全 文 ：*【基金项目】国家自然科学基金资助项目(21272103)
【收稿日期】2014-12-29【修回日期】2014-12-25
△【通讯作者】Tel:0931-8289019;E-mail:Lihf@ lzu． edu． cn
柳叶亚菊中酚类化合物的抗氧化和抗肿瘤活性及凋亡机制*
张 伟1，2，巫洪儒4，梁乾坤1，李云霞1，卢研宇2，龙 瑶2，祝 英4，李红芳1，2，3△
(1． 兰州大学基础医学院生理学教研室，2． 甘肃省新药临床前研究重点实验室，3． 兰州大学基础医学院机能实验室，
4． 兰州大学应用有机化学国家重点实验室，甘肃兰州 730000)
【摘要】 目的:从柳叶亚菊植物中提取的两种具有显著生物活性的天然苯酚类化合物 4-羟基-3，5-二甲氧基-4-
(2-丙酮基)环己烷-2，5-二烯-1-酮和 6-甲氧基-5，7-二羟基香豆素(分别命名为Ⅰ号和Ⅱ号) ，分析测定其抗氧化活
性和抗肿瘤活性及其促凋亡机制。方法:采用 DPPH 和 ABTS 自由基法以及 MTT 法分别测定两种化合物抗氧化
和体外抗肿瘤活性，利用 ＲT-PCＲ测定两种化合物对人血癌细胞株 K562 细胞核转录因子 NF-κB P65 mＲNA的表达
以及 Western blot测定其对核转录因子 NF-κB P65、Fas、β-catenin和 E-cadherin四种蛋白表达的影响。结果:①抗
氧化实验分析得出Ⅰ号化合物具有强烈的抗氧化活性而Ⅱ号化合物无抗氧化活性;②抗肿瘤(MTT)实验分析数据
可知Ⅰ号化合物无抗肿瘤活性而Ⅱ号化合物具有强烈的抗肿瘤活性;③利用实时定量 q-PCＲ测得加入Ⅱ号化合物
组与空白组相比，NF-κB P65 mＲNA的表达明显上调(P ＜ 0． 05) ;④通过 Western blot 实验得出Ⅱ号化合物组核转
录因子 NF-κB P65、Fas、β-catenin和 E-cadherin四种蛋白的表达明显上调(P ＜ 0． 05) ，并且蛋白表达量与药物浓度
呈现明显剂量效应关系。结论:两种酚类化合物分别具有抗氧化和抗肿瘤活性，Ⅱ号化合物的抑癌作用机理可能
一方面通过上调 NF-κB P65、Fas表达，进入经典的 Fas凋亡信号通路;另一方面，通过诱导 β-catenin连环蛋白以及
E-cadherin钙粘蛋白的表达上调，二者参与细胞间的粘连，对防止癌细胞的扩散和肿瘤的转移具有重大意义。
【关键词】酚类化合物;抗氧化活性;抗肿瘤活性;核转录因子-κB P65;Fas受体;β-连环蛋白;E-钙粘蛋白
【中图分类号】Ｒ730． 53 【文献标识码】A 【文章编号】1000-6834(2015)05-422-05
【DOI】10． 13459 / j． cnki． cjap． 2015． 05． 011
A study involving antioxidizability and cytotoxicity of two kinds of phenol
from Ajania Salicifolia and their mechanisms of apoptosis
ZHANG Wei1，2，WU Hong-ru4，LIANG Qiang-kun1，LI Yun-xia1，LU Yan-yu2，LONG Yao2，
ZHU Ying4，LI Hong-fang1，2，3△
(1． Department of Physiology，College of Basic Medicine，2． Key Laboratory of Preclinical Study for New Traditional Chinese Medicine of Gansu Province，
3． Functional Laboratory of Medicine，4． State Key Laboratory of Applied Organic Chemistry，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China)
【ABSTＲACT】Objective:To extract two kinds of phenols 4-hydroxy-3，5-dimethoxy-4-(2-oxopropyl)cyclohexa-2，5-dien-1-one and
6-methoxy-5，7-dihydroxy coumarin (named as Ⅰ and Ⅱ compounds respectively)from Ajania salicifolia and to investigate their an-
tioxidation and cytotoxicity to tumors and explore their pro-apoptosis mechanism． Methods:The antioxidant activities of two compounds
were assessed by ABTS and DPPH radical-scavenging assays． Two compounds were evaluated for their cytotoxicity against human chro-
nic myelogenous leukemia (K562)cells using the MTT assay． The expression of NF-κB P65 mＲNA in K562 apoptotic cells was meas-
ured by reverse transcription-polymerase chain reaction (ＲT-PCＲ) ，real-time quantitative PCＲ． In addition，protein expression levels
of the NF-κB P65，p-Akt，Fas，β-catenina and E-cadherin were also measured by Western blot． Ｒesults:① We found that compound
Ⅰ displayed significant inoxidizability，while compound Ⅱ had no obvious antioxidizability． ② In cytotoxicity experiments，compound
Ⅰ didn’t display cytotoxicity while compound Ⅱ displayed obvious cytotoxicity． ③ Compared with the blank group，the expression of
NF-κB P65 mＲNA in K562 cell after treatment with compound Ⅱ was obviously up-regulated． ④ Compared with the blank group，the
expression levels of NF-κB P65，Fas，β-catenina and E-cadherin were significantly increased in compound Ⅱ treated groups and it ap-
peared obvious dose-effect relationship between the expression of protein and drug concentration． Conclusion:Two phenols have obvi-
ous antioxidizability and cytotoxicity respectively． On the one hand，the tumor-suppressing mechanism of compound Ⅱmaybe act by up-
regulation the expression of NF-κB P65 and Fas protein;thereby，affecting the classical Fas apoptosis signaling pathways． On the other
hand，it can also up-regulate the expression of protein β-catenin and E-cadherin，which participate in the adhesion between cells，and
accordingly，playing an important role in preventing the proliferation and metastasis of cancer cells．
【KEY WOＲDS】 phenolcompounds; inoxidizability; cytotoxicity; NF-κB P65; Fas; β-catenin; E-cadherin
亚菊属植物柳叶亚菊，主要分布在我国北部和
西南部地区，具有清热解毒、消炎止血等作用;柳叶
224 Chin J Appl Physiol，2015，31(5)
亚菊植物所含化学成分复杂，主要有苯酚类、倍半萜
类、三萜甾体类、苯丙素类黄酮类等。此外，还含有
生物碱、多糖及一些脂肪酸等。苯酚类化合物是从
柳叶亚菊植物中分离得到种类最多的化学成分之
一，也是其最主要的有效成分。近年来，随着分子生
物学、细胞生物学、遗传学等的发展，人们对中医药
防治血癌作用机制的研究已上升到了基因、细胞信
号转导等微观水平。虽然许多研究已经证实从柳叶
亚菊中提取的酚类物质具有抗氧化抗肿瘤活性，但
是凋亡机制尚未明确［1］。核转录因子-κB 是一种多
效可诱导的核转录因子，能调节多种基因的表达和
细胞因子的产生，广泛存在于真核细胞中，近来研究
证实从柳叶亚菊中提取的酚类化合物能诱导核转录
因子-κB P65 的表达。本实验应用 q-PCＲ、免疫组化
和 Western blot等方法观察酚类化合物对核转录因
子-κB P65 和细胞凋亡的影响，进一步揭示酚类化
合物诱导细胞凋亡的分子机制，从而为临床治疗提
供确切的理论基础［2］。
1 材料和方法
1． 1 材料
从柳叶亚菊中提取的酚类化合物 4-羟基-3，5-
二甲氧基-4-(2-丙酮基)环己烷-2，5-二烯-1-酮和 6-
甲氧基-5，7-二羟基香豆素(Ⅰ和Ⅱ，兰州大学天然
有机国家重点实验室提取) ;人血癌细胞株 K562 细
胞购置中科院上海细胞所;MTT、顺铂(ACＲOS OＲ-
CANICS)、5-Fluorouracil ≥99% 购自 Sigma 公司;
ＲPMI-1640 培养基 Thermo scientific 产品;胎牛血清
(HyClone)、胰蛋白酶(Hyclone)购自 Thermo 公司;
DPPH，ABTS，BHA 和 Trolox 购自 Sigma-Aldrich 公
司;PCＲ 引物由 Intitrogen 公司合成;Trizol ＲNA 抽
提试剂购置 life公司;逆转录试剂盒购置于 Promega
公司;q-PCＲ 试剂盒是 Bestar Sybr Gree qPCＲ mas-
termix产品;NF-κB P65(A)、ZS-109 兔抗人单克隆
抗体和 Fas抗体购置于北京中杉金桥;E-cadherin 抗
体、β-catenin和 β-actin 抗体购自于 Santa Cruz Bio-
technology公司。
1． 2 两种化合物对 ABTS 和 DPPH 两种自由基抗
氧化测定
待测样品Ⅰ号和Ⅱ号的抗氧化活性通过清除 2
，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2，2＇-
Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate， ABTS
+)和 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1，1-Diphenyl-2-
picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-(2，4，6-trinitro-
phenyl)hydrazyl，DPPH)自由基来测定，两类化合物
各 100 μl 的甲醇溶液分别与 100 μl 的 ABTS + 和
DPPH溶液混合加入到 96 孔板;室温避光环境下反
应 0． 5 h;然后分别在酶标仪 734 nm(ABTS +)和
517 nm(DPPH)波长下测定 OD值;配制同一样品的
5 个不同浓度 2． 5 ～ 40 μg /ml;单纯 ABTS +和 DPPH
孔代表空白组;水溶性维生素 E(6-hydroxy-2，5，7，8-
tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox)和丁基
羟基茴香醚(Butyl hydroxyanisd，BHA)作为阳性对
照，甲醇的纯溶液作为调零组［1］;设定 5 个浓度梯度
3 个复孔;捕捉效率的计算公式抑制率(%)=［A0-
(At-B) ］/A0 × 100% (t = 6 min)。A0 代表不加药
物的空白组;At代表加入梯度药物与自由基反应时
间为 6 min(ABTS +)和 10 min(DPPH) ;B代表甲醇
纯溶液的调零组;IC50表示药物清除自由基一半时
所需的药物浓度［1］。
1． 3 MTT法测定两种化合物的抗肿瘤活性
因为两种化合物是脂溶性的，所以必须用二甲
基亚枫(dimethyl sulfoxide，DMSO)助溶;工作液中
加入的 DMSO的浓度应该小于终浓度的 1%，K562
细胞浓度为 9 × 104 cells /ml加入到 96 孔板里面，每
个孔 90 μl然后加入药物 10 μl;药物设定 5 个浓度
梯度 5 ～ 80 μg /ml;孵育 48 h，加入 10 μl MTT(浓度
5 mg /ml PBS溶解)继续培养 4 h，最后加入三联液
100 μl(10% SDS 和 0． 01 mol /L HCl)37℃过夜，用
酶标仪测定 570 nm波长 OD值;IC50表示药物促凋
亡一半时所需的药物浓度。计算抑制率公式抑制率
(%)=(未加药的 A570-加药的 A570)/未加药的
A570［3］。
1． 4 实时定量 PCＲ测定 NF-κB P65 mＲNA表达
Trizol试剂常规提取总 ＲNA，经核酸紫外分析
仪检测，根据 A260 /A280 的比值确定了 ＲNA 样品
的纯度(A260 /280 = 1． 9 ～ 2． 0)和含量;提取的 ＲNA
的浓度最好是 1 μg /μl;取 1 μl 每组细胞提取的
ＲNA按照 Promega试剂盒说明合成出 cDNA;再取 1
μl逆转录产物进行 PCＲ［4］，按照 PCＲ 试剂盒说明
书一般扩增 30 ～ 35 个循环;β-actin 做为内参基因
引物序列:上游 5’-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-
3’，下游 5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’，目的
基因 NF-κB P65 引物序列上游 5’-GGGGAC-
TACGACCTGAATG-3’，下游 5’-CGGGCACGATTGT-
CAAAGAT-3’，mＲNA 含量的计算:通过实时定量
PCＲ计算出的 Ct 值，利用 2-ΔΔCt法算出各组 mＲNA
的相对含量。
1． 5 免疫印迹法测定药物干预后目的蛋白的表达
1． 5． 1 实验分组及蛋白提取培养人血癌细胞株
K562 细胞，设定一个不加药的空白对照组和化合物
Ⅰ号和Ⅱ号各三个浓度梯度组(5、10、20 μg /ml) ;
培养 24 h后，提取蛋白;每瓶细胞加入 ＲIPA裂解液
300 μl 裂解 10 min，冰浴两次(每次 5 min)结束后
324中国应用生理学杂志，2015，31(5)
漩涡混匀 30 s，4℃离心(12 000 × g，10 min) ，上清移
至新的 EP管中，蛋白提取完毕;冻存与-70℃冰箱备
用［4］。
1． 5． 2 配胶和电泳 (1)配置 10%分离胶和 5%
的浓缩胶:取要上样的蛋白样品 30 μg /well;提取的
蛋白按照 5∶ 1 的比例加入蛋白上样缓冲液煮沸变
性5 min，取出后立即放置于冰上(防止蛋白复性) ，
然后用 SDS-PAGE垂直凝胶电泳分离不同分子量蛋
白质，浓缩胶 10 mA 20 min，分离胶 15 mA 60 min，
当溴酚蓝条带至凝胶底部时，停止电泳。
1． 5． 3 转膜 用半干法转移至 PVDF 膜进行免疫
印迹，其中 I 抗为 β-actin、NF-κB P65、FAS、E-cad-
herin和 β-catenin兔抗人单克隆抗体，稀释浓度为 1
∶ 1 000，II 抗为辣根过氧化物酶(HＲP)山羊抗兔
IgG，稀释浓度为 1 ∶ 10 000;增强化学发光法，X 片
放射自显影，扫描，最后用凝胶图像分析软件 Gel-
pro32 测定灰度值。
1． 6 统计学分析
所有数据以均数 ±标准差(珋x ± s)表示，统计处
理用 SPSS 13． 0 软件进行分析，各组采用独立样本 t
检验。利用 graphpad prism5 作图软件对测定的灰
度值处理并进行组间比较。
2 结果
2． 1 Ⅰ号Ⅱ号化合物对 DPPH 和 ABTS 自由基的
清除活性
Trolox作为 ABTS自由基的阳性对照而 BHA作
为 DPPH自由基的阳性对照，Ⅰ号化合物和Ⅱ号化
合物作为实验组，ABTS和 DPPH作为两种药物的作
用底物;加药后 48 h 的作用结果可知:Ⅰ号化合物
对 DPPH的 IC50值为 1． 99 μg /ml，对 ABTS 自由基
的 IC50值为 1． 49 μg /ml 和Ⅱ号化合物对 ABTS 和
DPPH两种自由基的 IC50值 ＞ 40 μg /ml 差异有显著
性(P ＜ 0． 01，表 1)。与空白对照组相比，加入浓度
梯度的Ⅰ号化合物后，OD 值显著减小并呈现明显
的剂量效应关系(P ＜ 0． 05) ，加入Ⅱ号化合物的实
验组与空白组之间 OD值无明显变化(图 1)。
2． 2 Ⅰ号Ⅱ号化合物的抗肿瘤活性
阳性对照组 Cisplatin(IC50)为 9． 318 μg /ml;
Fluorouracil (IC50)为 13． 125 μg /ml;与对照组相比
加入Ⅰ号化合物后细胞无凋亡现象，OD 值无明显
差异，IC50值 ＞ 80 μg /ml;与对照组相比Ⅱ号化合物
的 IC50值 12． 174 μg /ml，细胞出现显著凋亡(P ＜ 0．
05，图 2)。
Tab． 1 Antioxidant activity of two compounds assessed by
ABTS and DPPH radical-scavenging assays(μg /ml，
珋x ± s，n = 3)
Group DPPH ABTS
Trolox(IC50) ND 4． 8 ± 0． 557
BHA(IC50) 6． 83 ± 0． 408 ND
Ⅰ(IC50) 1． 99 ± 0． 222＊＊## 1． 49 ± 0． 168＊＊##
Ⅱ(IC50) NA NA
BHA:Butyl hydroxyanisd;Trolox:6-hydroxy-2，5，7，8-tet-
ramethylchroman-2-carboxylic acid;Trolox and BHA as positive
control groups;NA:No inhibitory activity at ＞ 40 μg /ml;ND:
Not determined;IC50:A half of maximal inhibitoryconcentration
＊＊P ＜ 0． 01 vs trolox group;## P ＜ 0． 01 vs BHA group
Fig． 1 Ｒelationship of dose reaction bettween efficiency of rad-
ical-scavenging and phenol consentrations
A:Capacity that Trolox and compound Ⅰ clear away ABTS
free radical;B:Capacity that BHA and compound Ⅰ clear
away DPPH free radical;ABTS:2，2-Gzinobis-(3-ethyl-
benzthiazoline-6-sulphonate)
Fig． 2 Cisplatin and fluorouracil as positive control groups
* P ＜ 0． 05 vs cisplatin group;# P ＜ 0． 05 vs fluorouracil
group
2． 3 Ⅱ号化合物对 K562 细胞 NF-κB P65 mＲNA
表达的影响
通过实时定量 PCＲ测出的各组的 Ct 值通过 Ct
值采用 2-ΔΔCt法算出 mＲNA 的相对含量。空白对照
组 mＲNA的表达量设定为 1，三个药物浓度组 mＲ-
NA的表达量为空白组的倍数。与对照组相比加入
Ⅱ号化合物的三个药物浓度组 mＲNA 的表达量随
着加入药物浓度的增加而而呈现梯度增加(P ＜ 0．
05，P ＜ 0． 01，图 3)。
2． 4 Ⅱ号化合物对四种蛋白表达的影响
NF-κB P65 和 FAS受体蛋白的表达量随着药物
浓度的升高逐渐升高，呈现明显的剂量效应关系。
424 Chin J Appl Physiol，2015，31(5)
β连环蛋白(β-catenin)和 E-粘连蛋白(E -cadherin)
二者共同参与细胞间的粘附;通过实验结果可知二
者表达量随药物浓度的增加呈现明显上调的趋势
(P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01，图 4)。
Fig． 3 Expression of NF-κB P65 mＲNA in K562 cell
* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01 vs blank group
Fig． 4 Expression levels of protein P65，Fas，E-cadherin and
β-catenin in the K562 cells
A:P65;B:Fas;C:E-cadherin and β-catenin
* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01 vs blank group
3 讨论
现代研究表明:自由基是引起多种疾病和老化
的主要原因;自由基能引起机体的许多连锁反应而
后又经过体内代谢引起脂质、DNA、细胞膜等体内大
分子损伤，这又是多种疾病，如癌症、心血管疾病、炎
症等的诱因［5］，因此抗氧化剂的研究越来越受到重
视。但由于市场上使用的多种抗氧化剂是化学合成
的并且多具有不良反应，所以筛选能有效防御自由
基损害的天然来源的抗氧化剂是目前研究的热点。
NF-κB P65 作为核转录因子主要参与机体炎
症、免疫反应、细胞增殖和凋亡过程的基因表达，在
很多研究中都表明 NF-κB P65 与细胞增殖关系密
切［6］。NF-κB通过上调抑制 P53 依赖的凋亡和上
调 Bcl-2 家族抗凋亡成员和 Caspase抑制剂如(XIAP
和 FILP)介导许多信号存活反应［7］;相反，NF-κB 也
被 DNA 损伤中的凋亡刺激所激活介导促凋亡基因
(如 TＲAIL Ｒ2 /DＲ5 以及 Fas 和 Fas 配体)上调［8］;
在 K562 细胞中，加入苯酚类Ⅱ号药物后，核转录因
子 NF-κB P65 的表达量明显上调，NF-κB P65 作为
核转录因子，它的激活受上游 Ikk 激酶和 AKT 激酶
的调控［7］，下游受控制因子包括参与炎症、增殖、分
化以及凋亡等相关因子，然而通过实时定量 PCＲ 以
及 Western blot实验表明 NF-κB P65 的表达在加入
药物后明显上调，并且随着药物浓度的升高呈现明
显的剂量效应关系。NF-κB不同的激活途径可引起
不同的促凋亡蛋白(如 FAS、C-MYC 和 P53)或抗凋
亡蛋白(如 TＲAF2、IAP 蛋白和 BCL-2 蛋白)的产
生［8］;通过 Western blot实验表明下游的 Fas受体表
达升高，可能是因为 NF-κB P65 参与了 Fas 的表
达［9］，从而诱导了下游蛋白因子 Caspase 家族(半光
天冬酶)的活化和激活，直接参与细胞凋亡。
黏附分子的表达或功能的改变被认为参与了癌
症的进展，大多数肿瘤源自于上皮组织并且 E-cad-
herin 对上皮组织的组织构成至关重要。研究表明:
在肿瘤进展过程中，发生了 E-cadherin 介导的细胞
与细胞黏附的缺失，这也是随后的肿瘤扩散或转移
所需要的条件。由于癌症患者主要的死亡原因是肿
瘤细胞转移性的扩散，因此，许多研究集中在肿瘤细
胞转移性过程中的细胞黏附及信号转导机制［10］。
E-cadherin 是一类粘蛋白家族，参与由钙依赖的细
胞与细胞之间的粘连，它保持细胞结合在一起以维
护组织的完整性，这种跨膜连接丝蛋白含有胞外结
构域，可以结合另一个细胞的钙粘蛋白，钙粘蛋白也
有胞内结构域，可以结合连环蛋白(catenin)家族的
连接丝蛋白［11］，连环蛋白家族蛋白能结合肌动蛋白
的细胞骨架，作为细胞质内部的脚手架。因此当两
个细胞经钙粘蛋白联系在一起时，肌动蛋白细胞骨
架也间接连接。然而，β-catenin 存在于细胞的三个
不同区域:细胞膜粘连连接处、游离细胞质、细胞核
中。β-catenin是粘连系统的主要组成成分，同时也
524中国应用生理学杂志，2015，31(5)
是 Wnt /β-catenin 信号通路的关键激活因子，能与
E-cadherin形成复合物从而参与细胞与细胞之间的
粘附［12］。通过 Western blot实验测得二者的表达量
均上调，说明二者参与了细胞之间的粘附，说明苯酚
类药物使得两种因子的表达上调促进了细胞之间的
粘附，这对抑制肿瘤的迁移与扩散具有重要的意义。
然而 β-catenin 是否参与了 Wnt /β-catenin 信号通路
目前还不太清楚，但是也不能排除 β-catenin 在胞质
内积聚，转而入核与转录因子 TCF /LEF结合激活下
游靶基因的表达［13］。本实验的研究结果表明苯酚
类Ⅱ号药物诱导上游 NF-κB P65、FAS、β-catenin 和
E-cadherin 的表达促进了肿瘤细胞的凋亡，增加了
细胞间的粘附，对防止肿瘤细胞的扩散具有重大意
义。
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