectively, andthetumorinhibitionrateofHCFUwas
63.12%.Comparedwithblankcontrolgroup, Caspase-3 protienexpressionsweresignificantlyhigher(allP<0.05), while
Survivinproteinexpressionsweresignificantlylower(allP<0.05)inpositivecontrolgroupandTagalsintreatmentgroupof
highandmiddledose.Likewise, Caspase-3 geneexpressionweresignificantlyenhanced(P<0.05 orP<0.01)inpositive
controlgroupandTagalsintreatmentgroupswhileSurvivingeneexpressionweresignificantlydroppedinpositivecontrolgroup
andTagalsintreatmentgroupofhighdose(alP<0.01)thanthoseinblankcontrolgroup.Pathologicalchangesshowedthat
tumorcellvolumewasshrinked, andhyperchromaticcytoplasm, karyopyknosis, unclearnucleole, brokentumorcellsandmany
apoptosiscellswereseeninpositivecontrolgroupandTagalsintreatmentgroupofhighdose.Conclusions　Tagalsincansig-
nificantlyinhibithepatomacelsofmice, andthemechanismofanti-tumorefectpossiblycorrelateswithup-regulatingCaspase-
3 geneexpressionanddown-regulatingSurvivingeneexpression.
【Keywords】　Tagalsin;Orthotopictransplantationtumormodeloflivercancer;Immunohistochemistry;Reversetran-
scriptionpolymerasechainreaction;Caspase-3;Survivin
　　角果木(ceriopstagal)为红树科角果木属植物 ,
其次生代谢成分具有止痛 、止痒 、止血及治恶疮 、疟
疾等功效 〔1〕。近年来研究发现 ,角果木提取物 Tagal-
sin具有很好的抗肿瘤活性 〔2〕。本研究通过观察
Tagalsin对接种于小鼠肝脏 H22瘤株的抑制作用 ,以
及对 Caspase-3和 Survivin基因的影响 , 从基因学
角度探讨 Tagalsin的抗肿瘤机制 ,为其临床应用
提供实验依据 。
748 中国临床研究 2010年 9月第 23卷第 9期　ChineseJournalofClinicalResearch, September2010, Vo1.23, No.9　　　
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　瘤株 　H22肝癌细胞株 ,购于中国海洋大学
药理研究所 。
1.1.2　动物　昆明种小鼠 60只 ,雌性 ,鼠龄 4周 ,
体重 29 ～ 30 g, 由中国海洋大学药物检验所提供
(SCXK鲁 2005-0010)。
1.1.3　药物 　角果木提取物 Tagalsin,北京大学天
然药物及仿生药物国家重点实验室提供(GSM-01),
原浓度 20mg·ml-1 ,用食用油稀释成 0.2 mg·ml-1、
1.0mg·ml-1、5.0mg·ml-1备用;阳性对照药卡莫氟
片(50 mg),给药前用食用油配成 30 mg·ml-1 ,齐鲁
制药有限公司提供(909011LH);康派特医用胶 ,北
京瞬康医用胶有限公司提供(090307)。
1.1.4　试剂　RPMI1640培养基 , GIBCO公司提
供;胎牛血清 ,杭州四季青生物工程有限公司提供;
胰酶 ,赛维商贸有限公司提供;兔抗鼠 Caspase-3、
Survivin一抗及 SABC免疫组化试剂盒由武汉博士
德公司提供;Trizol试剂 、引物 ,由 Invitrogen公司提
供;逆转录-酶链聚合反应(RT-PCR)试剂盒 ,北京百
泰克生物技术有限公司提供;酶链聚合反应(PCR)
试剂盒 、核酸染料 、Marker均由青岛东盛生物技术有
限公司提供;琼脂糖 ,西班牙琼脂糖发布公司提供。
RT-PCR的引物序列见表 1。
表 1　β -actin、Survivin和 Caspase-3的引物序列
名称　 引物序列 Tm(℃)
产物碱基
长度(bp)
β-actin　 正义链 5′TGCTGTCCCTGTATGCCTCT3′ 57.1
β-actin　 反义链 5′GATGTCACGCACGATTTCC3′ 56.5 221
Survivin　正义链 5′GCTTCATCCACTGCCCTAC3′ 55.1
Survivin　反义链 5′TCAAGAATTCACTGACGGTTA3′ 53.1 183
Caspase-3　正义链 5′GGAATGTCATCTCGCTCTG3′ 53.0
Caspase-3　反义链 5′GCAAGCCATCTCCTCATC3′ 52.7 375
　　注:Tm指解链温度
1.2　方法
1.2.1　肿瘤模型的建立　H22肝癌细胞株在 37 ℃、
5%CO2条件下培养于标准胎牛血清的 RPMI1640
培养液中 ,每 2天传代 1次 ,取第 4代对数生长期细
胞制成密度 1.0×108·L-1的单细胞悬液 ,无菌条件
下于小鼠腋下区皮下注射 0.2 ml。待移植瘤生长至
直径约 1cm时 ,取出肿瘤 ,放入少量生理盐水中 ,切成
1 ～ 2mm3小块备用。小鼠用 10%水合氯醛 0.15ml腹
腔注射麻醉后 ,沿胸骨下缘 0.5cm处作 3cm横切口
剪开皮肤分离至腹腔 ,挤出肝脏 ,显露肝左右叶 ,在
肝左叶切一长 3 mm的切口 ,用止血棉轻压 ,将瘤块
植入 ,用康派特医用胶粘住切口 ,见肿块植入无出血
后全层关腹 。接种 10 d后解剖小鼠 ,肝脏表面可见
直径约 2 mm的肿物 ,病理切片证实为恶性肿瘤 ,此
时造模成功 。
1.2.2　干预措施　将造模成功的 60只小鼠随机分
为食用油空白对照组 、卡莫氟阳性对照组(100 mg·
kg-1·d-1 )和 Tagalsin治疗组 ,治疗组按 Tagalsin
剂量再分为低剂量 (0.66 mg·kg-1·d-1)、中剂量
(3.30 mg·kg-1·d-1)、高剂量组(16.50 mg·kg-1·
d-1)。每组 12只 。每天灌胃给药 1次 , 每只
0.1ml,连续给药 5 d,间隔 2 d为 1个疗程 ,共 2个
疗程。
1.2.3　观察指标
1.2.3.1　大体观察　末次给药 24h后处死小鼠 ,取
肿瘤测量其长短径 a、b,取脾脏称重 ,计算肿瘤近似
体积和抑瘤率以及脾脏指数。肿瘤近似体积 V=a
×b2 /2;抑瘤率 =(空白对照组平均肿瘤体积 -治
疗组平均肿瘤体积)/空白对照组平均肿瘤体积 ×
100%;脾脏指数 =10×脾脏重量 /体重 ×100%。
1.2.3.2　组织切片 HE染色　取 1cm×1cm×1cm
大小的肝组织(包含肿瘤组织),置于 10%甲醛固定
2 h,常规梯度乙醇脱水 、二甲苯透明 ,石蜡包埋 ,连
续切片 ,厚度 5μm。常规 HE染色。
1.2.3.3　免疫组化检测 Caspase-3、Survivin蛋白的
表达　取上述石蜡切片免疫组化染色 ,按博士德
SABC试剂盒说明书操作 ,部分切片不加一抗 ,以
0.1mol·L-1PBS代替 ,不出现阳性着色。结果判断:
阴性:细胞无着色;阳性:细胞着色为浅黄色 、棕黄色 、
棕褐色。Survivin主要为胞浆染色 ,少量为细胞核染
色;Caspase-3为胞浆染色。每例随机观察 10个高倍
视野 ,不少于 1 000个细胞 ,计数阳性细胞数。阳性表
达率 =表达阳性细胞数 /总细胞数 ×100%〔3〕。
1.2.3.4　RT-PCR法检测 Caspase-3、Survivin基因
表达 　取新鲜肝组织 (包含肿瘤组织 )500 mg, 置
于 -80 ℃冰箱保存 。用 Trizol法提取细胞 RNA,紫
外分光检测其纯度和浓度 。按试剂盒说明书操作逆
转录成 cDNA。 β-actin为内参 ,行 PCR扩增 , PCR产
物进行 2.0%琼脂糖凝胶电泳 ,电泳结果采用自动成
像系统扫描 ,用 BiocaptMW软件分析各电泳条带灰
度 ,计算目的基因与 β-actin吸收峰面积比值 ,分别
比较各组目的基因表达水平。
1.3　统计学方法　用 SPSS15.0统计软件进行统计
处理。多组间均数的比较采用方差分析 ,两两比较
采用 q检验 ,给药前后的比较采用配对 t检验。检验
水准为 α=0.05。
2　结果
2.1　H22肝癌细胞小鼠原位移植瘤模型的建立　肝
脏接种 H22细胞第 5天解剖小鼠 ,接种部位肝脏表面
可见直径约 0.2cm的单个灰白色病灶肿物 ,未与周
围组织完全融合;接种第 10天 ,小鼠肝脏表面均有
灰白色肿物形成 ,直径约 0.3 ～ 0.4 cm,并与周围组
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织完全融合;第 15天时肿瘤直径约 0.5 cm;第 22天
时肿瘤直径约 1.0 cm。解剖证实造模成功率为
100%。成瘤以单发块状型为主 ,部分伴肝内或肺内
多发转移 ,说明该模型稳定 , 符合人类肝癌解剖特
点 。在建立模型过程中 ,小鼠死亡 5只 ,成活率为
91.67%。
2.2　小鼠生长状态比较　给药期间 ,各给药组小鼠
毛发较有光泽 ,行动较为敏捷 ,饮食较佳;空白对照
组小鼠反应迟钝 ,摄食不佳 ,毛发稀疏 ,呈现恶病质
状态。给药过程中各组腹水出现情况:以空白对照
组出现时间相对较早 ,空白对照组 、阳性对照组及
低 、中 、高剂量治疗组出现腹水的只数分别为 6、2、1、
1、1;肿瘤转移只数分别为 4、1、0、2、1;死亡只数分别
为 5、1、4、1、1。给药后与给药前相比 ,仅低 、中剂量
组小鼠体重较给药前明显下降(P<0.01),其他 3组
体重变化无统计学意义(P>0.05)。见表 2。
2.3　各组肿瘤近似体积 、抑瘤率及脾脏指数比较　
通过计算各组的肿瘤近似体积及抑瘤率 ,显示 Tagal-
sin治疗组和卡莫氟组明显抑制肿瘤的生长 , 以
Tagalsin高剂量组最为明显 。与空白对照组相比 ,
中 、高剂量治疗组及卡莫氟组的肿瘤近似体积差异
均具有统计学意义(P均 <0.01);Tagalsin各治疗组
与卡莫氟组相比肿瘤近似体积无明显差异(P均 >
0.05);Tagalsin各剂量组之间比较 ,高剂量组与低剂
量组肿瘤近似体积有统计学差异(P<0.05),而高 、
中剂量组间无统计学差异(P>0.05),中 、低剂量组
之间也无统计学差异(P>0.05)。 Tagalsin低 、中 、
高剂量治疗组的抑瘤率分别为 17.89%、63.11%、
71.78%,卡莫氟组的抑瘤率为 63.12%。 Tagalsin3
个剂量组脾脏指数均高于阳性对照组 (P均 <
0.01),仅高剂量组和阳性对照组明显低于空白对照
组(P<0.01)。见表 3。
2.4　病理组织学变化　光镜下观察 ,空白对照组肿
瘤细胞可见肿瘤组织纤维间质少 ,瘤细胞体积较大 ,
核大深染 ,核仁清晰可见 ,核分裂相多 ,胞浆少 ,嗜碱
性;Tagalsin高剂量组及阳性对照组肿瘤细胞体积缩
小 ,胞浆浓染 ,核固缩 ,核仁不清 ,肿瘤细胞可见破
碎 ,有较多凋亡细胞分布。见封 2图 1。
2.5　Caspase-3、Survivin蛋白表达检测结果 　阳性
对照组及 Tagalsin中 、高剂量组 Caspase-3的阳性细
胞数明显高于空白对照组(P均 <0.05);而 Survivin
的阳性细胞数明显低于空白对照组 (P均 <0.05)。
见表 4及封 2图 2、3。
2.6　Caspase-3、SurvivinmRNA水平变化　与空白
对照组相比 , Tagalsin低 、中 、高剂量组及阳性对照组
Caspase-3 mRNA水平显著上调 (P<0.05或 P<
0.01), 而 Tagalsin高剂量组及阳性对照组 Survivin
mRNA水平下调(P均 <0.01),以高剂量组为著。
见表 5及封 2图 4。
表 2　给药前后小鼠重量的变化情况　(g, x±s)
组别　　　 例数 给药前 给药后 t值 P值
空白对照组　 7 28.93±0.56 29.46±6.96 0.15 0.887
阳性对照组　 11 28.92±0.33 29.78±0.69 2.03 0.089
低剂量治疗组 8 28.69±0.36 24.05±1.51 6.96 0.002
中剂量治疗组 11 28.66±0.35 23.78±1.31 5.45 0.002
高剂量治疗组 11 28.66±0.35 29.68±0.52 2.20 0.070
表 3　Tagalsin对各组肿瘤近似体积 、
抑瘤率 、脾脏指数的影响
组别 例数 肿瘤近似体积(mm3 , x±s) 抑瘤率(%)
脾脏指数
(mg·10g-1 , x±s)
空白对照组　 7 225.80±109.73#△△ - 104.95±11.83#△△
阳性对照组　 11 89.60± 83.14＊ 63.12 56.23±11.42＊△△
低剂量治疗组 8 185.40±104.36△ 17.89 98.88± 8.57#△△
中剂量治疗组 11 89.61± 71.70＊ 63.11 96.11± 7.68#△△
高剂量治疗组 11 63.72± 47.03＊ 71.78 75.80± 9.18＊#
F值 25.88 4.96
P值 <0.01 <0.05
　　注:与空白对照组相比 , ＊P﹤ 0.01;与阳性对照组相比 , #P<0.01;与高剂
量治疗组相比 , △P<0.05, △△P<0.01
表 4　Tagalsin对 Caspase-3、Survivin蛋白表达的影响　(%, x±s)
组别 例数 Caspase-3 Survivin
空白对照组　 7 22.30± 5.59 67.21±7.23
阳性对照组　 11 40.11± 8.78＊ 32.44±8.55＊
低剂量治疗组 8 26.56± 7.21# 61.24±6.91#
中剂量治疗组 11 32.49±15.79＊# 29.57±5.55＊
高剂量治疗组 11 59.55±13.46＊# 28.43±4.41＊
F值　　　　 3.64 18.33
P值　　　　 <0.05 <0.01
　　注:与空白对照组相比 , ＊P<0.05;与阳性对照组相比 , #P<
0.05
表 5　Tagalsin及卡莫氟对 Caspase-3、
Survivin基因的影响　( x±s)
组别 例数 Caspase-3/β -actin Survivin/β-actin
空白对照组　 7 0.31±0.11# 0.87±0.05#
阳性对照组　 11 0.89±0.14＊＊ 0.52±0.11＊＊
低剂量治疗组 8 0.56±0.11＊# 0.81±0.13#
中剂量治疗组 11 0.65±0.14＊＊# 0.74±0.10#
高剂量治疗组 11 0.91±0.07＊＊ 0.47±0.13＊＊
F值　　　　 21.58 17.32
P值　　　　 <0.01 <0.01
　　注:与空白对照组相比 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;与阳性对照组
相比 , #P<0.01
3　讨论
　　皮下移植性肝癌是目前国内外用于肿瘤治疗药
物筛选及基因治疗研究的最常见模型 〔4-6〕。皮下移
植瘤便于观察和测量 ,但其肿瘤细胞生长的微环境
与人体内原发肿瘤生长的微环境完全不同 。而肝癌
原位移植瘤与皮下移植性肝癌相比 ,生长环境与人
体相似 ,对宿主的影响与原发肿瘤类似 ,易于客观判
断疗效 ,重复性好 ,且移植的肿瘤细胞生物学特性较
稳定 ,故本研究以肝癌原位移植瘤作为肿瘤模型。
750 中国临床研究 2010年 9月第 23卷第 9期　ChineseJournalofClinicalResearch, September2010, Vo1.23, No.9　　　
通过观察小鼠生活状态 、肿瘤生长情况及其他指标
的变化 ,表明 Tagalsin具有抑制肝癌细胞生长的作
用 。其抗肿瘤作用可能与细胞凋亡机制有关。
细胞凋亡涉及多种凋亡基因的参与 ,但最终都
需要激活不同的 Caspase家族成员 ,才能导致细胞凋
亡 。因此 , Caspase被认为是细胞凋亡的核心执行者
即凋亡的共同通路〔7〕 ,而下游效应因子 Caspase-3的
活化是众多刺激因素诱导细胞凋亡的共同环节〔8〕 ,
其最主要的底物是多聚聚合酶(PARP),该酶参与
DNA修复 、监护基因的完整性 。正常情况下 ,细胞质
中的 Caspase-3无活性 , 以酶原形式存在 , 一旦
Caspase被激活 ,就会剪切并激活效应 Caspase-3,后
者可使 PARP剪切成两个片段 ,使之不能发挥正常
功能 ,进而增高核酸内切酶活性 ,裂解核小体内的
DNA,引起细胞凋亡 。同时 Caspase-3还参与剪切
U1-70K、DNA依赖性激酶 、蛋白激酶 C,增强它们的
活性 ,从而引起细胞凋亡 〔9〕。Survivin是一种新近发
现的结构独特的凋亡蛋白抑制剂家族(IAPs)成员 ,
主要表达于胎儿组织 ,同时高表达于绝大多数肿瘤
组织和转化细胞 ,而在终末分化成熟的正常成人组
织中无表达 ,其参与肿瘤的发生发展过程 ,是一个有
潜在价值的肿瘤标志物 ,与肿瘤诊断 、预后均密切相
关 〔10-11〕。Survivin基因抑制细胞凋亡过程:一方面 ,
其可以抑制 Caspase-3和 Caspase-7的活性 〔12〕 , 阻断
细胞的凋亡过程;另一方面 , Survivin又可通过 p21
间接抑制 Caspase-3激活 〔13〕。当 Caspase-3的活性受
到抑制时 ,就会引起细胞凋亡障碍 ,使细胞凋亡与增
殖之间动态平衡失调 ,并可能进一步导致肿瘤的发
生及发展。
本研究结果显示 ,与空白对照组相比 , Tagalsin
高剂量治疗组和卡莫氟组 Survivin基因的表达降低 ,
而 Caspase-3基因表达升高。因此 ,我们推断 Tagal-
sin的抑瘤机制可能是通过下调 Survivin基因的表
达 ,从而上调了 Caspase-3基因的表达 ,进而促使肿
瘤细胞凋亡 ,达到抑制肿瘤的作用。
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收稿日期:2010-06-02;修回日期:2010-07-20
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英文摘要内容可相对具体些(一般 400 ～ 500个实词),以适当增加英文信息量。英文摘要应包括文题 、作者姓名(汉语拼音 , 姓
氏字母均大写 , 名字首字母大写 , 双字名中间加连字符)、单位名称 、所在城市名 、邮政编码及国名。应列出全部作者姓名 ,如作
者工作单位不同 , 只列出第 1作者的工作单位 ,如有通信作者 ,则列出通信作者的工作单位 ,在通信作者姓名右上角加 “＊”, 同
时在通信作者的单位名称左上角加 “＊”。
本刊编辑部
751　　　　中国临床研究 2010年 9月第 23卷第 9期　ChineseJournalofClinicalResearch, September2010, Vo1.23, No.9