全 文 ：凝血过程 , 纤维蛋白原还可介导血小板聚集反应 。
我们的试验证明 ,红花黄色素可降低纤维蛋白原的
含量 , 提示红花黄色素可能通过降低纤维蛋白原含
量 ,来抑制血小板的聚集 , 从而抑制血栓的形成 ,
是红花黄色素抗血栓机理之一 。
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(收稿日期:2009-06-14)
＊通讯作者
文章编号:1007-4287(2010)07-1031-04
白树花多糖硫酸酯的抗凝血活性研究
杨曦明1 ,范　聪2 ,李慧萍1 ,郭　楠1 ,张丽萍2＊
(1.北京中医药大学东直门医院 检验科 ,北京 100700;2.东北师范大学生命科学院 , 吉林 长春 130024)
摘要:目的　研究白树花多糖硫酸酯的抗凝血效果及抗凝血机理 ,为制备合成高效 、安全的多糖硫酸酯抗凝剂提
供实验依据。方法　将可食用的白树花真菌进行发酵 ,提取水溶性多糖 ,采用氯磺酸-吡啶法进行硫酸酯化修饰 , 获
得水溶性的白树花多糖硫酸酯。通过测定APTT、TT、凝血因子活性对白树花硫酸酯的抗凝血效果及抗凝血机理进行
评估和探讨。结果　对正常人血浆进行的抗凝血实验表明 , 白树花多糖硫酸酯具有明显的抗凝血活性 , 在 5 mg/ L的
浓度下即可发挥效果 ,在 10 mg/ L浓度时 ,相当于 150 U肝素的抗凝血效果;抗凝血机理研究结果表明 , 白树花多糖硫
酸酯作用于内源凝血系统 , 主要通过抗凝血酶Ⅲ抑制凝血因子Ⅱa 和 Xa的活性发挥抗凝血作用 , 抗凝血机理与肝素
完全相同。结论　通过上述研究结果 ,我们认为白树花多糖硫酸酯具备肝素的抗凝血特性。同时由于是可食用真菌
多糖的制备产物 , 在防生物污染方面具备一定优势。因此 , 白树花多糖硫酸酯可作为理想的肝素替代品进行开发及
临床应用。
关键词:白树花多糖;抗凝血
中图分类号:R552 文献标识码:A
Study on Anti-coagulation Activity of Polyporus Albicans Teng Sulfate　YANG Xi-ming , FAN Cong , LI Hui-ping , et al.(Labo-
ratery of Dong Zhi Men Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine , Beijing 100700 , China)
Abstract:Objective　To synthesize effective safe polysaccharide sulfate as anticoagulant , the anticoagulant activity and the anti-
coagulant mechanism of Polyporus Albicans Teng Sulfate(PATS)were investigated.Methods　We extracted water-soluble polysac-
charide from fermented mycelium of edible polyporus albicans(Imaz.)Teng , and got the water-soluble polyporus albicans teng sulfate
(PATS)by modifing the water-solubility polyose with method of chlorosulfonic acid-pyridine.To evaluate the anticoagulant effect and
study the anticoagulant mechanism of PATS , APTT , TT and the activity of coagulant factors were detected.Results　The anticoagulant
test in vitro with normal human plasma indicated that PATS has conspicuous anticoagulant activity.The dose could be as low as 5 mg/
L to start anticoagulation activity.And at the dose of 10 mg/L , the effect was equivalence to that of heparin about 150U.Our study on
anticoagulation mechanism suggested that PATS taking pathway of internal anticoagulant system.The anticoagulation activity of PATS
was due to the inhibition of the coagulation factors Ⅱa &Xa activities mediated by antithrombin AT-Ⅲ.This anticoagulation mecha-
nism is absolutely identical to that of heparin.Conclusion　We suggested that PATS have the similar anticoagulation characteristic to
heparin.Meanwhile , being the production of edible fungus-poly saccharide , PATS has advantage on bio-safety.Therefore , PATS can be
developed and used clinically as an ideal substitute for heparin.
Key words:polyporus albicans Teng sulfate;anti-coagulation
(Chin J Lab Diagn , 2010 , 14:1031)
　　抗凝剂在深度静脉血栓和心肌梗死溶栓后治
—1031—中国实验诊断学　2010年 7月　第 14卷　第 7期
疗 、防止外科手术后血栓形成等常规治疗方面在临
床上广泛使用[ 1] 。其中肝素是临床上应用最广泛的
一种抗凝剂 ,在上述疾病治疗中发挥十分重要的作
用。但是肝素具有结构多变 、活性不稳定等不足 ,在
临床使用中剂量不易把握 ,使用不当极易造成渗血 、
大出血等不良结果[ 2] 。此外 ,肝素生产多来源于动
物脏器 ,有携带致病微生物以及动物致敏原 、致热原
的隐患 ,可能对人体健康造成危害[ 3] 。因此 ,研发新
型抗凝剂替代肝素是一项十分有意义的工作 。研究
发现 ,某些多糖经硫酸酯化后均具有一定的抗凝血
活性 ,是一类值得开发的肝素替代品[ 4-6] 。白树花
[ Polyporus albicans(Imaz.)Teng]主要分布于中国吉
林省 ,它归属于担子菌纲多孔菌科多孔菌属 ,在民间
是一种长期被食用和药用的中药真菌 ,从白树花发
酵菌丝体中能提取出水溶性多糖。本研究采用氯磺
酸-吡啶法对白树花多糖进行硫酸酯化修饰 ,旨在
探讨白树花多糖硫酸酯的抗凝血功能及抗凝血机
制。
1　材料与方法
1.1　试验材料
白树花多糖(自制);正常人血浆(自制);PT(凝
血酶原时间)试剂 、APTT(活化部分凝血活酶时间)
试剂 、TT (凝血酶时间)试剂 , 美国 Backman Coulter
公司生产;人凝血因子 Ⅱa、Xa 及 Ⅱa、Xa 发色底物 ,
德国 Dade-Behring 公司生产;羊抗人-ATⅢ ,德国HT1
公司生产 。
1.2　仪器
全自动血凝仪 ACL-9000 , 美国 Backman Coulter
公司生产;DX-300 型离子色谱仪 、AS4A-SC 阴离子
色谱柱 ,美国戴安公司生产。ALPRA-CENTAVRI 傅
立叶变换红外光谱仪 ,美国Mattson 公司生产 。
1.3　试验方法
1.3.1　白树花多糖硫酸酯的制备　采用氯磺酸-吡
啶法进行硫酸酯化修饰:将附有冷凝管和滴液漏斗
的三角瓶置盐水-冰浴中 ,加入吡啶 ,磁力搅拌使之
充分冷却 ,用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸。然后加入
多糖粉末 ,磁力搅拌加热至 100℃,恒温反应 60 分
钟。冷至室温 ,之后加入乙醇 ,离心收集沉淀溶于水
中 ,蒸馏水透析 72小时 。滤液经浓缩 、乙醇沉淀 、常
规干燥 ,得水溶性硫酸酯化多糖。
1.3.2　硫酸基含量测定　红外光谱及Sepharose CL-
4B柱层析分析硫酸酯基团 ,红外光谱采用 KBr压片
法;离子色谱法分析硫酸酯基团取代度(Ds);计算公
式为 DS=(1.62×S%)÷(32-1.02×S%)。
1.3.3　抗凝血机理研究
①反应体系的建立　对照血浆:正常人血浆 ,以
3.8%枸橼酸钠 1∶9抗凝 ,4 000转离心 10 min ,获得
贫血小板血浆 ,用于对照实验及 Ⅱa 和 Xa 活性测
定 。肝素抗凝血浆:血浆中加入相当于 150 IU/L 的
低分子肝素 ,用于测定 APTT 、TT 和 PT 时白树花硫
酸酯抗凝血活性对照。凝血因子纯体系:由缓冲液
(pH:7.35巴比妥钠缓冲液)、Ⅱa 和 Xa 组成 ,不含
ATⅢ 。其中Ⅱa和Xa活性与正常血浆相当 。
②抗凝血活性分析　白树花多糖硫酸酯的体外
抗凝血活性是以 270μl正常人血浆加入 30 μl生理
盐水作为对照组;以270μl正常人血浆加入 30μl不
同浓度的白树花多糖硫酸酯作为测试组 ,测定加入
不同浓度白树花多糖硫酸酯血浆的 PT 、APTT 、TT。
③不同ATⅢ浓度对白树花多糖硫酸酯抗凝血
活性的影响　选择具有明显抗凝血活性的白树花多
糖硫酸酯质量浓度(10 mg/L),分别加入到含一定浓
度梯度 ATⅢ抗体的血浆中 ,测定APTT 和 TT ,观察
ATⅢ对白树花多糖硫酸酯抗凝血活性的影响 ,以证
明 ATⅢ与白树花多糖硫酸酯抗凝血活性的相互关
系 。
④凝血因子活性分析　采用发色底物法原理:
血浆中的凝血因子 Ⅱa 和 Xa在 37℃下分别与其发
色底物 Chromozym P和 CBS 31.39作用后 ,释放出硝
基苯胺(PNA), PNA 在 405 nm 波长下有强吸收峰 ,
吸光度值 A405Ⅱa 和 A405Xa分别与 Ⅱa和 Xa 活性
呈正比 。
⑤白树花多糖硫酸酯对纯体系中 Ⅱa 和 Xa 活
性的影响　采用 Ⅱa、Xa 纯体系 ,其中不含 ATⅢ ,测
定不同浓度白树花多糖硫酸酯对 Ⅱ a和 Xa 活性的
影响。
1.3.4　统计学方法　结果以均数±标准差(x—±s)
表示 ,组间比较采用 t检验 , P <0.05为具有显著性
差异。
2　结果
2.1　白树花硫酸酯制备
多糖硫酸化修饰后红外光谱均出现 1 250 cm-1
的 S=O特征吸收峰 ,Sepharose CL-4B柱层析结果显
示硫酸化修饰后多糖样品的洗脱峰仍为单一峰 ,且
峰位前移 ,即硫酸基的引入使多糖的分子量明显增
大 ,表明多糖中的部分羟基被硫酸酯基团所取代。
离子色谱法分析测得硫酸酯基团取代度为 Ds=
1.41 。
2.2　抗凝血机理
—1032— Chin J Lab Diagn , July ,2010 , Vol 14 , No.7
2.2.1　抗凝血活性分析
本研究通过加入不同质量浓度的白树花多糖硫
酸酯 ,测定血浆的凝血指标 APTT 、TT 和 PT 的变化 。
结果显示 ,随着添加抗凝物质浓度的增加 ,血浆 PT 、
APTT 和TT 均呈增大的趋势 ,其中 APTT和 TT 随浓
度的增加幅度较大 ,当质量浓度达到 5 mg/L 以上
时 ,实验组与对照组的 APTT 和 TT 之间产生显著性
差异(P <0.05),而PT 无显著差异。当白树花多糖
硫酸酯质量浓度 10 mg/L 时 ,与 150 IU肝素的抗凝
血活性相当(表 1)。
2.2.2　不同浓度 ATⅢ对白树花多糖硫酸酯抗凝效
果的影响
表 1　不同浓度 PATS的抗凝血活性(x±s)
PATS 浓度 PT(s) APTT(s) TT(s)
对照血浆 12.3±0.10 32.5±0.36 14.4±0.39
1 mg/ L 13.0±0.08 36.2±0.31 16.7±0.22
5 mg/ L 15.7±0.17 57.8±1.42＊ 19.7±0.18＊
10 mg/ L 15.1±0.19 94.2±1.70＊ 26.8±0.47＊
15 mg/ L 15.1±0.10 135±4.60＊ 33.2±0.40＊
20 mg/ L 16.2±0.07 175±3.43＊ 39.3±0.19＊
150 U肝素 15.4±0.18 95.2±1.74 26.2±0.51
　　注:＊表示与对照组比较差异显著 , P<0.05
　　选择具有明显抗凝血活性的白树花多糖硫酸酯
10 mg/L 质量浓度 ,分别加入含有不同浓度 AT Ⅲ抗
体的血浆中 ,测定 APTT 和 TT。结果显示:随着 AT
Ⅲ抗体浓度的增加 ,白树花多糖硫酸酯的抗凝活性
逐渐降低。加入 5 μl 以上 AT Ⅲ抗体浓度时 ,APTT
和TT与正常血浆比较具有显著差异(P <0.05)(图
1a 、1b)。
注:＊表示与对照组比较差异　注:＊表示与对照组比较差异
显著 , P<0.05 显著 , P<0.05
图1a　ATⅢ对PATS 抗凝　图 1b　ATⅢ对PATS 抗凝
血活性(APTT)的 血活性(TT)的影响
影响
2.2.3　白树花多糖硫酸酯对凝血因子活性的影响
①对正常血浆中 Ⅱ a 和 Xa 活性的影响　在正
常血浆(含有正常 ATⅢ水平)中分别加入 30μl生理
盐水及质量浓度分别为 20 mg/L 、50 mg/L、100 mg/
L 、200 mg/L的白树花多糖硫酸酯后 ,分别测定相应
样品中 Ⅱa和 Xa的残留活性 。结果显示 ,随着白树
花多糖硫酸酯浓度的增加 , Ⅱa和 Xa因子的活性逐
渐降低(P <0.05)(图 2a、图 2b)。
注:＊表示与对照组比较差异　注:＊表示与对照组比较差异
显著 , P<0.05 显著 , P<0.05
图 2a　PATS对正常血浆凝　图2b　PATS对正常血浆凝
血因子 IIa 的影响 血因子 Xa 的影响
②对纯体系中 Ⅱa和 Xa活性的影响　在凝血
因子 Ⅱa 、Xa纯体系中分别加入 30μl生理盐水及质
量浓度分别为20mg/L 、50 mg/L、100 mg/L 、200 mg/L
的白树花多糖硫酸酯后 ,分别测定相应样品中 Ⅱa
和Xa的残留活性 。结果显示 ,随着白树花多糖硫酸
酯浓度的增加 ,凝血因子Ⅱa和 Xa 活性下降不明显
(P>0.05)(图 3)。
注:PATS对纯体系中凝血因子Ⅱa和 Xa活性的影响不明显 , P
>0.05
图3　PATS 对纯体系中凝血因子Ⅱa 和 Xa活性的影响
3　讨论
人体内凝血系统和抗凝系统处于一个动态平衡
的状态 ,既不能造成血液过渡凝固 ,也不能过渡抗凝
造成大出血。但是这种平衡一旦失调 ,就会出现凝
—1033—中国实验诊断学　2010年 7月　第 14卷　第 7期
血异常导致心肌梗死 、脑血栓等严重疾病[ 7] 。注射
肝素和口服香豆素类药品进行抗凝治疗已在临床应
用多年 ,但是这些药物自身存在的毒副作用一直是
临床治疗中无法解决的问题[ 8] 。因此 ,开发研制新
型抗凝剂 ,确保临床治疗安全一直是值得研究的课
题。本研究就是在这样背景下 ,采用具有生物安全
保证的材料 ,即可食用真菌白树花 ,经过发酵 、纯化 、
磺酸化等步骤获得白树花多糖硫酸酯 ,并对其抗凝
血效果及抗凝血机理进行探讨 。
白树花多糖经氯磺酸-吡啶法修饰 ,获得水溶性
多糖硫酸酯。离子色谱法分析测得硫酸酯基团取代
度为 Ds=1.41 , 符合抗凝血硫酸酯化多糖的要
求[ 9] 。
在血浆中加入抗凝血物质后 ,若体系的 PT 和
TT分别大于正常值 3 s ,APTT 大于正常值 10 s ,则可
认为添加物能延长凝血时间 , 即具有抗凝血作
用[ 11] 。而且APTT 、TT 和 PT 值越大 ,则表明所添加
物质的抗凝血活性越强[ 6] 。本研究中 PATS 在 5
mg/L的质量浓度时 ,即表现出明显的抗凝血效果 ,
在10 mg/L 质量浓度时 ,抗凝血活性相当于150 U/L
肝素的效果 。主要表现在对 APTT 、TT 的时间延长
上具有显著效果(P<0.05),而对 PT 的时间延长不
显著(P >0.05)。这一结果表明 PATS 不但具有显
著的抗凝效果 ,而且抗凝机理主要体现在对内源凝
血途径的作用上 。
白树花多糖硫酸酯具有与肝素相似的多糖结构
及硫酸基取代基团 ,因此其抗凝血途径可能与肝素
相同。我们分别对不同 AT Ⅲ活性的血浆及反应体
系进行抗凝血试验 ,用 APTT 和 TT 做为抗凝血评价
指标(因为对PT 的作用效果不明显而不做为观察指
标),结果显示随着反应体系中 AT Ⅲ活性的降低 ,
PATS 对APTT及 TT 的延长效果越来越差 ,也就是抗
凝血效果明显降低(P <0.05),当反应体系中 AT Ⅲ
活性极度降低时 , PATS 的抗凝血功能几乎完全丧
失 ,证明PATS的抗凝血效果对血浆中 AT Ⅲ的存在
具有量的依赖性 。
本文上述试验已初步证明 ,PATS的抗凝机理与
肝素相近。因此 ,为进一步证明 PATS 的抗凝血途
径是经 PATS作用于 AT Ⅲ ,进而抑制因子 Ⅱa 和因
子Ⅹ a ,我们设计试验做进一步验证。试验结果显
示 ,正常血浆中加入 PATS后 ,因子 Ⅱa和因子 Ⅹ a 的
活性随着抗凝剂浓度的增加而明显下降(P <
0.05);采用纯因子反应体系时 ,其中不含 AT Ⅲ ,
PATS对因子Ⅱa和因子Ⅹ a的活性几乎没有影响(P
>0.05)。这一结果表明 , PATS 的抗凝血路径是首
先作用于ATⅢ ,通过活化 ATⅢ 达到抑制或灭活因
子Ⅱa和因子Ⅹ a ,进而实现对内源凝血反应途径的
阻断 ,达到抗凝血效果 。PATS的抗凝血机理与肝素
的抗凝血机理完全一致 。
总之 ,上述试验已经证明 PATS 具有较好的抗
凝血效果 ,且抗凝血机理与肝素相同 。虽然肝素已
经在临床治疗高凝血症以及防止凝血系统异常方面
得以广泛使用 ,但是应用肝素易伴随发生出血和血
小板减少 ,以及其他相关的医疗安全问题 ,使肝素在
临床应用中受到了一定的限制。寻找并验证肝素替
代品正是本研究的目的所在。我们认为 PATS具有
成为肝素替代品的潜力 ,是值得进一步研究开发并
应用于临床的理想候选 。
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