全 文 ：江西农业大学学报　2010, 32(6):1184-1190 htp://xuebao.jxau.edu.cn
ActaAgriculturaeUniversitatisJiangxiensis E-mail:ndxb7775@sina.com
全缘冬青及其变型变种
亲缘关系 RAPD和 AFLP分析
章建红1 ,陈黎君 2 ,张　斌 3 ,王正加 4＊
　　(1.浙江省宁波市农业科学研究院 林业研究所 , 浙江 宁波 315040;2.浙江省三门县林业特产局 , 浙江 三门
317111;3.浙江省海盐县农业经济局 林特花卉站 , 浙江 海盐 314300;4.浙江农林大学 ,浙江 临安 3113003)
摘要:采用 RAPD和 AFLP技术对 8个全缘冬青及其变型变种基因组进行扩增 ,以研究其物种间亲缘关系及遗
传多样性。结果表明:在 RAPD分析中 , 20条引物共扩增出 187条多态性条带 ,多态率为 60.75%。在 AFLP分
析中 , 10对选择性引物组合共扩增出 350条谱带 , 其中 268条具有多态性 , 占 76.57%。综合 RAPD和 AFLP技
术的聚类结果 , “小叶枸骨叶”全缘冬青和 “小叶密节”全缘冬青亲缘关系较近 ,全缘冬青和全缘冬青 “卵叶密
节”亲缘关系最近。这为冬青属植物的杂交育种与种质创新提供理论依据。
关键词:全缘冬青;RAPD;AFLP;亲缘关系
中图分类号:S718.46　　文献标志码:A　　文章编号:1000-2286(2010)06-1184-07
AFLPandRAPDAnalysisforGeneticRelationship
ofIlexintegraThunb.andItsFormaandVarieties
ZHANGJian-hong1 , CHENLi-jun2 , ZHANGBin3 , WANGZheng-jia4＊
　(1.NingboAgricultureScienceAcademy, Ningbo315040 , China;2.SanmenForestrySpecialtyBureauof
Zhejiang, Sanmen317111, China;3ForestPeculiarandFlowerStation, BureauofAgriculturalEconomicsof
Haiyan, Haiyan314300, China;4.ZhejiangAgricultureandForestryUniversity, Lin an311300, China)
　　Abstract:RAPDandAFLPtechniqueswereusedtoamplifythegenomicDNAof8 IlexintegraThunb.
speciesanditsformaandvarietiestostudythegeneticrelationshipandspeciesgeneticdiversity.Theresults
showedthat187polymorphicbandswiththepolymorphismrateat60.75%wereobtainedusing20primersby
RAPDanalysis.Richpolymorphicbandswereamplifiedbothfrom10selectiveAFLPprimerpairsinAFLPa-
nalysisand350bandswereobtained, ofwhich268(76.57%)werepolymorphic.Integratingtheclusterre-
sultsofRAPDandAFLPtechniques, itwasfoundthat`Xiaoyegouguye Ilexintegraand`xiaoyemijie Ilex
integrahadthenearestrelationship, Ilexintegraand`Luanyemijie Ilexintegrahadanearrelationship.This
resultsprovidetheoreticalbasisforcrossbreedingandgermplasmenhancementofIlexL.treespecies.
Keywords:Ilexintegra;RAPD;AFLP;geneticdiversity
我国大陆海岸线长达 1.8万 km,北起辽宁鸭绿江口 ,南至广西北仑河口 。由于陆海交替 、气候多
变 ,导致台风暴雨 、风沙海雾等自然灾害频繁发生。沿海基干林带建设是保障沿海生态安全 ,有效抵御
收稿日期:2010-06-22　　修回日期:2010-09-14
基金项目:浙江省科技厅重大项目(2007C12023)和宁波市农业与社会发展攻关项目(2006C100003)
作者简介:章建红(1976-), 男 ,主要从事林木种苗与园林植物研究 , E-mail:nbjianhong@163.com;＊通讯作者:王
　　　　　　 正加 ,副教授 , E-mail:wzhj21@163.com。
DOI :10.13836/j.j jau.2010206
第 6期 章建红等:全缘冬青及其变型变种亲缘关系 RAPD和 AFLP分析
自然灾害的首要屏障 。由于沿海自然环境恶劣 ,给沿海防护林营造带来严重的困难 ,优良乡土滨海造林
树种的选育是沿海防护林体系建设工程的首要问题 [ 1] 。全缘冬青(IlexintegraThunb.)系冬青属常绿乔
木 ,成熟时红果绿叶交相辉映 ,十分鲜艳悦目。主要分布于浙江省沿海的洞头 、临海 、象山 、定海 、普陀 、
岱山和福建沿海 ,日本 、朝鲜南部也有分布 。为海岛特有树种 ,被列入浙江省级珍稀濒危植物 [ 2] 。由于
抗性强 、极耐干旱瘠薄和海风海浪侵袭 ,可在多石砾的面海山坡困难地造林 ,是浙江等沿海地区沿海防
护林建设优良的乡土树种 ,具有很高的开发价值。由于天然杂交 、基因突变和多种繁殖方法并存等因素
影响 ,在栽培驯化的过程中 ,全缘冬青产生了一定的变异 ,为研究 、开发 、利用全缘冬青优良基因资源提
供了丰富的原始材料 。本研究利用 RAPD和 AFLP技术对全缘冬青以及种下的 7个变型变种进行遗传
多样性分析 ,有助于揭示全缘冬青种下等级的系统分类与发育进化关系 ,为今后全缘冬青的种质创新工
作提供理论依据 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
2004年 ,在浙江舟山通过选择育种途径从 50余万株全缘冬青实生播种苗中选出以下一些变异材
料:“卵叶密节”、“槠叶 ”、“枸骨叶”、“厚叶 ”、“桂叶 ”、“小叶枸骨叶 ”、“小叶密节 ”。收集变异材料 ,在
宁波市农业科学研究院高新农业技术实验园区建立了育种资源圃 ,以枸骨 、全缘冬青为砧木 ,经多代嫁
接无性繁殖后 ,其株系间未出现分化 ,各材料生物学特征比较见表 1。 2009年采集全缘冬青以及 7个全
缘冬青变型变种的嫩叶 ,带回实验室后置于 -70 ℃低温保存备用于 RAPD和 AFLP分析。 RAPD和
AFLP所用试剂及 Marker(100 bpPlusDNALadder)均购于上海生物工程技术有限公司或者由其合成。
表 1　全缘冬青及其变异类型的形态特征对比
Tab.1　CompareofmorphologicalcharacteristicsbetweenIlexintegraandvariations
编号
No.
材料名称
Material
叶形
Leafshape
叶先端
Leafapex
叶缘
Leafmargin
叶片大小 /cm
Leafsize
叶脉
Vein
其它特征
Otherfeature
1
全缘冬青
IlexintegraThunb.
椭圆形至
卵圆形 短尾尖 全缘
长 3 ～ 5,宽 2 ～
3
具明显
边脉
2
“卵叶密节”全缘冬青
Ilexintegra`Luanyemijie 近卵圆形 急尖
全缘或偶见疏生
钝锯齿
长 3 ～ 5,
宽 2 ～ 3 节间紧密 ,节间距 3 ～ 7mm
3
“槠叶”全缘冬青
Ilexintegra`Chuye
矩圆形 ,
基部楔形
有 3 枚
钝刺齿
具 3 ～ 5对钝刺齿 ,
边缘平展
长 4 ～ 8 ,
宽 2 ～ 4 下凹明显 树干直立形明显 ,枝条粗壮
4
“枸骨叶”全缘冬青
Ilexintegra`Gouguye 矩圆形
3 枚 大
刺齿
有 3 ～ 4对硬针刺齿 ,
边缘皱褶
长 5 ～ ,
宽 2 ～ 4 叶正面深绿色 ,背面淡绿色
5
“厚叶”全缘冬青
Ilexintegra`Houye
椭圆形至
近卵形
钝尖 ,具
短刺 具短刺齿 4 ～ 6对
长 3 ～ 5,
宽 2 ～ 3
叶片肥厚 ,正面墨绿色 ,背
面深绿色
6
“桂叶”全缘冬青
Ilexintegra`Guiye
长矩圆形 ,
基部楔形
具 3 枚
短刺齿 全缘或疏生短刺齿
长 5 ～ 8,
宽 1.5 ～ 2.5 边脉明显
7
“小叶枸骨叶”全缘冬青
Ilexintegra`Xiaoyegouguoye
矩圆形 ,
基部楔形
有 3 枚
大刺齿
具 1 ～ 3对大刺齿 ,
边缘皱褶
长 2 ～ 4,
宽 1 ～ 2
8
“小叶密节”全缘冬青
Ilexintegra`Xiaoyemijie 卵圆形 急尖 全缘或疏生短刺齿
长 2 ～ 4,宽 1 ～
2
下凹明显 小枝节间紧密 ,节间距 4 ～
8mm,叶呈龟背状反卷
1.2　基因组 DNA提取
参照 TaiTH和 TankseyDD[ 5]以及顾红雅和瞿礼嘉等[ 6]的 CTAB法提取基因组 DNA。
1.3　RAPD扩增
从 400条 10个碱基的 RAPD引物(由上海生物工程技术有限公司合成)进行初筛 ,筛选出 20个反
应稳定 、扩增性强和重复性好的引物(表 3)用于最后的 PCR扩增。 RAPD扩增在 Perkin-Elmer9600
(PE9600)扩增仪上进行 ,每 20 μL反应体系中含 TemplaterDNA50 ng,引物 0.3μmol/L, Taq0.067 U/
μL, dNTP0.2mmol/L, Mg2 + 2.5 mmol/L, 10×Bufer2 μL(所有试剂均购自上海生物工程公司)。扩增
程序为:94 ℃预变性 300 s, 1个循环;94 ℃变性 30 s;38 ℃退火 30s;72 ℃延伸 90 s;38个循环;72℃
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　江 西 农 业 大 学 学 报 第 32卷
1-8实验样品材料编号名称见表 1。
1-8:Experimentalsamplenumbersthatarethesameasintable1.
图 1　引物 S173扩增产生的 RAPD谱带
Fig.1　MapsofRAPDproductsfromS173 primers
后延伸 420 s;4 ℃保温。扩增产物经质量分数为 1%琼脂糖凝胶电泳检测 ,于 VDS成像系统(Phama-
cia)中观察照相。
1.4　AFLP扩增
AFLP实验流程主要参照 Vos等 [ 7]方法 ,采用 EcoRⅠ和 MseⅠ双酶切 6 h,过夜连接 ,预扩增引物对
选用 E+A/M+C, 开始选用 25对 E/M组合进行扩增 ,最后选用其中多态性好 10对引物(表 2)用于
所有样品的扩增 。PCR产物用 6%的变性 PAGE胶电泳检测 ,电泳缓冲液为 1×TBE。电泳结束后用硝
酸银染色观察结果。银染方法参考刘建斌等 [ 8 -10] 。
表 2　不同扩增引物与接头的序列
Tab.2　Nameandsequenceofdifferentamplificationprimersandadapters
引物名称
Primername
碱基序列
Basesequence(5′- 3′)
引物名称
Primername
碱基序列
Basesequence(5′-3′)
E+A GACTGCGTACCAATTCA M+C GATGAGTCCTGAGTAAC
EcoRⅠ adapter1 CTCGTAGACTGCGTACC MseⅠ adapter1 GACGATGAGTCCTGAG
EcoRⅠ adapter2 AATTGGTACGCAGTCTAC MseⅠ adapter2 TACTCAGGACTCAT
E+AGT GACTGCGTACCAATTCAAGT M+AGC GATGAGTCCTGAGTAACAGC
E+CCA GACTGCGTACCAATTCACCA M+AGG GATGAGTCCTGAGTAACAGG
E+CTC GACTGCGTACCAATTCACTC M+AAT GATGAGTCCTGAGTAACAAT
E+CTT GACTGCGTACCAATTCACTT M+AGA GATGAGTCCTGAGTAACAGA
E+AGG GACTGCGTACCAATTCAAGG M+ATT GATGAGTCCTGAGTAACATT
E+CAT GACTGCGTACCAATTCACAT M+ACA GATGAGTCCTGAGTAACACA
E+CCC GACTGCGTACCAATTCACCC M+AAA GATGAGTCCTGAGTAACAAA
E+AGA GACTGCGTACCAATTCAAGA M+AGA GATGAGTCCTGAGTAACAGA
E+CTA GACTGCGTACCAATTCACTA M+ACC GATGAGTCCTGAGTAACACC
E+CGC GACTGCGTACCAATTCACGC M+AAG GATGAGTCCTGAGTAACAAG
1.5　数据分析
只选清晰可辨的电泳条带 ,以 l和 0分别记录条带的有无 。数据用 NTSYS-PCV2.10.E软件计算
出遗传相似性系数(Geneticsimilarity, Gs), 遗传距离(geneticdistance, GD)GD=1-GS, UPGMA法进
行聚类分析构建聚类图。
2　结果与分析
2.1　全缘冬青及其变型变种
的 RAPD多态性分析
20对引物共检测扩增出
了 187条 DNA条带 ,条带位点
范围在 400 ～ 3 000 bp,表 3列
出了 20个引物扩增的谱带数 、
多态带 。其中扩增带数最多的
引物是 S48,共 12条;最少的是 8
条;平均每个引物扩增 9.35条
带 ,其中多态性条带为 5.65
条 ,多态性比例为 60.75%。
图 1为引物 S173扩增的结果。
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第 6期 章建红等:全缘冬青及其变型变种亲缘关系 RAPD和 AFLP分析
图 2　根据 RAPD相似系数构建的全缘冬青及其变种变型的树形图
Fig.2　Dendrogramof8speciesofIlexlistedintable1 basedonsimilaritycoeficient
表 3　20种不同 RAPD引物扩增结果
Tab.3　Amplificationresultsof20 RAPDprimers
引物
Primers
碱基序列(5′-3′)
Basesequence(5′-3′)
总扩增条带数
Totalamplifiedbands
多态性条带数
Polymorphicbands
多态率 /%
Percentageofpolymorphism
S48 GTGTGCCCCA 12 8 66.7
S68 TGGACCGGTG 11 6 54.5
S79 GTTGCCAGCC 10 6 60.0
S82 GGCACTGAGG 8 6 75.0
S84 AGCGTGTCTG 8 5 62.5
S96 AGCGTCCTCC 9 6 66.7
S105 AGTCGTCCCC 11 5 45.5
S112 ACGCGCATGT 10 5 50.0
S115 AATGGCGCAG 8 4 50.0
S153 CCCGATTCGG 9 6 66.7
S173 CTGGGGCTGA 9 7 77.8
S187 TCCGATGCTG 10 5 50.0
S234 AGATCCCGCC 9 6 66.7
S336 TCCCCATCAC 8 5 62.5
S337 CCTTCCCACT 10 6 60.0
S345 CTCCATGGGG 9 5 55.6
S354 CACCCGGATG 9 6 66.7
S366 CACCTTTCCC 8 5 62.5
S369 CCCTACCGAC 9 5 55.6
S375 CTCCTGCCAA 10 6 60.0
合计 Total 187 113
平均 Mean 9.35 5.65 60.75
2.2　全缘冬青及其变型变种的 RAPD聚类分析
统计软件分析 RAPD扩增结果 ,得到 8种全缘冬青植物间遗传距离矩阵(表 4),亲缘关系聚类图
(图 2)。结果显示:8种全缘冬青植物间 ,遗传距离最小为 0.124 5,存在于 “小叶枸骨叶 ”全缘冬青与
“小叶密节”全缘冬青之间 ,表明二者亲缘关系最近;遗传距离最大为 0.260 4,存在于全缘冬青和 “小叶
密节”全缘冬青之间 ,表明两者亲缘关系最远。总体来看 ,全缘冬青及其变型变种间的遗传距离都比较
近 。
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　江 西 农 业 大 学 学 报 第 32卷
M:分子量标准 , 1-8实验样品材料编号名称见表 1。
　　M:100 bpDNAmarker;1- 8:Experimentalsamplenumbers
　　thatarethesameasintable1.
图 3　E+CTT/M+AGA引物组合扩增结果
Fig.3　AmplificationresultsofE+CTT/M+AGAprimers
图 4　8种全缘冬青及其变型 、变种亲缘关系树状图
Fig.4　UPGMAdendrogramsgeneratedfromAFLPmarkers
表 4　遗传距离
Tab.4　Nei sgeneticdistance
1 2 3 4 5 6 7 8
1 1.000
2 0.166 8 1.000
3 0.223 1 0.178 4 1.000
4 0.208 0 0.211 0 0.127 3 1.000
5 0.244 7 0.205 0 0.196 1 0.152 5 1.000
6 0.226 2 0.217 1 0.196 1 0.158 2 0.146 9 1.000
7 0.254 1 0.214 0 0.241 6 0.184 3 0.190 2 0.202 0 1.000
8 0.260 4 0.251 0 0.247 8 0.232 3 0.190 2 0.202 0 0.124 5 1.000
　　1-8实验样品材料编号名称见表 1。 1-8:Experimentalsamplenumbersthatarethesameasintable1.
2.3　全缘冬青及其变型变种的 AFLP多态
性及其聚类分析
利用 AFLP分子标记技术用 10对引物
对全缘冬青及其 7个变型 、变种进行扩增 ,共
获得 350条谱带 ,其中 268条具有多态性 ,占
76.57%。其中图 3表示引物对组合 E+
CTT/ M+AGA扩增的谱带情况。平均每对
引物扩增出谱带 35条 ,平均 26.8条具有多
态性(表 5)。各变型变种间特征条带明显 ,
表明其进化起源的特应关系。聚类分析结果
显示(图 4),全缘冬青及其变型 、变种间相似
系数均在 0.631 ～ 0.829(表 6),同为全缘冬
青的变型变种 , “卵叶密节 ”全缘冬青与全缘
冬青亲缘关系较近 , “小叶枸骨叶”全缘冬青
与 “小叶密节 ”全缘冬青亲缘关系较近 , “枸
骨叶”全缘冬青与 “厚叶”全缘冬青先聚在一
起 ,再依次与 “桂叶”全缘冬青和 “槠叶 ”全
缘冬青聚类 。全缘冬青及其变型 、变种间相
似系数普遍不高 ,这可能一定程度上反应了
其变种 、变型的进化程度。
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第 6期 章建红等:全缘冬青及其变型变种亲缘关系 RAPD和 AFLP分析
表 5　AFLP选择性扩增引物产生的条带多态性
Tab.5　AmplificationresultsofAFLPprimers
引物组合
Primercombination
总带数
Totalamplifiedbands
多态性带数
Polymorphicbands
多态性位点百分率 /%
Percentageofpolymorphicloci
E+AGT/M+AGC 28 22 78.57
E+CCA/ M+AGG 33 29 87.88
E+CTC/ M+AAT 21 19 90.48
E+CTT/M+AGA 31 24 77.42
E+AGG/M+ATT 26 16 61.54
E+CAT/ M+ACA 57 45 78.95
E+CCC/ M+AAA 26 20 76.92
E+AGA/M+AGA 64 49 76.56
E+CTA/M+ACC 39 24 61.54
E+CGC/ M+AAG 25 20 80.00
合计 Total 350 268
平均 Mean 35 26.8 76.57
表 6　根据 AFLP标记计算的相似系数
Tab.6　GeneticsimilaritybetweenspeciesonthebasisofAFLPmarkers
1 2 3 4 5 6 7 8
1 1.000
2 0.777 1.000
3 0.666 0.786 1.000
4 0.631 0.734 0.806 1.000
5 0.657 0.714 0.780 0.831 1.000
6 0.654 0.729 0.794 0.811 0.826 1.000
7 0.646 0.709 0.751 0.751 0.789 0.797 1.000
8 0.657 0.703 0.740 0.723 0.794 0.780 0.829 1.000
　　1-8实验样品材料编号名称见表 1。 1-8:Experimentalsamplenumbersthatarethesameasintable1.
3　讨　论
冬青属是冬青科植物中最为重要的属 ,存在着大量的天然变型 、变种 、杂交种 ,许多变种 、变型还是
园林彩叶绿化植物的资源 ,研究其物种间亲缘进化关系具有重要意义。全缘冬青为典型的岛屿特有植
物 ,具有抗风 、耐海雾 、耐干旱瘠薄等特性 ,适合于岩质海岸粗骨土地带的植被恢复 ,岛屿生境的特异性
及其与周围岛屿和陆地基因流的阻隔等会导致全缘冬青众多变型 、变种的形成 [ 12] 。传统的冬青属植物
的分类主要是以形态学特征为依据 , 分类研究过程中不同的学者有不同的看法 ,较为普遍采用的是
1949— 1950年胡秀英 [ 12]发表的中国冬青属(TheGenusIlexinChina)专论和 1983年中国科学院植物
研究所出版的《中国高等植物图鉴补编》第二册 。
本研究采用 RAPD和 AFLP对全缘冬青及其变型变种的亲缘关系和遗传多样性进行分析 ,两种标
记聚类结果基本一致 , 8个样品分成 3类:Ⅰ类包括全缘冬青和 “卵叶密节”全缘冬青 ,这两种类型形态
特征非常相似 ,只是在节间长短上具有明显区别 ,形态上为全缘中叶型的;Ⅱ类包括 “小叶枸骨叶 ”全缘
冬青和 “小叶密节 ”全缘冬青 ,形态上为小叶型的;Ⅲ类包括 “槠叶 ”全缘冬青 、“枸骨叶 ”全缘冬青 、“厚
叶 ”全缘冬青和 “桂叶 ”全缘冬青 ,形态上为大叶刺叶型的 。分子标记的 3个类组与表 1中的形态特征
按叶型大小和是否全缘来进行分类的结果相一致 。但两种标记的聚类结果也存在着差异 , RAPD聚类
结果显示 “槠叶”全缘冬青与 “枸骨叶 ”全缘冬青亲缘关系较近两者首先聚类 , “厚叶 ”全缘冬青与 “桂
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　江 西 农 业 大 学 学 报 第 32卷
叶 ”全缘冬青再聚类;而 AFLP的聚类结果显示 “枸骨叶 ”全缘冬青与 “厚叶 ”全缘冬青亲缘关系最近首
先聚类 ,再依次分别与 “桂叶”全缘冬青 , “槠叶 ”全缘冬青聚类 。综上所述 , RAPD和 AFLP两种分子标
记以及传统形态学分类所得数据虽然有所差别 ,但大类划分完全吻合 ,只是小类亲缘关系的聚类分析结
果有些差异 。不同分子标记手段的出入也属正常现象 , RAPD标记是随机引物扩增来检测基因组 DNA
的序列信息 ,而 AFLP是对限制性片段的选择性扩增来检测基因组 DNA的序列信息 , AFLP标记能提供
丰富的 DNA指纹 ,产生丰富的条带数 ,是获得多态性效率较高的分子标记 ,说明在检测遗传信息的多样
性上 , AFLP标记较优 ,故 AFLP标记在月季(Rosechinensis)[ 13] 、百合(Liliumditichum)[ 14] 、杜鹃(Rho-
doendroninsigne)[ 15] )、玉兰亚属[ 16]等的研究中得到应用 ,较适合于冬青属特别是种下等级的亲缘关系
的鉴定 ,而 RAPD较差 [ 17] 。两者在检测多态性的灵敏度上存在差异 ,加上本身材料均为种内变型变种 ,
亲缘关系较近本身差异并非很大 ,再者人为读取差异条带等因素都会导致不同分子标记结果的出入。
但总体而言 “小叶枸骨叶”全缘冬青和 “小叶密节 ”全缘冬青亲缘关系较近 ,全缘冬青和 “卵叶密节 ”全
缘冬青亲缘关系最近 ,为全缘冬青的推广应用与种质创新提供科学依据 。
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