全 文 ：收稿日期:2014-11-05; 修订日期:2015-04-13
基金项目:国家自然科学基金项目(No． 81260677);
云南省教育厅重点项目(No． 2012Z118);
云南省教育厅科研项目(No． KY1214206551)
作者简介:李水仙(1987-)，女(汉族)，云南昆明人，大理学院助教，硕士学
位，主要从事药用植物的种植资源评价工作．
* 通讯作者简介:夏从龙(1979-)，男(汉族)，云南大理人，大理学院教授，
硕士学位，主要从事生药的研究及开发工作．
正品青叶胆遗传多样性的 ISSＲ分析
李水仙1，陈丽元2，夏从龙2*
(1．大理学院基础医学院，云南 大理 671000; 2．大理学院药学与化学学院，云南 大理 671000)
摘要:目的 对青叶胆(Swertia mileensis)种质资源的遗传多样性进行研究。方法 采用 ISSＲ分子标记技术分析青叶胆的
遗传多样性。利用 NTSYS软件分析遗传距离及相似系数，UPGMA方法聚类，构建亲缘关系系统图。结果 从 30 个 ISSＲ
引物中筛选出 8 个用于多态性分析，8 条引物共检测到 82 个位点，其中 79 个位点具有多态性，占 96． 34%。遗传相似系
数变化范围 0． 3537 ～ 0． 9756。结论 聚类结果显示，来源于同一地区不同居群的青叶胆亲缘关系较近，并与其近缘种具
有显著差异。该实验从分子水平为青叶胆及其近缘种药用植物的鉴定和开发提供了遗传基础。
关键词:青叶胆; 遗传多样性; 分子水平; 简单重复序列区间分析
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 07． 087
中图分类号:S567 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)07-1748-02
Analysis of genetic diversity in certified Swertia mileensis by ISSＲ
LI Shui-xian1，CHEN Li-yuan2，XIA Cong-long2*
(1． Department of Basic Medical Sciences，Dai University，Dali 671000，China;2． College of Pharmacy，Dali
University，Dali 671000，China)
Abstract:Objective To investigate the genetic diversity for germplasm resources of Swertia mileensis． Methods The genetic di-
versity of Swertia mileensis was analyzed by ISSＲ molecular markers． To make up the systematic diagram of genetic relationship by
NTSYS software，cluster by UPGMA method，and establish the dendrogram． Ｒesults Eight ISSＲ primers were selected respec-
tively from 30 ISSＲ primers． Eight primers produced 82 sites，among which 79 were polymorphic sites． The average percentage of
polymorphic bands was 96． 34% ． Genetic similarity coefficient changed from 0． 3537 to 0． 9756． Conclusion By cluster analysis，
it shows that different populations of the medicinal plants in Swertia mileensis from the same region are in the same group and dem-
onstrates there are significant differences between its counterfeit species in the tested materials． This study will provide the founda-
tion for identification and development of medicinal plants in Swertia mileensis．
Key words:Swertia mileensis; Genetic similarity; Molecular level; ISSＲ analysis
龙胆科獐芽菜属植物青叶胆为 Swertia mileensis T． M． Host
W． L． Shih的干燥全草，又名弥勒獐芽菜、肝炎草、走胆药、青鱼
胆、小苦草等，为云南特有植物，具有清肝利胆、清热利湿的功效。
用于治疗黄疸型肝炎、慢性传染性肝炎、病毒性肝炎、泌尿系统感
染等，并作为治疗肝炎的特效药［1，2］被收载于 1974 年版《云南省
药品标准》及 1977 ～ 2010 版《中国药典》［3］。青叶胆的分布地域
十分有限，多年的过度采挖使得野生青叶胆面临濒危。因此，民
间出现多种混淆品，应用较为混乱。目前，对于青叶胆的研究主
要集中于化学成分及指标性成分的含量测定研究，对于其药材的
鉴定则多采用传统的生药学方法［4 ～ 6］，尚未见有关青叶胆遗传多
样性方面的研究报道。
简单重复序列区间(inter simple sequence repeat，ISSＲ)是 Zi-
etkiewicz等［7］于 1994 年提出的一种以 PCＲ 为基础的分子标记
技术，集 ＲAPD、SSＲ技术的优点于一身，具有简便、快速、重复性
强等特点，广泛应用于药用植物鉴定、近缘物种进化关系、中药质
量标准化和辅助育种等领域。本研究采用 ISSＲ分子标记对青叶
胆及其混淆品进行了遗传多样性分析，从分子水平为青叶胆及其
近缘种药用植物的鉴定和开发提供遗传基础。
1 材料与仪器
1． 1 材料与试剂 供试材料均为自采，由大理学院药学与化学
学院夏从龙教授鉴定，见表 1。选取生长健壮、无病虫害的健康
植株，采集当年萌发的幼嫩叶片，硅胶干燥后置于低温干燥处保
存备用。
表 1 样品来源表
序号 名称 拉丁名 来源
1 ～ 10 青叶胆 Swertia mileensis 云南省红河哈尼族彝族自治州弥勒县
11 ～ 12 紫红獐芽菜 Swertia punicea 云南省大理白族自治州
13 ～ 14 椭圆叶花锚 Halenia elliptica 云南省大理白族自治州
2 × mix(Tian Gen)，DNA Marker(Tian Gen) ，引物参照加拿大
哥伦比亚大学 UBC 公司 2006 年公布的 ISSＲ 引物序列，由上海
生工合成，其他试剂均为国产分析纯。
1． 2 仪器 Applied Biosystem 2720 型 PCＲ仪(美国应用生物系统
公司)，GBOX HＲ化学发光凝胶成像系统(英国 Syngene 公司)，
DYY － BC型电泳系统(北京市六一仪器厂)，离心机(德国 Ep-
pendorf)。
2 方法
2． 1 基因组 DNA提取 采用 CTAB法提取样品总 DNA。用 1%
琼脂糖凝胶电泳法检验 DNA质量，紫外分光光度计检测 DNA质
量浓度，稀释至 50 ng /μl备用。
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时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 7 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 7
2． 2 ISSＲ － PCＲ反应体系 在 Applied Biosystem 2720 型 PCＲ仪
上扩增，反应体系为 25 μl，包括:Mg2 + 2． 5 mmol /L，dNTP 0． 2
mmol /L，Taq DNA聚合酶 1． 0 U，引物 1． 0 μmol /L，DNA 模板 50
ng，10 × Buffer 2． 5 μl，超纯水补至 25 μl。扩增程序:94 ℃预变性
5 min，94 ℃变性 30 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，共循环 35
次，然后 72 ℃延伸 7 min，4 ℃保温。
2． 3 扩增产物的检测 将 PCＲ产物在含有溴化乙锭(EtBr)染料
染色的 1． 5%琼脂糖凝胶中电泳 1． 5 h，电泳结束后在凝胶成像
系统中照相保存。
2． 4 数据统计与分析 在同一引物、同一位点根据扩增产物有条
带的记为“1”、无条带记为“0”，得到二元资料，形成 0 /1 矩阵，用
POPGENE 1． 32 软件进行分析，计算 Nei＇s 遗传距离，采用 NTSYS
2． 10e软件进行聚类分析，构建聚类图。
3 结果
3． 1 引物筛选 从 30 条加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供的 IS-
SＲ引物序列进行筛选，从中筛选出 8 条扩增条带清晰、多态性
好，重复性好的引物，计算多态位点百分率(PPL)。结果见表 2。
表 2 用于 ISSＲ分析的 8 条引物及其扩增产物
引物 序列 退火温度 / ℃ 总带数 多态性带数 PPL /%
UBC807 (AG)8T 52． 2 12 12 100
UBC811 (GA)8C 51． 5 6 6 100
UBC825 (AC)8T 51． 9 8 8 100
UBC834 (AG)8YT 55． 1 15 15 100
UBC840 (GA)8YT 52． 7 12 12 100
UBC855 (AC)8YT 50． 7 12 12 100
UBC857 (AC)8YG 54． 4 15 14 93． 33
UBC873 (GACA)4 54． 4 11 10 90． 90
3． 2 ISSＲ － PCＲ扩增结果 用筛选出的 8 条引物对 14 份材料进
行扩增，共扩增出 82 条 DNA条带，其中多态性 DNA条带 79 条，
占总条带数的 96． 34%，每个引物扩增出的 DNA条带数为 6 ～ 15
条，平均为 10 条(表 2)，这些 DNA 片段大小主要集中在 300 ～
1500bp(图 1)。扩增条带数最多的是 UBC834 和 UBC857，达 15
条，扩增条带数最少的是 UBC811，为 6 条。其中 UBC857 和
UBC873 多态性百分比稍低，分别为 93． 33%和 90． 90%，其他引
物多态性百分比均为 100%，表明 ISSＲ 能够揭示材料间的多态
性，且经过标记谱带的分析，可用于鉴别本文供试品，为青叶胆
DNA指纹图谱的建立奠定基础。
3． 3 聚类分析 从聚类图中可以看出，在距离线约 0． 56 处，可将
供试的 14 份材料分成 3 大类(图 2)。第 1 类包括 1 ～ 10 号材料，
在距离线约 0． 84 处 1 ～ 8 号聚为一类，9 ～ 10 号聚为一类。第 2
类包括 11 ～ 12 号样品，第 3 类包括 13 ～ 14 号样品。根据遗传相
似性，2 号样品和 3、5 和 6 号样品的亲缘关系最近，遗传相似性
为 0． 9756;11 号和 3、4、5、6 号样品的亲缘关系最远，遗传相似性
为 0． 3537。
图 1 UBC807 引物扩增结果电泳图
图 2 基于 ISSＲ的 UPGMA聚类分析树系图
4 讨论
对所收集材料中存在的遗传多样性进行评估是有效地利用
和保护种质资源的关键环节，分子标记技术的发展将会对种质资
源的评价起到极大的推动作用。ISSＲ 标记具有程序简单、操作
快速、成本低等优点，因而已被广泛地应用于植物遗传多样性研
究中。本研究利用 8 条引物对 14 份材料进行扩增，共扩增出 82
条 DNA 条带，其中多态性 DNA 条带 79 条，占总条带数的
96． 34%，表现出较高的多态性，这种多态性将为青叶胆及其近缘
种药用植物种质资源的保存、鉴定、适应性评价以及生态型研究
奠定可靠、稳定的基因基础。
从聚类分析来看，来自红河州弥勒县的 10 个不同居群的青
叶胆材料聚在了一起，表明其遗传差异较小，亲缘关系较近。同
时，数据还表明青叶胆种群内部可见丰富的遗传多样性，这可能
是由于生境条件的改变使物种在长期适应环境的过程中发生了
不同物种性状间的交叉。从遗传学的角度来看，这种遗传多样性
意味着比较高的适应能力，蕴涵着较大的进化潜能以及比较丰富
的育种和遗传改良能力，这为今后的栽培育种提供了依据。另
外，本实验通过 ISSＲ － PCＲ扩增产生了较多的多态性谱带，利用
这些谱带可将青叶胆与其近缘种紫红獐芽菜和椭圆叶花锚从分
子水平上进行鉴别，为青叶胆 DNA指纹图谱的建立提供基础。
参考文献:
［1］ 国家药典委员会． 中国药典，一部［S］． 北京:化学工业出版社，
2005:136．
［2］ 汪纪武． 药用植物词典［M］． 天津:天津科学技术出版社，2005:
784．
［3］ 云南省药物研究所． 云南重要天然药物［M］．昆明:云南科技出版
社，2006:235．
［4］ 李旭山，江志勇，王福生，等． 青叶胆化学成分研究［J］． 中国中药
杂志，2008，33 (23):2780．
［5］ 徐 敏，张振秋． ＲP － HPLC法测定不同产地青叶胆中齐墩果酸的
含量［J］．辽宁中医杂志，2008，35 (1):110．
［6］ 杨天梅，李学芳，王 丽，等． 青叶胆及其混淆品的药材性状及显
微鉴别［J］．云南中医学院学报，2009，32 (1):12．
［7］ Zietkiewicz E，Ｒafalski A，Labuda D，et al． Genomic fingerprinting by
simple sequence repeat (SSＲ)－ anchored polymerase chain reaction
amplification［J］． Genomics，1994，20(2) :176．
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 7 时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 7 期