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牛耳枫果实中抑菌活性成分的初步分离



全 文 :农药学学报 2013,15(3) :261 - 266
Chinese Journal of Pesticide Science http:/ /www . nyxxb. com. cn
收稿日期:2012-12-06;修回日期:2013-01-04.
作者简介:李晶晶,女,瑶族,博士,讲师,主要从事天然产物及其生物活性方面的研究,E-mail:funnyazi@ 163. com;* 曾东强,通信作者
(Author for correspondence) ,男,博士,教授,主要从事天然源农药、昆虫毒理学研究,E-mail:zengdq550@ 163. com
基金项目:国家自然科学基金(31160375) ;广西大学科研基金(XBZ110380) ;桂林医学院科研启动基金(KY2012100) ;广西特聘专家岗位项目.
·研究论文·
牛耳枫果实中抑菌活性成分的初步分离
李晶晶1, 曾东强* 2
(1.桂林医学院 公共卫生学院,广西 桂林 541004;
2.广西大学 农药与环境毒理研究所,南宁 530005)
摘 要:为探索牛耳枫 Daphniphyllum calycinum在农业病害防治方面的应用前景,采用柱层析和重
结晶等分离技术,从牛耳枫果实甲醇提取物的乙酸乙酯萃取物中分离得到 10 个已知化合物,并以
水稻纹枯病菌 Rhizoctonia solani、番茄白绢病菌 Sclerotium rolfsii 和香蕉枯萎病菌 Fusarium
oxysporum f . sp. cubense 3 种植物病原菌为指示菌种,对化合物的抑菌活性成分进行了测定。经核
磁共振氢谱和碳谱解析,10 个化合物分别鉴定为:对甲氧基苯甲酸( 1) 、对羟基苯甲醛( 2) 、5,7-二
羟基色原酮( 3) 、对羟基苯甲酸( 4) 、反式对羟基肉桂酸( 5) 、5,7,4-三羟基-3-甲基黄酮( 6) 、山奈
酚( 7) 、β-胡萝卜苷( 8) 、木犀草素( 9) 和 3,4-二羟基苯甲酸( 10) 。菌丝生长速率法测定结果表明:
在 100 mg /L 下,化合物 3、6、7 和 10 对水稻纹枯病菌的抑制率分别为 58. 1%、74. 3%、85. 0%和
79. 5% ; 化合物 6 和 7 对番茄白绢病菌的抑制率分别为 66. 2%和 72. 5% ; 化合物 6 对香蕉枯萎病
菌的抑制率为 54. 5%。化合物 1 ~ 7 和 9 ~ 10 为首次从该植物的果实中分离得到。
关键词:牛耳枫; 活性成分;抑菌活性;分离
DOI: 10. 3969 / j. issn. 1008-7303. 2013. 03. 04
中图分类号:S482. 292 文献标志码:A 文章编号:1008-7303(2013)03-0261-06
Isolation of antifungal components from the fruit of
Daphniphyllum calycinum Benth
LI Jingjing1, ZENG Dongqiang* 2
(1. School of Public Health,Guilin Medical University,Guilin 541004,Guangxi,China;
2. Institute of Pesticide & Environmental Toxicology,Guangxi University,Nanning 530005,China)
Abstract:In order to explore the application prospects of Daphniphyllum calycinum in controlling
agricultural disease,ten compounds were isolated from acetic ether-soluble fraction of D. calycinum by
column chromatography and recrystallization,and three plant pathogens (Rhizoctonia solani,Sclerotium
rolfsii,Fusarium oxysporum f . sp. cubense)were used to screen antifungal activity of the compounds.
The structure of ten compounds were identified as p-methoxybenzoic acid (1) ,p-hydroxybenzaldehyde
(2) ,5 7-dihydroxychromone (3) ,p-hydroxybenzoic acid (4) ,trans-p-hydroxylcinnamic acid (5) ,5
7,4-trihydroxy-3-methoxyflavone (6) ,kaempferol (7) ,β-daucosterol (8) ,luteolin (9)and 3,4-
dihydroxybenzoic acid (10)by NMR. The antifungal activities of nine compounds against the three
plant pathogens were tested. At the concentration of 100 mg /L,compound 3,6,7 and 10 exhibited
农 药 学 学 报 Vol. 15
antifungal activity against R. solani,with inhibitory rates of 58. 1%,74. 3%,85. 0% and 79. 5%,
respectively;compound 6 and 7 showed potential antifungal activity against S. rolfsii,with inhibitory
rates of 66. 2% and 72. 5%,respectively;compound 6 had weak antifungal activity against F.
oxysporum,with inhibitory rate of 54. 5% . Compound 1 -7,9 - 10 were obtained from the fruit of D.
calycinum for the first time.
Key words:Daphniphyllum calycinum;bioactive constituents;antifungal activity;isolation
牛耳枫 Daphniphyllum calycinum Benth 为虎皮
楠科(Daphniphyllaceae)虎皮楠属的一种常绿灌木,
我国有 10 个种,广泛分布于广西、广东、福建、江西
等长江以南的省区[1]。牛耳枫是我国传统的民间
药材,主要用于治疗风湿骨痛、急性胃肠炎及感冒发
烧等病症[2–3]。目前对其农药活性的研究鲜有报
道,国 内 仅 见 牛 耳 枫 甲 醇 粗 提 物 对 褐 飞 虱
Nilaparvata lugens 和白背飞虱 Sogatella furcifera 具
有杀虫活性[4]、以及其生物碱成分对甜菜夜蛾
Spodotera exigua酚氧化酶具有抑制活性的报道[5],
尚未见有关其抑菌活性的报道。为了综合开发该植
物资源,寻找新的植物源杀菌剂,笔者研究了牛耳枫
果实甲醇粗提物及其萃取物对 3 种植物病原菌的抑
菌活性,对牛耳枫果实中的抑菌活性成分进行了系
统的分离和结构鉴定,共分离得到 10 个已知化合
物,并初步测定了其中 9 个化合物的抑菌活性。
1 材料和方法
1. 1 供试材料
1. 1. 1 植物 牛耳枫果实于 2007 年 8 月采自广西
十万大山地区,由广西林业勘探设计院钟业聪高级
工程师鉴定。
1. 1. 2 植物病原菌 水稻纹枯病菌 Rhizoctonia
solani Kuhn、番茄白绢病菌 Sclerotium rolfsii Sacc 和
香蕉枯萎病菌 Fusarium oxysporum f . sp. cubense
Snyder and Hansen,均由华南农业大学资源环境学
院病理系提供。
1. 1. 3 主要仪器和药剂 EYELA-1 型旋转蒸发仪
(日本 Tokyo Rikakikai公司) ;20L Laborate 4001 旋
转蒸发仪(德国 Heidolph 公司) ;101A-1E 型电热恒
温鼓风干燥箱(上海实验仪器有限公司) ;LRH-300-
GⅡ光照培养箱(广东省医疗器械厂) ;SW-CJ-1G
超净工作台(浙江苏州净化设备有限公司) ;ZF7 三
用紫外分析仪(巩义市予华仪器有限责任公司) ;
RY-LG 熔点仪(天津市新天光仪器公司) ;Bruker
AV-600 核磁共振仪(瑞士 Bruker公司)。
柱层析硅胶和 GF254硅胶板(青岛海洋化工
厂) ;Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶(Sweden 公司) ;
大孔吸附树脂 HP-20(日本三菱化工公司)。试剂均
为分析纯(广州化学试剂厂)。对照药剂多菌灵
(carbendazim)原药(含量 > 95%,由农业部农药检
定所提供)。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 化合物的提取与分离 将牛耳枫果实(10 kg)
于通风处阴干,粉碎过筛(孔径 1. 0 mm) ,于恒温鼓
风干燥箱中 60 ℃干燥 4 h。将干燥后的植物粉末放
入容器中,用是其体积 5 倍量的甲醇在室温下浸提,
72 h后过滤,收集滤液;共提取 3 次,合并滤液,用旋
转蒸发仪减压浓缩,得到甲醇粗提物。将其用去离
子水饱和悬浮,依次用石油醚、乙酸乙酯萃取、浓缩,
分别得到各溶剂萃取物和水层浸膏,分别进行生物
活性测定。
选取生物活性最好的乙酸乙酯萃取物进行柱层析
分离。先用适量甲醇溶解乙酸乙酯萃取物(250 g) ,
加 500 g 硅胶(100 ~160目)拌样,待溶剂挥发后将其
研磨成粉状加样于柱顶,依次用 V(氯仿)∶ V(甲醇)
=1∶ 0(2. 5 L)、98∶ 2(4. 0 L)、95∶ 5(4. 0 L)、90 ∶ 10
(4. 0 L)、80 ∶ 20(3. 0 L)、60 ∶ 40(3. 0 L)和 0 ∶ 1(4. 0 L)
进行梯度洗脱,收集馏分,通过薄层层析(TLC)检
测,合并 Rf 值相近的馏分,分别得到 A(16. 5 g)、B
(28. 6 g)、C(25. 8 g)、D(37. 8 g)、E(68. 6 g)、F
(46. 5 g)共 6 个馏分段。分别进行抑菌活性测定。
采用硅胶柱层析、大孔吸附树脂柱层析、葡聚糖
凝胶柱层析和溶剂重结晶等方法,分别对 A ~ F 馏
分段进一步分离,共得到 10 个化合物,分别为化合物
1(26. 5 mg)、2(20. 2 mg)、3(23. 5 mg)、4(35. 6 mg)、
5(22. 5 mg)、6(60. 5 mg)、7(46. 5 mg)、8(1. 2 g)、
9(32. 5 mg)和 10(16. 5 mg)。
1. 2. 2 化合物结构鉴定 通过核磁共振氢谱
(1H NMR,600 MHz)、碳谱(13 C NMR,150 MHz)
等图谱数据分析,并与相关文献报道的数据进行比
较,确定化合物的化学结构。
1. 2. 3 抑菌活性测定方法 采用菌丝生长速率
法[6–7]测定。将供试样品用丙酮溶解,用无菌水稀
262
No. 3 李晶晶等:牛耳枫果实中抑菌活性成分的初步分离
释并配制成所需浓度,与 PDA 培养基混合制成含药
平板。以丙酮为溶剂对照,每处理重复 3 次。打取
直径 5 mm 的供试菌饼,菌丝面向下接种于含药平
板上,于 25 ~ 27 ℃培养箱中恒温培养。采用十字交
叉法,分别于处理后 24 h测定水稻纹枯病菌和番茄
白绢病菌的菌落生长直径,72 h 测定香蕉枯萎病菌
的菌落生长直径,根据公式(1)、(2)计算菌丝生长
抑制率。
菌落生长直径 /mm =
菌落直径平均值 - 5. 0(菌饼直径) (1)
抑菌率 /% =
对照组菌落直径 - 处理组菌落直径
对照组菌落直径
× 100 (2)
对抑制率较高的化合物进行精密毒力测定。化
合物 6 按质量浓度分别为 150、75、37. 5、18. 75、
9. 375 mg /L 配制药液;化合物 7 对水稻纹枯病菌按
150、75、37. 5、18. 75、9. 375 mg /L、对番茄白绢病菌
按 200、100、50、25、12. 5 mg /L 配制药液。对照药
剂多菌灵对水稻纹枯病菌按 5、2. 5、1. 25、0. 625、
0. 312 5 mg /L、对番茄白绢病菌按 15、7. 5、3. 75、
1. 875、0. 937 5 mg /L 配制药液。用上述方法测定
各化合物的抑菌活性。将质量浓度转化为常用对
数,抑菌率转化为几率值,建立毒力回归方程(Y =
a + bx) ,分别求出化合物对 2 种植物病原菌的毒力
(EC50及 95%置信限)。
2 结果与分析
2. 1 甲醇粗提物及萃取物的抑菌活性
测定结果(表 1)表明:牛耳枫果实甲醇提取物
的乙酸乙酯萃取物具有较好的抑菌活性,在
2 mg /mL下,其对水稻纹枯病菌、番茄白绢病菌和
香蕉枯萎病菌的抑制率分别为 100. 0%、66. 4%和
84. 5%;而在相同浓度下,其甲醇粗提物、石油醚萃
取物和水层浸膏对 3 种病原菌的抑制率仅在 8% ~
45%之间,说明牛耳枫果实的活性成分主要集中在
其甲醇提取物的乙酸乙酯萃取层。对乙酸乙酯萃取
物进一步分离得到的 6 个馏分段也均表现出一定的
抑菌活性(抑菌率在 20% ~80%之间)。
表 1 牛耳枫果实甲醇粗提物及萃取物对 3 种植物病原菌的抑菌活性
Table 1 Antifungal activities of the methanol extract and its solvent extracts from the fruit
of D. calycinum against three plant pathogens
样品1)
Samples
抑制率2) Inhibitory rates ± SE /%
水稻纹枯病菌(24 h)
R. solani
番茄白绢病(24 h)
S. rolfsii
香蕉枯萎病菌(72 h)
F. oxysporum
甲醇粗提物 Methanol extract 23. 7 ± 1. 23 b 25. 9 ± 1. 32 c 8. 5 ± 0. 60 c
石油醚萃取物 Petroleumether-soluble fraction 20. 2 ± 0. 83 c 28. 5 ± 0. 21 b 22. 1 ± 1. 08 b
乙酸乙酯萃取物 EtOAc-soluble fraction 100 ± 0. 00 a 66. 4 ± 0. 79 a 84. 5 ± 0. 90 a
水层浸膏 H2O-soluble fraction 13. 9 ± 1. 05 d 18. 9 ± 1. 52 d 5. 3 ± 2. 68 d
1)质量浓度为 2 mg /mL;2)表中数据为 3 次重复的平均值 ±标准误,同列数据后字母相同者表示在 5%水平上差异不显著(DMRT)。
1)The concentration of each sample is 2 mg /mL;2)The data (mean ± SE)in the same column followed by same letters are not significantly
different at 5% level according to Duncans test.
2. 2 化合物的结构鉴定
化合物 1:无色针状晶体(石油醚 /丙酮) ,分子
式为 C8H8O3,其
1H NMR 和 13C NMR 数据与文献
[8]中数据基本一致,确定其为对甲氧基苯甲酸。
化合物 2:无色针状晶体(丙酮) ,分子式为
C7H6O2,其
1H NMR和 13C NMR数据与文献[9]一
致,确定其为对羟基苯甲醛。
化合物 3:黄色针状晶体(丙酮) ,分子式为
C9H6O4,其
1H NMR 和 13C NMR 数据与文献[10]
中数据一致,确定其为 5,7-二羟基色原酮。
化合物 4:无色针状晶体(丙酮) ,分子式为
C7H6O3,其
1H NMR数据与文献[11]中数据比较,
并通过 TLC 与对羟基苯甲酸标准品进行比较,其 R f
值一致,通过与标准品混合后测定其熔点,发现熔点
无下降,故确定其为对羟基苯甲酸。
化合物 5:无色羽毛状晶体(丙酮) ,分子式为
C9H8O2,其
1H NMR 和 13C NMR 数据与文献[12]
一致,确定其为反式对羟基肉桂酸。
化合物 6:黄色无定形粉末(丙酮) ,分子式为
C16H12 O6,其
1H NMR 和 13C NMR 数据与文献
[13]基本一致,鉴定其为 5,7,4-三羟基-3-甲氧基
黄酮。
化合物 7:黄色无定形粉末(丙酮) ,分子式为
C15H10 O6,其
1H NMR 和 13C NMR 数据与文献
[14]相符,故确定其为山柰酚。
化合物 8:白色粉末(氯仿 /甲醇) ,分子式为
362
农 药 学 学 报 Vol. 15
C35H60O6,将该化合物与 β-胡萝卜苷标准品进行
TLC 测定,其 Rf 值一致,且混合物熔点不下降,故
鉴定为 β-胡萝卜苷。
化合物 9:黄色无定形粉末(丙酮) ,分子式
C15H10O6,其
1H NMR和 13C NMR数据与文献[15]
相符,确定其为木犀草素。
化合物 10:无色针晶 (丙酮) ,分子式为
C7H6O4,其
1H NMR和 13C NMR 数据与文献[16]
一致,确定其为 3,4-二羟基苯甲酸。
化合物 1 ~ 10 的化学结构见 Scheme 1。
Scheme 1
2. 3 化合物的抑菌活性
除化合物 8(β-胡萝卜苷)因在丙酮、甲醇等溶
剂中的溶解性差而未能进行生物活性测定外,对其
余 9 个化合物进行了初步的抑菌活性测定。结果
(表 2)表明:在 100 mg /L 下,化合物 3、6、7 和 10 对
水稻纹枯病菌的抑制率分别为 58. 1%、74. 3%、
85. 0%和 79. 5%;化合物 6 和 7 对番茄白绢病菌的
抑制率分别为 66. 2%和 72. 5%;对香蕉枯萎病菌只
有化合物 6 的抑制率达 54. 5%,其余化合物的抑制
作用均较弱。
表 2 供试化合物对 3 种植物病原菌的抑菌活性
Table 2 Antifungal activities of tested compounds against three plant pathogens
化合物编号1)
Compounds No.
抑制率2) Inhibitory rates ± SE /%
水稻纹枯病菌(24 h)
R. solani
番茄白绢病菌(24 h)
S. rolfsii
香蕉枯萎病菌(72 h)
F. oxysporum
1 17. 0 ± 1. 73 g 47. 8 ± 3. 31 c 33. 2 ± 1. 24 b
2 - 12. 4 ± 1. 80 i 32. 5 ± 2. 80 d 25. 0 ± 0. 84 c
3 58. 1 ±1. 47 d 22. 5 ± 2. 41 e 21. 0 ± 1. 75 d
4 30. 4 ± 1. 50 f 23. 8 ± 1. 29 e 15. 1 ± 1. 29 e
5 47. 2 ± 1. 52 e 13. 7 ± 1. 37 f 11. 2 ± 0. 59 f
6 74. 3 ±1. 46 c 66. 2 ±1. 19 b 54. 5 ±1. 14 a
7 85. 0 ±1. 40 a 72. 5 ±1. 79 a 25. 9 ± 2. 41 c
9 2. 5 ± 0. 16 h 30. 9 ± 1. 42 d 20. 5 ± 2. 63 d
10 79. 5 ±1. 10 b 10. 2 ± 0. 40 g 5. 6 ± 1. 06 g
1)质量浓度为 100 mg /L;2)表中数据为 3 次重复的平均值 ±标准误,同列数据后字母相同者表示在 5%水平上差异不显著(DMRT)。
1)The concentration of each compound was 100 mg /L;2)The data (mean ± SE)in the same column followed by same letters are not significant
different at 5% level.
462
No. 3 李晶晶等:牛耳枫果实中抑菌活性成分的初步分离
鉴于化合物 6(5,7,4-三羟基-3-甲氧基黄酮)
和 7(山奈酚)表现出了较宽的抑菌谱和较好的抑菌
活性,对这 2 个化合物又进行了精密毒力测定(表
3)。结果表明,其抑菌活性均低于对照药剂多菌灵。
表 3 化合物 6 和 7 对水稻纹枯病菌和番茄白绢病菌 24 h 的抑菌毒力
Table 3 Toxicities of compound 6 and 7 against R. solani and S. rolfsii after treatment in 24 h
化合物编号
Compounds
No.
病原菌
Fung
毒力回归方程
Regression equation
EC50(95% CL)/
(mg /L)
相关系数
Correlation
coefficient
卡方值
X2 值
相对毒力指数
Index of relative
toxicity
6 水稻纹枯病菌 R. solani y = - 6. 478 2 + 5. 908 7 x 87. 61(69. 39 - 110. 63) 0. 978 9 6. 30* 25. 62
番茄白绢病菌 S. rolfsii y = - 3. 480 8 + 4. 080 1 x 119. 84(77. 19 - 186. 07) 0. 987 0 6. 45* 12. 34
7 水稻纹枯病菌 R. solani y = - 6. 987 4 + 6. 100 3 x 92. 27(74. 90 - 113. 66) 0. 987 0 5. 30* 26. 98
番茄白绢病菌 S. rolfsii y = - 4. 039 8 + 4. 156 2 x 149. 63(93. 26 - 240. 06) 0. 987 0 5. 40* 15. 41
多菌灵 水稻纹枯病菌 R. solani y = 1. 187 3 + 7. 140 6 x 3. 42(2. 67 - 4. 33) 0. 993 1 7. 20* 1
carbendazim 番茄白绢病菌 S. rolfsii y = - 4. 039 8 + 4. 156 2 x 9. 71(6. 46 - 14. 60) 0. 989 0 6. 16* 1
注:化合物 6 为 5,7,4-三羟基-3-甲氧基黄酮,化合物 7 为山柰酚。* P > 0. 05。
Note:Compound 6 is 5,7,4-trihydroxy-3-methoxyflavone,compound 7 is kaempferol. * P > 0. 05.
3 结论与讨论
目前,有关牛耳枫生物活性的研究主要集中在
其抗肿瘤细胞活性方面[17–20]。本研究首次以水稻
纹枯病菌、番茄白绢病菌和香蕉枯萎病菌 3 种植物
病原菌为指示菌种,对牛耳枫中的抑菌活性成分进
行了初步分离。从牛耳枫果实的乙酸乙酯萃取物中
分离得到 10 个已知化合物,除 β-胡萝卜苷外,其余
9 个化合物均为首次从该植物的果实中分离得到。
其中,5,7,4-三羟基-3-甲氧基黄酮(6)对 3 种供试
病原菌均具有较好的抑菌活性,山奈酚(7)对水稻
纹枯病菌和番茄白绢病菌表现出了较好的抑菌活
性,而 5,7-二羟基色原酮(3)和 3,4-二羟基苯甲酸
(10)对水稻纹枯病菌具有较好的抑菌活性。初步
研究结果表明,这 4 个化合物可能是牛耳枫果实中
主要的抑菌活性成分。
山奈酚是植物中较常见的一种黄酮类化合物。
已有研究表明,其对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆
菌、大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌等病原菌具有显
著的抑菌活性[21–22],但目前尚未见有关 5,7,4-三
羟基-3-甲氧基黄酮的生物活性、以及 5,7-二羟基
色原酮和 3,4-二羟基苯甲酸对植物病原菌抑菌活
性的报道。
本研究仅对牛耳枫果实石油醚提取物的乙酸乙
酯萃取物进行了初步分离,且仅选取 3 种植物病原
菌进行了初步的抑菌活性测定。牛耳枫中是否还存
在其他活性成分、以及其是否还具有其他抑菌活性
等,还有待进一步研究。
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( 责任编辑: 金淑惠)
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