全 文 ：　第 20卷第 1期
2008年 1月
化 学 研 究 与 应 用ChemicalResearchandApplication Vol.20, No.1Jan., 2008 　
收稿日期:2007-04-17;修回日期:2007-07-07
基金项目:肇庆市科技局科技创新资助项目(203E501)
联系人简介:段志芳(1973-),女 ,博士 ,讲师 ,研究方向为天然产物化学。 Email:wdzhifang@yahoo.com.cn
文章编号:1004-1656(2008)01-0067-04
溪黄草总二萜提取工艺及抑制亚硝化反应的研究
段志芳 ,赖钧灼 ,陈庆华
(肇庆学院生物医药工程中心 , 广东　肇庆　 526061)
关键词:溪黄草;总二萜;提取;亚硝化;抑制作用
中图分类号:O629　　文献标识码:A
唇形科香茶菜属植物溪黄草(Rabdosiaserra
(Maxim.)Hara)具有清热祛湿 、凉血散瘀 、抗肿
瘤 、抗菌 、消炎及对肝脏的保护作用[ 1, 2] 。据文献
报道 ,溪黄草中的对映 -贝壳杉烷型二萜化合物 ,
是其具有抗癌作用的主要功效成分 [ 3-5] 。其结构
与冬凌草甲素极为相似 ,在同一波长处具有相似
的紫外吸收特征峰。由于目前获得溪黄草二萜类
化合物标准品的技术难度大 ,可以用冬凌草甲素
为标准品 ,采用紫外分光光度法对溪黄草提取物
总二萜含量进行测定 [ 6] 。
亚硝胺是最令人关注的一类化学致癌物 ,它
能引起肝脏等多种器官的恶性肿瘤。阻断亚硝胺
合成或清除亚硝胺的前体是预防癌症的一个有效
途径。本文以冬凌草甲素为标准品 ,采用正交试
验法确定了溪黄草总二萜的最佳提取工艺条件 ,
并通过对二甲基亚硝胺(NDMA)合成的阻断及对
亚硝酸钠的清除率的测定 ,研究该总二萜对亚硝
化反应的抑制作用 ,为充分利用溪黄草提供一定
的理论依据 。
1　实验部分
1.1　材料与仪器
溪黄草全草(Rabdosiasera(Maxim.)Hara)
购自广东肇庆市中药店(肇庆学院生物学系植物
教研室鉴定);冬凌草甲素标准品(陕西旭煌植物
科技发展有限公司);乙醇 、柠檬酸钠 、二甲胺 、α-
萘胺 、对氨基苯磺酸 、N-1-萘乙二胺盐酸盐等均
为国产分析纯。
UV-2550型紫外 -可见分光光度计(日本岛
津);RE-52AAA型旋转蒸发器;ZKJ-1型循环
水真空泵(上海嘉鹏科技有限公司);FA2004N电
子分析天平(上海精密科学仪器有限公司);电热
鼓风恒温干燥箱(上海讯能电热设备有限公司);
HH-4型数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公
司)。
1.2　溪黄草总二萜提取与含量测定
为了系统考察溪黄草总二萜的最佳提取条
件 ,根据文献 [ 6] ,选取乙醇浓度 、料液比 、水浴温
度 、提取时间作为主要因素 ,并根据本研究组所做
单因素试验结果 ,选用 L9(34)正交表(见表 1)进
行正交试验 ,以总二萜含量作为考察指标 ,确定最
佳提取条件。
溪黄草总二萜提取:准确称取 1.00g溪黄草
粉末于 50mL三角烧瓶中 ,按要求加入一定浓度的
乙醇 ,在一定温度下常规提取一定时间 ,趁热减压
抽滤 ,加 95%乙醇定容于 50mL容量瓶中作为待
测液 。
溪黄草总二萜含量测定:标准品溶液的制备 、
测定波长的选择以及标准曲线的绘制参考文
献[ 6] ,实验结果见图 1和图 2。从图 1可确定测试
波长为 237nm;从图 2中可看出在 5.50mg/L～
55.00 mg/L浓度范围内吸光度与浓度呈良好的线
形关系 ,回归方程为:A=0.026 C+0.0045, R2 =
0.9995。精密取 0.1mL各待测液用 95%乙醇稀释
定容至 50mL,在 237nm波长测定该溶液的吸光
度 ,由标准曲线得出溶液中总二萜浓度 ,并计算总
二萜提取率。
化 学 研 究 与 应 用 第 20卷
图 1　标准品溶液紫外 -可见光谱图
Fig.1　UV-Visresultofthestandardsoluble
图 2　标准曲线图
Fig.2　Thestandardcurve
1.3　溪黄草总二萜分离
取溪黄草粉末 100g,按最佳提取条件对其总
二萜进行提取 ,提取 2次 ,提取液减压浓缩后 ,用
CH2Cl2 -H2O萃取 ,减压浓缩萃取液 ,用石油醚沉
淀 ,真空干燥沉淀 ,进行紫外光谱和薄层层析法检
测 [ 7] 。紫外光谱结果表明自制的样品在 237nm处
有一强吸收峰 ,与冬凌草甲素标准品的特征吸收
峰基本一致。结合薄层层析和颜色反应 ,表明所
得固体即为溪黄草总二萜 。
1.4溪黄草总二萜阻断亚硝胺合成的试验 [ 8]
分别取不同浓度溪黄草总二萜的 95%乙醇溶
液 1.0mL于 25mL容量瓶中 ,加入 pH=3.0的柠
檬酸钠 -柠檬酸缓冲液 10mL, 1mmol/LNaNO2溶
液 1mL, 1mmol/L二甲胺溶液 1mL,用蒸馏水定容
至刻度 , 在 37℃下恒温 1h。吸取 1.0mL上述
NDMA的反应液至 6cm2的培养皿中 ,加入 0.5%
Na2CO3溶液 0.5mL,于黑布遮盖的紫外分析仪上
照 15min,紫外灯离液面 15cm,取出后加 1%对氨
基苯磺酸溶液 1.5mL, 再加 0.1% 的 α-萘胺
1.5mL,加蒸馏水精确为 5.0mL, 然后摇匀放置
15min,在 525nm处测吸光度值 (Ax)。同时用
95%乙醇做空白实验测吸光度值(A0), 计算阻
断率。
阻断率 =(A0 -Ax)/A0 ×100%
1.5　溪黄草总二萜清除 NaNO2的试验 [ 8]
分别取不同浓度溪黄草总二萜的 95%乙醇溶
液 1.0mL于 25mL容量瓶中 ,加入 10mLpH=3.0
的柠檬酸钠 -盐酸缓冲液 , 25μg/mL的 NaNO2溶
液 2mL,用蒸馏水定容至刻度 , 37℃恒温 1h,然后
各吸取 1mL反应液于 6cm2培养皿中 ,加入 0.4%
的对氨基苯磺酸溶液 2mL, 0.2% N-1 -萘乙二
胺盐酸盐溶液 2mL,摇匀放置 15min后 ,用分光光
度计在 540nm处测吸光度值(Ax),同时用 95%乙
醇做空白实验测吸光度值(A0),计算清除率 。
清除率 =(A0 -Ax)/A0 ×100%
2　结果与讨论
2.1　溪黄草总二萜最佳提取条件的确定
表 1　正交试验设计及结果
Table1　Resultsoforthogonaldesign
试验
号
因 素
乙醇浓度
(%)
A
料液比
(g/mL)
B
回流温度
(℃)
C
提取时间
(h)
D
总二萜
含量
(%)
1 60 1∶4 60 1 2.08
2 60 1∶6 70 1.5 2.87
3 60 1∶8 80 2 3.49
4 80 1∶4 70 2 2.17
5 80 1∶6 80 1 2.26
6 80 1∶8 60 1.5 2.38
7 100 1∶4 80 1.5 1.39
8 100 1∶6 60 2 0.92
9 100 1∶8 70 1 1.27
K1 8.44 5.64 5.38 5.61K
2 6.80 6.05 6.31 6.64K3 3.58 7.13 7.14 6.58R 4.86 1.49 1.76 1.03
注∶每个试验号做三组 ,每组测三次 , 结果取平均值。
表 2　方差分析表
Table2　Thetableofvarianceanalysis
方差
来源 df SS S
2 F F0.05 F0.01
A 2 4.07 2.04 135.67＊＊ 4.46 8.65
B 2 0.39 0.20 13＊＊ 4.46 8.65
C 2 0.51 0.26 17＊＊ 4.46 8.65
D 2 0.22 0.11 7.3＊ 4.46 8.65
误差 8 0.03
总计 16 5.22
F0.05(2, 8)=4.46　F0.01 =8.65
从表 1极差大小可知 ,各因素对结果影响大
小的顺序为 A>C>B>D,即 A的影响最大 , D则
最小 。最佳提取因素组合为 A1B3C3D2 ,即采用料
液比 1:8,用 60%乙醇在 80℃下回流提取 1.5h所
68
第 1期 段志芳等:溪黄草总二萜提取工艺及抑制亚硝化反应的研究
得的溪黄草总二萜量最多。表 2进一步分析出四
种因素对结果影响的程度 ,可知 A、B、C影响极显
著 , D显著 。
2.2　提取次数的确定
按上述 A1B3C3D2方案进行提取次数的确定 ,
结果见表 3。由表中可知∶提取次数越多 ,总二萜
累计提取率就越高 ,但提高幅度显著降低 ,第 3次
总二萜提取率只有 0.14%,因而只需提取 2次 ,即
可将 99.6%的总二萜化合物从溪黄草中提取出来
(以索氏提取法所得总二萜含量 3.73%作为比较
标准 ,将其定为 100%,计算相对提取率 [ 6] )。
表 3　浸提次数试验
Table3　Theexperimentofextractionnumber
提取次数 1 2 3
总二萜含量% 3.59 0.14 0.0051
相对提取率% 96.25 3.75 0.14
累计提取率% 96.25 99.64 99.78
2.3　溪黄草总二萜对二甲基亚硝胺合成的阻断
在模拟人体胃液的条件下 ,二甲胺与亚硝酸
钠在 37 ℃条件下可适宜地生成二甲基亚硝胺∶
(CH3)2NH+NaNO2 +HCl※(CH3)2N-N=O
+NaCl+H2O
在紫外光照射下二甲基亚硝胺可分解成二甲
基仲胺和亚硝酸根∶
H2O +(CH3 )2N-N=O※ (CH3)2NH+2
+NO2 -
当往溪黄草总二萜中依次加入二甲胺与亚硝
酸钠时 ,溪黄草总二萜优先同亚硝酸钠作用 ,使得
二甲胺不能与亚硝酸钠反应 ,达到阻止亚硝胺生
成的目的。生成亚硝胺量少 ,溪黄草总二萜的阻
断能力就强 ,反之则弱 。不同浓度溪黄草总二萜
对二甲基亚硝胺合成阻断作用结果见图 3(为三次
测定平均值)。
图 3　溪黄草总二萜对亚硝胺合成的阻断率
Fig.3　Theblockingrateofditerpenoidsto
nitrosodimethylaminesynthesis
由图 3可见 ,随着溪黄草总二萜用量的增加 ,
其对二甲基亚硝胺的阻断率呈现出明显梯度变化 ,
当溪黄草总二萜浓度在 0.02mg/mL～ 1.4mg/mL
时 ,对二甲基亚硝胺的阻断率在 9.3% ～ 70.5%之
间。图中冬凌草甲素对亚硝胺的阻断也呈明显梯
度变化 ,其效果比溪黄草总二萜阻断亚硝胺反应作
用要明显。
2.4　溪黄草总二萜对 NaNO2的清除作用
亚硝酸盐在弱酸性的条件下 ,能与氨基苯磺
酸重氮化后 ,再与 N-1-萘乙二胺盐酸盐偶合生
成红色的化合物 ,测定红色化合物的变化可以反
映出提取物清除 NaNO2的能力的强弱。不同浓度
溪黄草总二萜对 NaNO2清除作用见图 4(为三次
测定平均值)。
图 4　溪黄草总二萜对亚硝酸钠的清除率
Fig.4　Theremovalrateofditerpenoidstosodiumnitrite
由图 4可见溪黄草总二萜对 NaNO2清除作用
具有明显的梯度变化 , 当溪黄草总二萜浓度在
0.02mg/mL～ 1.4mg/mL时 ,对 NaNO2 清除率在
7.5% ～ 63.0%之间 。图中冬凌草甲素对 NaNO2
清除也呈明显梯度变化 ,其效果比溪黄草总二萜
清除 NaNO2作用较明显。
3　结论
正交试验结果表明溪黄草总二萜的最佳提取
条件为:采用 1∶8的料液比 、60%的乙醇 ,在 80℃
提取 1.5h, 连续提取 2次 ,二萜类化合物的相对
提取率可达 99.6%。在体外模拟胃液的条件下 ,
溪黄草总二萜能有效地阻断亚硝胺的合成及清除
亚硝酸盐 。但在所研究浓度范围内 ,其抑制亚硝
化作用较冬凌草甲素略弱 ,具体原因有待于进一
步研究。目前关于中药溪黄草鉴定 、化学成分的
研究有一定报道 ,但制剂 、药理作用及临床方面研
69
化 学 研 究 与 应 用 第 20卷
究甚少 ,溪黄草总二萜防癌开发利用前景可观 ,可 作为一种经济 、有效的防癌新资源加以研究 。
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Studyontheextractionofditerpenoidsfrom
Rabdosiaserra(Maxim.)haraanditsinhibitiononnitrosation
DUANZhi-fang, LAIJun-zhuo, CHENQing-hua
(BiopharmaceuticalResearchandDevelopmentcenterofZhaoqingUniversity, Zhaoqing526061, China)
Abstract:Accordingtotheorthogonaldesign, theextractiontechnologyofditerpenoidsfromRabdosiaserra(Maxim.)Harawas
studied.TodeterminethecontentofditerpenoidsbyUV-spectrophotometry, oridoninwasusedasastandard.Theoptimum
extractionconditionsofditerpenoidsanditsinhibitiononnitrosationwereobtained.Theresultsshowedthatthe1:8 ratioof60%
ethanoltoRabdosiaserra(Maxim.)Haraweightwasusedfor1.5hat80℃ fortwotimesandtheaverageextractionratewasas
highas99.6%.Thediterpenoidshadremarkableinhibitiononnitrosationsuchasnitrosodimethylaminesynthesisandsodium
nitrite.
Keywords:Rabdosiaserra(Maxim.)Hara;diterpenoids;extraction;inhibition
(责任编辑　李　方)
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