全 文 ：微粉碎过程中川续断皂苷的成分未发生损失或改变;
体外溶出试验结果表明 ,川续断超微粉溶出速率明显
优于川续断粗粉和细粉 ,说明川续断超微粉可显著加
快川续断皂苷溶出速率。
通过子宫增重实验观察川续断粗粉 、细粉和超微
粉的雌激素样作用 ,结果显示 ,三者均具有雌激素样作
用 ,与空白对照组比较 ,差异有极显著性 。同时川续断
超微粉的雌激素样作用强于粗粉和细粉。
通过对不同粒度续断饮片中川续断皂苷Ⅵ 溶出速
率及其雌激素样作用研究发现 ,川续断皂苷 Ⅵ 的溶出
速率与其雌激素样作用有一定关系 ,超微粉饮片组的
川续断皂苷 Ⅵ溶出较快 ,其雌激素样作用较强 ,可能是
因为超微粉饮片组的川续断皂苷 Ⅵ 在体内溶出较快 ,
提高了其生物利用度 ,从而提高了药效。
超微粉碎技术能使动植物类药材的细胞破壁率达
到 90%,将川续断进行超微粉碎 ,使有效成分直接暴
露出来 ,有利于有效成分的快速溶出 ,该技术可能为传
统中药饮片的适用带来巨大的变化[ 4] 。笔者在本实验
中把川续断中有效成分的溶出特性和药效指标相结
合 ,通过比较川续断粗粉 、细粉及超微粉中有效成分川
续断皂苷的溶出度及雌激素样作用 ,结果表明川续断
超微粉能够加快川续断皂苷的溶出 ,且增强其药效作
用 ,说明川续断超微粉在实际运用中有一定优势 。
[ DOI] 　10.3870/yydb.2009.11.004
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地锦草提取物抗真菌作用及
对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶的影响＊
古力娜 ·达吾提1 ,斯拉甫 ·艾白 2 ,李治建 2 ,安惠霞 3 ,高　莉 2 ,彭晓明 2
(1.新疆维吾尔自治区维吾尔医医院 ,乌鲁木齐　830049;2.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所 ,乌鲁木齐　
830049;3.石河子大学药学院 , 832000)
[摘　要 ] 　目的　对地锦草提取物(EHE)进行体外抗真菌实验 , 探讨其抗真菌作用机制。方法　采用美国临床实
验室标准化委员会(NCCLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A), 测定地锦草提
取物对 82株临床常见真菌的最低抑菌浓度值(MIC);酶联免疫吸附试验(ELISA)研究其对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶
的影响。结果　地锦草提取物对红色毛癣菌的平均 MIC为 446μg· mL-1 ,石膏样毛癣菌值的平均 MIC为 652μg· mL-1 ,
紫色毛癣菌的平均 MIC为 1 024 μg· mL-1 , 许兰毛癣菌的平均 MIC为 896 μg· mL-1 , 疣状毛癣菌平均 MIC为
853μg· mL-1 ,犬小孢子菌及 4种念珠菌的平均 MIC均 >1 024 μg· mL-1;地锦草提取物 256μg· mL-1时 ,可显著降低红
色毛癣菌中角鲨烯环氧化酶的活性(P<0.01)。结论　地锦草提取物有显著的抗真菌活性 , 对皮肤癣菌的敏感性比念
珠菌高;其抗真菌机制可能与抑制角鲨烯环氧化酶的活性有关。
[关键词 ] 　地锦草提取物;抗真菌;最低抑菌浓度;酶联免疫吸附试验;角鲨烯环氧化酶
[中图分类号 ] 　R286;R965　　　[文献标识码 ] 　 A　　　[文章编号 ] 　1004-0781(2009)11-1404-04
AntifungalActionofEuphorbiaHumifusaExtractsandEffectonSqualeneEpoxidaseof
TrichophytonRubrum
GULNAR· Dawuti1 , SILAFU· Aibai2 , LIZhi-jian2 , ANHui-xia3 , GAOli2 , PENGXiao-ming2(1.Uygur
MedicineofXinjiangUygurAutonomousRegionHospital, Urumqi830049, China;2.InstituteofUygur
Medicine, XinjiangUygurAutonomousRegion, Urumqi830049, China;3.SchoolofPharmacy, Shihezi
University, Shihezi832000, China)
ABSTRACT　Objective　TostudyinvitroantifungalactivityofEuphorbiahumifusaextract(EHE), anditsmechanismof
actionagainstT.rubrum.　Methods　TheMICsof82 strainsofcommonclinicalfungitreatedbyEHEweremeasuredbythe
·1404· HeraldofMedicineVol.28No.11 November2009
standardapprovedbytheNationalCommiteeforClinicalLaboratoryStandards(NCCLS):referencemethodforbrothdilution
antifungalsusceptibilitytestingoffilamentousfungi(M38-A).AndtheeffectofEHEonsqualenceepoxidaseactivityinT.
rubrummembranewasstudiedbyELISA.　Results　ThemeanMICofEHEagainstT.rubrumwas446 μg· mL-1 , againstT.
mentagrophyteswas652 μg· mL-1 , againstT.violaceumwas1 024 μg· mL-1 , againstT.schoenleiniiwas896 μg· mL-1 ,
againstT.verrucosumwas853 μg· mL-1 , againstM.canisand4 kindsofCandida, wereallhigherthan1 024 μg· mL-1.And
theactivityofsqualenceepoxidasewasattenuatedbyEHEat256 μg· mL-1.　Conclusion　EHEhasremarkableantifungal
activityagainstthedermatophytesthanCandida.Themechanismofactionmayberelatedtoitsinhibitiononsqualeneepoxidase
activityinfungus.
KEYWORDS　Euphorbiahumifusaextract;Antifungal;MIC;ELISAtest;Squaleneepoxidase
　　地锦草为大戟科植物地锦 Euphorbiahumifusa
Wild.或斑地锦 EuphorbiamaculataL.的干燥全草 ,是
维吾尔医常用药材 ,临床主要用于治疗手癣 、体癣 、足
癣 、花斑癣及银屑病等 [ 1, 2] 。古力娜等 [ 3, 4]研究发现 ,
地锦草具有显著的抗真菌作用。为深入研究地锦草提
取物的抗真菌作用及其机制 ,笔者在本实验中参照美
国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的 《产孢丝
状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案 》
(M38-A)[ 5] ,探讨地锦草提取物的体外抗真菌活性及
对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶活性的影响 ,为地锦草
的开发利用提供实验依据 。
1　材料与方法　
1.1　药物　地锦草提取物(EHE,批号:20080117,新
疆维吾尔医药研究所药剂室提供 ,提取方法及质量控
制参照 《中华人民共和国药品标准维吾尔药分册 》中
百癣夏塔热片之地锦草提取方法及质量控制)[ 6] 。阳
性对照药特比萘酚 (terbinafine, TERB,诺华公司 , 批
号:NO.010482,纯度:99.9%)。
1.2　菌株　红色毛癣菌(T.rubrum)20株 ,石膏样毛
癣菌 (T.mentagrophytes)40株 , 近平滑念珠菌 (C.
parapsilosis)1株 ,新疆医科大学真菌与真菌病研究中
心菌种保藏库 (XYZ)提供。石膏样毛癣菌 (T.
mentagrophytes)、紫色毛癣菌(T.violaceum)、疣状毛癣
菌(T.verrucosum)、犬小孢子菌(M.canis)各 3株 ,许
兰毛癣菌(T.schoenleini)4株 ,新疆维吾尔自治区人
民医院皮肤科检验室提供 。白念珠菌 (C.albicans,
ATCC90028)1株 ,光滑念珠菌(C.glabrata)、热带念
珠菌(C.tropicalis)各 2株 ,新疆维吾尔自治区中医院
[收稿日期 ] 　2009-01-25
[基金项目 ] 　＊国家自然科学基金资助项目(基金编号:
30760308)
[作者简介 ] 　古力娜· 达吾提(1965 -), 女 , 维吾尔族 ,
新疆伊犁人 , 副主任药师 , 主要从事中药药理学研究。电话:
0991-2563702。
[通讯作者 ] 　李治建(1982 -), 男 , 河南夏邑人 , 在读硕
士 , 主要从事中药药理学研究。电话:(0)15981799975, E-mail:
lizhijian0220@126.com。
皮肤科检验室提供。
1.3　试剂　RPMI-1640培养基和三氮吗啡琳丙磺酸
(MOPS),美国 Gibco公司;沙堡氏琼脂培养基(SDA,
北京奥博星生物科技有限公司 ,批号:20080228),真菌
角鲨烯环氧化酶酶联免疫分析试剂盒 (Fungus
squalenceepoxidaseELISAkit,美国 Uscnlife公司 ,产品
编号:EN1007fu)。
1.4　仪器　FM型生化培养箱 ,上海福玛实验设备有
限公司;BHC-1300ⅡA型生物安全柜 , 苏州安泰空气
技术有限公司;Alegra64R型高速低温离心机 ,美国
Beckman公司;JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎仪 ,宁波新
芝科器研究所;Bio-Rad550型酶标仪 ,美国伯乐公司。
1.5　最低抑菌浓度(MIC)值的测定　根据 NCCLS推
荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性
试验方案 》(M38-A)[ 5] ,测定地锦草提取物 (EHE)对
82株临床常见真菌的 MIC值 。
1.5.1　抗真菌药物储备液 、稀释液的制备　称取
EHE粉末 204.8 mg,用 1 mL二甲基亚砜(DMSO)溶
解 ,制成浓度为 204 800 μg· mL-1的储备液 , 存于
-70 ℃冰箱备用;称取 TERB8 mg,用 1 mLDMSO溶
解 ,制成浓度为 8 000μg· mL-1的储备液 ,存于 -70℃
冰箱备用。临用前将 EHE和 TERB储备液 ,分别用
RPMI-1640培养基倍比稀释成 2倍试验终浓度 , EHE
的 2倍终浓度由高到低依次为 2 048, 1 024, 512, 256,
128, 64, 32, 16 , 8, 4 μg· mL-1;TERB的 2倍终浓度由
高到低依次为 0.16 , 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005,
0.002 5, 0.001 25 , 0.000 625 , 0.000 312 5 μg· mL-1。
1.5.2　菌接种液的制备　皮肤癣菌:将受试的皮肤癣
菌接种于 SDA斜面上 , 26℃培养 7 ～ 14 d。吸取 2 mL
无菌 0.85%氯化钠溶液 ,冲洗菌落表面的菌丝和孢
子 ,将含有菌丝和孢子的冲洗液用血细胞计数板记数 ,
将其浓度调至 l×105 ～ 5 ×105 cfu· mL-1 ,用 RPMI-
1640培养基稀释 50倍至 2倍终浓度。念珠菌:将受
试的念珠菌接种于 SDA斜面上 , 36℃培养 48h。挑取
菌落 ,加入 2 mL无菌 0.85%氯化钠溶液 ,用 0.5#
McFarlandstandard比浊管比浊 ,用 RPMI-1640液基稀
·1405·医药导报 2009年 11月第 28卷第 11期
释 100倍后再稀释 20倍至 2倍终浓度 。
1.5.3　接种　将 100 μL2倍终浓度药液 ,由第 1孔
至第 10孔分别由高浓度至低浓度加入无菌 96孔细胞
培养板中 , 第 11孔为生长对照孔 (仅加菌接种液
100μL和 RPMI-1640培养基 100 μL),第 12孔为空白
对照孔(只加 RPMI-1640培养基 200 μL)。将调好的
菌接种液 100 μL,分别加入相应的微孔内 ,这将使每
一梯度的抗真菌药物和菌接种液(2倍终浓度)分别被
1：1稀释到终浓度 。药液中 DMSO的最终浓度 <
1%,符合 NCCLSM38-A方案的规定 [ 5] 。
1.5.4　结果判定　皮肤癣菌于 26 ℃孵育 7 ～ 14 d读
结果;念珠菌于 36 ℃孵育 48 h读结果 。读取 MIC值
时 ,应在不搅动的情况下与对照孔按下列标准比较:0:
肉眼清晰;1:略模糊(80%受抑制);2:浊度显著减低
(50%受抑制);3:浊度轻度减低;4:浊度未减低 。本
试验药物取 1(略模糊)为判定终点 。
1.5.5　质量控制　按照 NCCLS方案 ,对近平滑念珠
菌(菌株编号:XYZ5001)进行反复测定 ,其两性霉素
B的 MIC值 0.5 ～ 4.0μg·mL-1 ,氟康唑 MIC值 1.0 ～
4.0 μg· mL-1 , 5-氟胞 嘧啶的 MIC值 0.12 ～
0.50μg· mL-1。每次试验以此菌株为对照 ,只有当其
MIC值介于其质控范围之内时 ,方认为试验操作准确
可靠。且只有当生长对照孔生长良好 ,空白对照无生
长 ,其他孔随药物浓度升高 ,呈现真菌生长梯度受抑制
时 ,方证明试验成功。
1.6　角鲨烯环氧化酶活性的测定　根据药敏试验结
果 ,选取对 EHE较敏感的红色毛癣菌(菌种编号:XYZ
T.r40001)为研究对象 ,测定 EHE作用后角鲨烯环氧
化酶活性的变化 。
1.6.1　试验分组及药物干预 　试验分生长对照组
(空白生长对照菌)和不同浓度 EHE作用红色毛癣菌
组 (EHE的 浓 度 由 低 向 高 依 次 为 64, 128,
256μg·mL-1)。参照 NCCLS的 M38-A方案 [ 5] ,将不
同浓度的 EHE和红色毛癣菌 (XYZT.r40001)在
26 ℃孵育 7d,收集菌丝样品用于酶活性测定。
1.6.2　样品的处理及酶活性测定 　收集培养液 ,
1 000 g离心 10 min分离得到菌丝样品 , 用 PBS
(pH值 =7.0)缓冲溶液漂洗 3次 ,每次 1 000 g离心
10 min,弃去上清液 。每组精密称取菌丝样品 0.3 g,
各 3份 ,分别加入 PBS(pH值 =7.0)缓冲溶液 1 mL,
置于冰浴上超声破碎细胞 , -20 ℃放置过夜 ,次日反
复冻融 2次 , 5 000 g离心 5 min,取上清液 ,严格按照
ELISA试剂盒说明书进行酶活性测定 。
1.7　统计学方法　角鲨烯环化酶活性结果以(x±s)
表示 ,采用 PEMS3.1数据处理软件 ,组间比较采用 t
检验。
2　结果　
2.1　抗真菌药物敏感性试验　药敏结果表明 , EHE
有显著的抗真菌作用 ,对皮肤癣菌的敏感性比念珠菌
高 ,其中对毛癣菌属 (Trichophyton)的红色毛癣菌
(T.rubrum)较为敏感 ,结果见表 1。
表 1　EHE和 TERB对 82株真菌的药物敏感性　
受试真菌 菌株数 药物 MIC范围 /(μg· mL-1)
平均 MIC/
(μg· mL-1)
T.rubrum 20 EHE 　128～ 1 024 446
20 TERB 0.01～ 0.02 0.01
T.mentagrophytes 43 EHE 　128～ 1 024 652
43 TERB 0.01～ 0.02 0.02
T.violaceum 3 EHE 1 024 ～ 1 024 1 024
3 TERB 0.02～ 0.04 0.03
T.schoenleini 4 EHE 　512～ 1 024 896
4 TERB 0.02～ 0.02 0.02
T.verrucosum 3 EHE 　512～ 1 024 853
3 TERB 0.04～ 0.04 0.04
M.canis 3 EHE 　 >1 024 >1 024
3 TERB 　 >0.08 >0.08
C.albicans 1 EHE 　 >1 024 >1 024
1 TERB 　 >0.08 >0.08
C.glabrata 2 EHE 　 >1 024 >1 024
2 TERB 　 >0.08 >0.08
C.parapsilosis 1 EHE 　 >1 024 >1 024
1 TERB 　 >0.08 >0.08
C.tropicalis 2 EHE 　 >1 024 >1 024
2 TERB 　 >0.08 >0.08
2.2　对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶活性的影响 　
ELISA试验结果表明 , EHE浓度为 256μg· mL-1时 ,对
角鲨烯环氧化酶活性的影响差异有极显著性 (P<
0.01, n=5),结果见表 2。
3　讨论　
由于丝状真菌本身的诸多特点 ,如产孢条件难以
控制 、接种量难以精确量化 、孵育时间长等 ,使其试验
方法标准化具有一定难度 。迄今为止 ,国内外尚无统
一丝状真菌药敏试验标准化方法 。美国临床实验室标
准化委员会(NCCLS)于 1998年推出了 《产孢丝状真
菌的液基稀释抗真菌药敏试验参考方案 》,即 M38-P
方案。在此方案的基础上 , NCCLS在某些抗真菌药物
的最低抑菌浓度 ,即 MIC值的判定等方面进行了广泛
深入的多中心研究 ,加上新型三唑类药物的问世和临
床应用的逐渐增多 ,于 2002年推出了新版产孢丝状真
菌抗真菌药物敏感性试验方案 ,即 M38-A方案 ,该方
案准确性好 、重复性高 ,在终点判定 、结果的解释方面
·1406· HeraldofMedicineVol.28No.11 November2009
　　　　　　　　　　　　　　表 2　EHE对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶活性的影响　 n=5, x±s
组别 EHE浓度 /(μg· mL-1)
酶活性 /(U· mL-1)
第 1次 第 2次 第 3次 平均值
低浓度组 64 18.26 18.48 16.04 17.25±1.12
中浓度组 128 19.00 17.89 16.41 15.99±2.83
高浓度组 256 14.11 14.19 15.37 13.71±1.27＊1＊2
空白菌对照组 - 17.81 19.74 19.89 18.08 ±1.79
　　与空白菌对照组比较 , ＊1P<0.01;与低浓度组比较 , ＊2P<0.01
均有详细的规定 ,实验室间结果的一致性可以与抗细
菌的药物敏感试验相媲美 [ 5, 7] 。
本试验采用 NCCLS推荐的 M38-A方案 ,以特比萘
酚为阳性对照药 ,研究了地锦草提取物对 82株真菌的
体外抑真菌活性 。结果 ,地锦草提取物对毛癣菌属
(Trichophyton)真 菌 的 MIC值 范 围 为 446 ～
1 024 μg· mL-1 ,对小孢子菌 (M.canis)及 4种念珠菌
(Candida)的 MIC值 >1 024 μg· mL-1 ,药物敏感性由
强至弱依次为:T.rubrum>T.mentagrophytes>T.
verrucosum>T.schoenleini>T.violaceum>M.canis和
Candida。阳性对照药特比萘酚对 82株真菌的 MIC值
与文献 [ 8]结果相符 。
角鲨烯环氧化酶是真菌细胞膜麦角甾醇生物合成
通路中的一个重要酶 ,它能使角鲨烯转变成羊毛甾醇 。
目前 ,临床常用的烯丙胺类及硫脲类药物 ,通过作用于
角鲨烯环氧化酶 ,导致真菌重要膜成分麦角甾醇生物
合成受抑而缺陷 ,发挥抑菌作用;角鲨烯的最终积聚 ,
脂滴沉积于细胞壁及细胞浆内 ,导致膜破裂和细胞死
亡 ,发挥杀菌作用[ 9, 10] 。 ELISA试验表明 ,地锦草提取
物 256 μg·mL-1时 ,可显著降低红色毛癣菌中角鲨烯
环氧化酶的活性(P<0.01),因此 ,其抗真菌机制可能
与抑制角鲨烯环氧化酶的活性 ,影响麦角甾醇的生物
合成有关。
[ DOI] 　10.3870/yydb.2009.11.005
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·1407·医药导报 2009年 11月第 28卷第 11期