全 文 ：ＲP-HPLC测定不同产地白蔹药材中没食子酸的含量
乐佳美1，2，熊筱娟2，毕宝宝3，陆文铨1*
(1．第二军医大学长征医院，上海 200003;2．宜春学院化学与生物工程学院，江西宜春 336000;3．河南大学化学化工学院，河南开封 475000)
摘要 ［目的］建立白蔹药材中没食子酸的 ＲP-HPLC含量测定方法，为白蔹药材的质量标准研究提供依据。［方法］采用 Dikma Diamon-
sil C18(250 ×4． 6 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈 － 0． 2%磷酸(3∶ 97)为流动相进行等度洗脱。流速为 1． 0 ml /min，柱温为 30 ℃，检测波长为
270 nm。［结果］没食子酸检测浓度在 3． 15 ～ 202 μg /ml 的范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系(Ｒ2 = 0． 999 9);平均回收率为
102． 8%，ＲSD为 1． 15%。［结论］该方法快速，重现性好，准确度高，操作简便，可用于白蔹药材的质量控制。
关键词 白蔹;没食子酸;反相高效液相色谱法;质量控制
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2015)04 －108 －03
Determination of Gallic Acid in Prepared Slices of Ampelopsis japonica by ＲP-HPLC
LE Jia-mei1，2，XIONG Xiao-juan2，BI Bao-bao3，LU Wen-quan1* (1． Changzheng Hospital，Second Military Medical University，
Shanghai 200003;2． College of Chemical and Biological Engineering，Yichun University，Yichun，Jiangxi 336000;3． School of Chemistry
and Chemical Engineering，Henan University，Kaifeng，Henan 475000)
Abstract ［Objective］To establish an ＲP-HPLC method for determination of gallic acid in Ampelopsis japonica． ［Method］The analysis was
carried out on an Dikma Diamonsil C18 column(250 × 4． 6 mm，5 μm)and the mobile phase was acetonitrile － 0． 2% phosophorie acid (3∶ 97)
at the flow rate of 1． 0 ml /min;the detection wavelength was 270 nm and the column temperature was 30 ℃ ． ［Ｒesult］The linear range for
gallic acid was 3． 15 － 202 μg /ml (Ｒ2 = 0． 999 9 )． The average recovery was 102． 8% (ＲSD = 1． 15% )． ［Conclusion］This method is
simple，rapid，accurate，and it can be used for the quality control of the prepared slices of Ampelopsis japonica．
Key words Ampelopsis japonica;Gallic acid;ＲP-HPLC;Quality control
基金项目 2015 版中国药典项目“白蔹药材质量标准研究”。
作者简介 乐佳美(1990 － ) ，女，江西抚州人，硕士研究生，研究方向:
天然药物活性成分与中药质量控制研究。* 通讯作者，副
主任药师，博士，硕士生导师，从事医院药学研究。
收稿日期 2014-12-15
白蔹(Ampelopsis japonica(Thunb·)Makino) ，葡萄科植
物，又名野葡萄秧、鹅抱蛋、白草等。据《中药大辞典》记载，
白蔹以块根入药，具有清热解毒、生肌止疼、消肿的功效，既
可内服，又可外敷，主要用于医治痈肿疮疡、烫伤、扭挫伤
等［1 －2］。临床广泛应用于治疗化脓性皮肤感染、细菌性痢疾
等疾病，疗效显著［3 －4］。现代研究表明白蔹中主要含有没食
子酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、芦荟大黄素、羽扇豆醇等
化合物，没食子酸为白蔹中抗菌、抗病毒的主要药效成分，且
其含量较高［5 －6］。目前在药典中，白蔹药材的质量标准只有
定性分析而无定量分析。为更好地控制白蔹生药材质量，更
好地利用白蔹生药资源和适应中药现代化的发展要求，该研
究基于 2015年版《中国药典》科研课题，采用定量研究白蔹
中没食子酸含量的高低来评价白敛生药材质量，以期为制定
白蔹药材的质量标准研究提供科学依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。白蔹干燥药材由第二军医大学附属长征
医院药材科提供，经第二军医大学长征医院陈万生教授鉴定
为白蔹 A． japonica。
1． 1． 2 主要仪器。Agilent 1260 HPLC系统(Agilent Technol-
ogies，美国)，包括 G1311A 四元泵、G1322A 真空脱气机、
G1329A自动进样器、G1316A 柱温箱和 G4212B DAD 检测
器，使用 Chem Station软件数据处理系统;BAS124S-CW万分
之一电子分析天平(Sartorius，德国);BP110S 十万分之一电
子分析天平(Sartorius，德国) ;XW-01定时可调速漩涡混合器
(上海医科大学仪器厂);KUDOS SK7200H超声波清洗器(上
海科导超声仪器有限公司) ;TDL-4A 低速离心机(上海菲恰
尔分析仪器有限公司) ;AG 22331 Humberg 超高速离心机
(Eppendorf，德国) ;Eppendorf Ｒesearch plus 可调量程移液器
(Eppendorf，德国)。
1． 1． 3 主要试剂。没食子酸对照品(中国药品生物制品检
定所提供，供含量测定用，批号 110831 － 201204) ;甲醇和乙
腈均为色谱纯试剂(Fisher Scientific，美国) ;甲酸和磷酸均为
色谱级试剂;水为超纯水。
1． 2 方法
1． 2． 1 对照品溶液的制备。精密称取没食子酸对照品适
量，加 50%甲醇溶液制成每 1 ml含 202 μg的溶液，即得。
1． 2． 2 供试品溶液的制备。取本品粉末(过四号筛)5 g，精
密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 50%甲醇 50 ml，密塞，称
定重量，超声处理 60 min后，放冷，再称定重量，用 50%甲醇
补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1． 2． 3 色谱分析条件。色谱柱 Dikma Diamonsil C18(250 ×4． 6
mm，5 μm)，柱号 99903;乙腈 －0． 2%磷酸(3∶ 97)为流动相;流
速 1． 0 ml /min，柱温 30 ℃，检测器为 DAD，波长为 270 nm。
1． 2． 4 方法学考察。
1． 2． 4． 1 系统适应性试验。分别吸取对照品溶液及供试品
溶液各 10 μl，在“1． 2． 3”色谱条件下，注入液相色谱仪进行
测定，记录色谱图，考察系统适应性。
1． 2． 4． 2 线性关系的考察。将没食子酸对照品贮备液用
50%甲醇稀释制成每 1 ml 含 202、101、50． 5、25． 25、12． 625、
6． 312 5、3． 156 25 μg的系列溶液，分别吸取 10 μl注入液相
色谱仪，记录色谱图，以进样浓度 X(μg /ml)为横坐标、峰面
责任编辑 黄小燕 责任校对 况玲玲安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2015，43(4):108 － 110
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2015.04.037
积 Y为纵坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。
1． 2． 4． 3 检测限和定量限的考察。将没食子酸对照品逐步
稀释后进样测定，以色谱图中信噪比(S /N)为 3 时的进样量
为最低检测限(LOD)，信噪比(S /N)为10时的进样量为最低
定量限(LOQ)。
1． 2． 4． 4 稳定性试验。取同一供试样品溶液，按“1． 2． 3”项
色谱分析条件分别于 0、4、8、12、24 h进样，进样量 10 μl，测
定峰面积积分值，计算 ＲSD。
1． 2． 4． 5 精密度试验。取按“1． 2． 1”方法制备的对照品溶
液重复进样 6次，计算峰面积的 ＲSD值。
1． 2． 4． 6 重复性试验。取同一批号的样品按“1． 2． 2”方法
制备供试品溶液 6份(样品批号为白蔹 02)，按“1． 2． 3”项下
色谱分析条件，进样量为 10 μl，测定峰面积，计算平均含量
和 ＲSD。
1． 2． 4． 7 加样回收试验。取同一批号已知含量的样品 6 份
(样品批号为白蔹 02)，精密加入分别与样品中没食子酸含
量相等的对照品，按“1． 2． 2”方法制备供试品溶液，再按
“1． 2． 3”项下色谱条件测定，进样量为 10 μl，测定峰面积，计
算平均回收率和 ＲSD。
1． 2． 5 样品的含量测定。按“1． 2． 2”方法分别精密称取 10
批不同产地的药材粉末配制成供试品溶液各 2 份，按
“1． 2． 4． 2”方法对样品进行含量测定，通过标准曲线计算不
同产地白蔹药材中没食子酸的含量。
2 结果与分析
2． 1 方法学考察
2． 1． 1 系统适应性试验。图 1 表明，在“1． 2． 4． 1”条件下，
样品谱图中没食子酸的保留时间为 14 min左右，与其他化学
成分能达到基线分离，其色谱峰与相邻色谱峰分离度良好
(与相邻峰的分离度均大于 1． 5)，符合高效液相色谱定量分
析的要求。理论塔板数以没食子酸计为 10 000以上。
注:1为没食子酸。
图 1 对照品溶液(a)和供试品溶液(b)的 HPLC色谱图
2． 1． 2 线性关系的考察。按“1． 2． 4． 2”方法操作，峰面积分
别为 5 674． 47、2 785． 17、1 372． 87、695． 40、342． 73、163． 00、
77． 10，以进样浓度 X(μg /ml)为横坐标、峰面积 Y为纵坐标
绘制标准曲线如图 2 所示，计算得线性回归方程为 Y =
28． 103X －22． 027(Ｒ2 = 0． 999 9)，表明没食子酸在 3． 15 ～202
μg /ml的范围内呈良好的线性关系。
图 2 标准曲线图
2． 1． 3 检测限和定量限的考察。按“1． 2． 4． 3”方法操作，结
果表明，没食子酸的检测限和定量限分别为 0． 002 2 和
0． 006 3 μg。
2． 1． 4 稳定性试验。按“1． 2． 4． 4”方法操作，计算得出峰面
积积分值的 ＲSD 为 0． 80%，表明没食子酸在 24 h 内比较
稳定。
2． 1． 5 精密度试验。按“1． 2． 4． 5”方法操作，计算得峰面积
的 ＲSD为 0． 20%，表明在此试验条件下精密度良好。
2． 1． 6 重复性试验。按“1． 2． 4． 6”方法操作，计算得平均含
量为 0． 027%，ＲSD为 2． 30%。表明该方法重复性良好。
2． 1． 7 加样回收试验。由表 1可见，平均回收率为102． 8%，
ＲSD为 1． 15%，表明该方法准确、可靠，可用于白蔹药材中没
食子酸的含量测定。
2． 2 含量测定 由表 2 可知，大部分产地的白蔹药材中没
食子酸含量为 0． 02% ～ 0． 03%，而产自湖北的白蔹药材(编
号 01)中的没食子酸含量明显比其他产地的高，为
0． 052 25%。
3 结论与讨论
3． 1 对照品纯度检查方法 采用 HPLC 等度洗脱，采用
DAD检测器检测，样品在 190 ～ 400 nm范围内，除样品峰外
均没有检测到其他峰，样品峰峰面积百分比达 100%;增加进
样量达到样品出现平头峰时，仍然未检测出其他色谱峰。样
品峰的峰纯度分析报告显示，峰纯度达 98%。对照品核磁共
振图谱显示没有其他杂质信号。
3． 2 色谱条件的选择
3． 2． 1 色谱柱的选择。该试验对以下3种型号的 C18柱进
90143 卷 4 期 乐佳美等 ＲP-HPLC测定不同产地白蔹药材中没食子酸的含量
表 1 回收率试验结果(n =6)
试验次数 样品量∥g 含没食子酸量∥mg 加入没食子酸量∥mg 测得总量∥mg 回收率∥% 平均回收率∥% ＲSD∥%
1 2． 500 1 0． 680 0 0． 680 0 1． 378 5 102． 73 102． 80 1． 15
2 2． 500 0 0． 680 0 0． 680 0 1． 378 4 102． 70
3 2． 500 1 0． 680 0 0． 680 0 1． 379 0 102． 79
4 2． 500 0 0． 680 0 0． 680 0 1． 388 1 104． 13
5 2． 500 0 0． 680 0 0． 680 0 1． 386 8 103． 94
6 2． 500 1 0． 680 0 0． 680 0 1． 363 4 100． 50
表 2 样品含量测定结果(n =2)
药材编号 提供单位 产地 没食子酸含量∥% 平均含量∥%
01 上海长征医院 湖北 0． 051 96 0． 052 53 0． 052 25
02 上海长征医院 甘肃 0． 027 33 0． 027 15 0． 027 24
03 上海长征医院 甘肃 0． 033 64 0． 033 62 0． 033 63
04 上海长征医院 湖北 0． 024 90 0． 024 31 0． 024 61
05 上海长征医院 湖北 0． 024 30 0． 024 50 0． 024 40
06 上海长征医院 湖南 0． 022 30 0． 022 60 0． 022 45
07 上海长征医院 山西 0． 029 70 0． 029 85 0． 029 77
08 上海长征医院 四川 0． 020 65 0． 020 49 0． 020 57
09 上海长征医院 湖南 0． 029 41 0． 029 84 0． 029 63
10 上海长征医院 湖南 0． 028 50 0． 028 42 0． 028 45
行考察:Grace Smart ＲP18 (250 × 4． 6 mm，5 μm) ，柱号
0170301737;Agilent C18(250 ×4． 6 mm，5 μm)，柱号 880975 －
902;Dikma Diamonsil C18(250 × 4． 6 mm，5 μm)，柱号 99903。
结果表明三者均能较好地分离没食子酸且峰形较好，出于成
本考虑，选用 Dikma Diamonsil C18(250 ×4． 6 mm，5 μm)。
3． 2． 2 柱温的选择。考察了不同柱温(25、30、35 ℃)对分离
效果的影响，结果表明柱温对分离效果的影响不大，在合适
的流动相条件下，没食子酸峰均能与其他峰达到基线分离，
但考虑到其可操作性，在此选用 30 ℃。
3． 2． 3 流动相的选择。选择了乙腈 －0． 2% 甲酸、乙腈
－0． 2%磷酸 2种流动相系统进行测定试验，结果表明，在 2
种流动相系统条件下没食子酸的分离效果差异不大，但乙腈
－0． 2%磷酸条件下峰形更好，因此最后选择了乙腈 － 0． 2%
磷酸(3∶ 97)作为流动相，且每次分析结束时加强对色谱柱
和液相系统的冲洗和维护。
3． 2． 4 检测波长的选择。取没食子酸对照品的甲醇溶液，
用 DAD全波长扫描，在 220、273 nm波长处有最大吸收。该
试验按照《中国药典》2010年版一部附录ⅤA［7］的有关规定，
先检查了所使用的乙腈溶剂在供试品测定所用波长附近是
符合要求的，结合其他相关文献［8 －9］，选择 270 nm 为测定
波长。
因此该试验采用了“1． 2． 3”项下色谱条件。
3． 3 供试品溶液制备方法的选择
3． 3． 1 提取方法的选择。采用 2种不同的提取方法(超声、
加热回流)提取白蔹中的没食子酸，结果发现，2 种方法提取
的没食子酸含量分别为 0． 173 4、0． 169 1 mg /g，表明超声法
提取效果略优于加热回流提取法，操作简单，故选用超声法。
3． 3． 2 提取溶剂的选择。选用了不同溶剂(20%甲醇、40%
甲醇、50%甲醇、60%甲醇、80%甲醇)进行超声提取，结果表
明，没食子酸含量分别为 0． 132 8、0． 142 8、0． 173 3、0． 157 3、
0． 135 3 mg /g，表明用 50%甲醇作为提取溶剂的提取效果略
优于其他溶剂，故选用 50%甲醇作为提取溶剂。
3． 3． 3 提取药液比的选择。选用不同提取药液比
(1∶ 10、1∶ 25、1∶ 50、1∶ 80、1∶ 100)进行超声提取，结果发现没食
子酸含量分别为 0． 229 0、0． 159 8、0． 151 9、0． 158 4、0． 148 0
mg /g，表明提取药液比为 1∶ 10时没食子酸含量最高，提取效
果最好，故采用提取药液比为 1∶ 10。
3． 3． 4 提取时间的选择。分别考察超声时间(20、30、40、60、
90 min)对没食子酸的提取效果的影响，结果发现没食子酸
含量分别为0． 128 4、0． 143 3、0． 146 6、0． 147 1、0． 134 7 mg /g，
表明超声 60 min时提取效果略优于其他时间，故采用超声提
取 60 min。
因此该试验采用了“1． 2． 2”项下供试品溶液制备方法。
3． 4 小结 根据 10批不同产地样品的测定结果，建议本品
(按干燥品计算)含没食子酸(C7H6O5)不得少于 0． 02%。采
用 HPLC法，以没食子酸为指标性成分，可有效地控制白蔹
药材的质量，且该方法重复性好，操作简便、灵敏、准确，为进
一步制定白蔹药材的质量标准提供了科学依据。
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011 安徽农业科学 2015年