全 文 ：湖北中医药大学学报
Journal of Hubei University of Chinese Medicine
2012 年 4 月第 14 卷第 2 期
April 2012，Vol. 14，No. 2
作者简介:张梦美(1986 －) ，女，湖北中医药大学 2009 级硕士研究生，研究方向:中药药效物质基础。
通讯作者:黄必胜(1964 －) ，男，湖北中医药大学教授，研究方向:中药资源及其品质研究，电子信箱:yxxcc1965@ 163． com。
白蔹抗肿瘤活性部位的筛选研究
张梦美1，叶晓川2，黄必胜2，刘焱文2
(1．湖北中医药大学 2009 级硕士研究生，湖北 武汉 430065;
2．湖北中医药大学中药资源与中药化学省级重点实验室，湖北 武汉 430061)
摘要:目的 分离筛选出白蔹抗肿瘤的活性部位，并初步探讨其作用机制。方法 采用溶剂法和硅胶柱层析法对
白蔹醇提物进行不同部位分离，运用四甲基偶氮唑盐(MTT)法对各部位进行体外抗肿瘤活性测定，Hochest /PI双染色
法观察白蔹活性提取物抑制细胞增殖的作用。结果 在 25 － 200 mg /L范围内，乙醚和乙酸乙酯部位及从乙酸乙酯部
位分离得到的 P2、P3 组分对人肝癌 HepG2 细胞的增殖有较强的抑制作用，且具有明显的浓度依赖性。结论 乙醚和
乙酸乙酯部位是白蔹抗肿瘤的活性部位，并能够引起 HepG2 细胞凋亡和死亡。
关键词:白蔹;抗肿瘤活性;甲荃二氮唑蓝;HepG2 细胞;细胞凋亡
中图分类号:R282. 5 文献标识码:A 文章编号:1008-987X(2012)02-0040-03
doi:10. 3969 / j. issn. 1008 － 987x. 2012. 02. 16
The Study of Effective Anti － tumor Activity Parts on Apoptosis
ZHANG Mengmei1，YE Xiaochuang2，HUANG Bisheng2，LIU Yanwen2
(1． Grade 2009 postgraduate Seudent of Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065;2． Provincial Key Laboratory of
Resiyrce abd Chemistry of Traditional Chinese Medicine ，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065)
Abstracts:Objective To separate and select anti － tumor activity site of Ampelopsis japonica Mak，and explore its machine processed．
Methods The anti － tumor activity of the different extracts and fractions were determined by MTT assay． The effects of active site on the ap-
optosis of HepG2 cells were studied by Hochest /PI staining． Results In the range of 25 － 200 mg /L，all of the ethylether and acetate posi-
tion，fractions P2 and P3，strongly inhibited cell proliferation of HepG2，and the suppression ratio was raised with increasing concentrations of
drug． Conclusion The ethylether and acetate positions are the effective anti － tumor parts from Ampelopsis japonica Mak，Which can kill and
induce apoptosis of HepG2 cells．
Key words:Ampelopsis japonica;anti － tumor activity;MTT;HepG2 cell;apoptosis
中药白蔹为葡萄科蛇葡萄属植物白蔹(Ampelopsis japonica
(Thumb．)Makino)的干燥块根，始载于《神农本草经》。其味
苦、辛，微寒，具有清热解毒、消痈散结、敛疮生肌等功效，用于治
疗痈疽发背，疔疮，瘰疬，烧烫伤等症。现代药理研究表明该药
具有抗菌、免疫调节、抑制毛发生长及抗肿瘤等作用［1 － 5］。有关
白蔹的临床应用及药理活性研究多集中在于抗菌作用方面，而
其抗肿瘤活性目前已逐步引起大家的关注。本研究考察白蔹
提取物各部位对人肝癌细胞株 HepG2 细胞的抑制作用，筛选出
抗肿瘤的活性部位并初步探讨其可能的作用机制，为进一步研
制开发新型抗肿瘤药提供科学依据。
1 材料
1． 1 药物
干燥白蔹，用 70%乙醇加热回流提取 3 次，每次 1. 5 h，提取
液减压浓缩，回收溶剂，得到醇提物浸膏，称重。将浸膏悬浮于水
中，根据极性依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得
到以上 4个部位及水溶液层共 5个部分，将各溶剂挥干，备用。
将以上萃取得到的乙酸乙酯部位采用硅胶柱色谱分离，用
不同极性溶剂洗脱得到 5 个组分(P1、P2、P3、P4 和 P5) ，备用。
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April 2012，Vol. 14，No. 2
湖北中医药大学学报
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1． 2 肿瘤细胞株
实验用人肝癌细胞 HepG2 细胞株(由华中科技大学生命科
学与技术学院提供)。
1． 3 试剂
RPMI － 1640 培养基(美国 Gibco 公司) ;新生牛血清(杭州
四季青公司) ;四甲基二氮唑蓝(MTT，北京拜尔迪生物公司分
装，Amresco 0793) ;二甲基亚砜(DMSO，博大泰克公司) ;0. 25%
胰蛋白酶(美国 Hyclone Lab公司)。
1． 4 仪器
318C型酶标仪(Microplate Reader) ;311 二氧化碳培养箱
(美国 ThermoForma公司) ;SW － CJ － 2G型超净工作台(名牌之
星) ;细胞培养瓶(加拿大 BIOFIL 公司) ;96 孔板(加拿大 BIO-
FIL公司) ;6 孔板(加拿大 BIOFIL 公司) ;倒置显微镜(德国
Leica) ;十万分之一电子天平(德国赛多利斯)。
2 方法
2． 1 MTT法检测细胞增殖抑制率
取对数生长期的 HepG2 细胞，在超净台内制备成 3 × 10
5 个
细胞 /mL的细胞悬液，接种于 96 孔板，每孔 100 μL。实验设对
照组、调零组、不同浓度的药物组，37℃、5% CO2 饱和湿度孵箱
内培养过夜，分别加入含药物或不含药物的培养液 100 μL，分
别培养 24、48、72 h，每孔加入MTT液(5 mg /mL)20 μL，培养 4 h
后，吸去培养液，每孔加入 150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振
荡 10 min，使结晶物充分溶解，最后在酶联免疫检测仪 490 nm
处测量各孔的吸光值 OD值。实验重复 3 次。按下列公式计算
细胞生长抑制率:
抑制率 =(1 －实验组 OD值 /阴性对照组 OD值)× 100%。
2． 2 Hochest /PI双染色荧光显微镜观测细胞凋亡
取对数生长期的细胞接种于 6 孔培养板中，6 － 18 h 后，加
入含 200 mg /L的乙酸乙酯部位，作用 24 h 后小心用 PBS 冲洗
一遍，每孔加入 1 mL PBS，加入 5 μL 的 1 g /L Hochest 33342，
37℃孵育 15 min 后，吸去孔内试剂，用 PBS 冲洗一遍，再加入
0. 1 g /L PI 50 μL，4℃避光反应 30 min，吸去培养液，用 PBS 洗
涤，置于荧光显微镜下，在紫外光下观察细胞的凋亡情况并照
相。实验重复 3 次。其中荧光显微镜下紫外光激发 Hoechst
33342 呈蓝色，蓝光激发 PI成红色。
3 结果
3． 1 不同极性部位对 HepG2 细胞增殖的抑制作用
研究结果显示，在 25 － 200 mg /L 范围内，白蔹乙醚和乙酸
乙酯部位对 HepG2 细胞的增殖有较强的抑制作用，石油醚、正
丁醇及水溶液部分则无明显作用。乙醚部位 24、48 和 72 h 的
IC50分别为 92． 87 、44． 68 和 36． 19 mg /L;乙酸乙酯部位的分别
为 38． 35、31． 64 和 21． 81 mg /L。两部位对 HepG2 细胞增殖抑
制率随着药物浓度的增加而增大，并且呈现明显的时间依赖
性。结果见表 1 － 3，图 1。
表 1 白蔹不同极性部位作用于 HepG2 细胞 24 h试验结果
浓度
(μg /mL)
抑制率(%)
石油醚
部位
乙醚
部位
乙酸乙酯
部位
正丁醇
部位
水部位
6． 25 — 1． 4 12． 3 — —
12． 5 — 5． 1 16． 5 — 8． 0
25 — 10． 4 34． 9 — 8． 0
50 2． 3 28． 1 59． 8 — 4． 6
100 2． 7 53． 7 72． 2 1． 8 3． 9
200 8． 1 69． 3 91． 6 11． 5 6． 1
NC — — — — —
表 2 白蔹不同极性部位作用于 HepG2 细胞 48 h试验结果
浓度
(μg /mL)
抑制率(%)
石油醚
部位
乙醚
部位
乙酸乙酯
部位
正丁醇
部位
水部位
6． 25 — 8． 9 12． 6 — —
12． 5 — 12． 2 19． 1 — —
25 — 28． 8 38． 3 7． 8 6． 5
50 — 50． 2 67． 1 7． 4 3． 7
100 1． 7 76． 9 83． 4 6． 1 8． 2
200 3． 5 89． 6 93． 9 12． 2 6． 0
NC — — — — —
表 3 白蔹不同极性部位作用于 HepG2 细胞 72 h试验结果
浓度
(μg /mL)
抑制率(%)
石油醚
部位
乙醚
部位
乙酸乙酯
部位
正丁醇
部位
水部位
6． 25 — 11． 2 22． 7 — —
12． 5 — 12． 5 28． 1 — —
25 5． 1 26． 1 52． 6 4． 8 3． 3
50 5． 8 65． 5 70． 9 4． 0 3． 7
100 7． 1 87． 4 95． 1 5． 6 —
200 6． 0 92． 9 95． 8 16． 6 3． 2
NC — — — — —
图 1 不同部位对 HepG2 细胞增殖的抑制曲线
3． 2 肿瘤细胞形态学的变化
Hochest /PI双染色可以反应细胞凋亡，细胞内被染成红色
的是死亡细胞，细胞内有浓聚的蓝色荧光而无红色荧光的是凋
亡细胞，细胞内为均匀蓝色荧光的是正常细胞。
由 Hochest 33342荧光染色结果可见正常对照组的细胞着浅
而均一的蓝色荧光，加药组可见被 Hochest 33342 染成不均一的
亮蓝色细胞(图 2) ;由 PI 荧光染色结果可见正常对照组细胞着
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均一的暗红色荧光，而加药组出现不均一的亮红色荧光(图 3)。
可见乙酸乙酯部位有同时诱导 HepG2细胞凋亡和死亡的作用。
图 2 Hochest 33342 荧光染色结果(× 200，24h)
图 3 PI荧光染色结果(× 200，24h)
3． 3 不同组分对 HepG2 细胞增殖的抑制作用
乙酸乙酯部位采用硅胶柱层析分离得到的 5 个组分中，P2
和 P3 两个组分对 HepG2 细胞增殖具有显著的抑制作用，P3 和
P4 具有一定抑制作用(表 4 － 6)。其中 P2 组分抑制 HepG2 细
胞 24h、48h和 72h 的 IC50分别为 41． 28、27． 54 和 20． 53 mg /L。
P3 组分抑制 HepG2 细胞 24、48 和 72 h 的 IC50分别为 65． 39、
34. 10 和 31． 35 mg /L。
表 4 白蔹不同组分作用于 HepG2 细胞 24 h试验结果
浓度
(μg /mL)
抑制率(%)
P1 P2 P3 P4 P5
25 — 41． 8 26． 4 12． 0 10． 2
50 — 58． 4 44． 6 17． 1 12． 2
100 — 78． 5 68． 8 19． 1 15． 6
200 — 90． 8 71． 9 22． 9 20． 1
NC — — — — —
表 5 白蔹不同组分作用于 HepG2 细胞 48 h试验结果
浓度
(μg /mL)
抑制率(%)
P1 P2 P3 P4 P5
25 — 71． 3 61． 6 11． 9 10． 9
50 — 72． 5 69． 2 13． 8 12． 8
100 — 83． 4 77． 4 20． 7 16． 3
200 — 92． 8 85． 3 24． 3 20． 0
NC — — — — —
表 6 白蔹不同组分作用于 HepG2 细胞 72 h试验结果
浓度
(μg /mL)
抑制率(%)
P1 P2 P3 P4 P5
25 — 84． 3 66． 8 11． 3 14． 1
50 — 87． 8 69． 1 12． 0 15． 2
100 — 90． 2 75． 1 20． 1 18． 0
200 — 96． 1 91． 7 29． 3 21． 0
NC — — — — —
4 讨论
本实验以人肝癌 HepG2 细胞为筛选模型，以体外抗肿瘤
活性为指标，对白蔹醇提物经不同极性溶剂萃取分离得到的多
个部位采用 MTT 法测定了其抗肿瘤活性。结果显示，白蔹抗肿
瘤的活性成分主要集中在乙醚和乙酸乙酯部位，其中乙酸乙酯
部位为白蔹抗肿瘤活性最强部位，而其抗肿瘤的作用机制可能
是诱导肿瘤细胞的凋亡和死亡。再将活性最强的乙酸乙酯部位
经硅胶柱层析分离，得到多个组分，采用 MTT法，筛选出活性最
好的 P2、P3 组分，为进一步分离得到活性单体做准备。
由于中药含有十几种甚至几十种具有生物活性的成分，因此
抗肿瘤作用可能是全面而广泛的，包括抑制肿瘤细胞增殖、诱导
其分化和凋亡、增强宿主免疫功能、减少化疗的不良反应、抑制肿
瘤新生血管的形成、抑制肿瘤的耐药性等多个方面和环节。虽然
目前还有许多中药及其有效成分的抗肿瘤机理尚不完全清晰，但
随着抗肿瘤药物研制过程中难题的解决和相关技术的不断发展，
中药及其有效成分必将能更好地预防和治疗肿瘤。本研究组拟
对白蔹的抗肿瘤药效物质基础及其作用机制进行深入研究，为进
一步将白蔹开发成一个新的抗肿瘤药物提供实验依据。
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(收稿日期:2012-02-27 编辑:郑晓屏)
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