全 文 ：龙须藤总黄酮抗凝血的作用
夏俊伟，周毅生，杨俊腾，吴晓敏
(广东药科大学 中药学院，广东 广州 510006)
摘要:目的 观察龙须藤总黄酮的抗凝血作用。方法 采用毛细玻管法和断尾法分别测定龙须藤总黄酮
对小鼠体内凝血时间和出血时间的影响;采用试管法测定龙须藤总黄酮对小鼠体外凝血时间的影响，并
对小鼠血浆复钙时间进行测定。结果 龙须藤总黄酮能不同程度地延长小鼠体内凝血时间、出血时间和
体外凝血时间，且能显著提高小鼠的血浆复钙时间。结论 龙须藤具有较强的抗凝血作用。
关键词:龙须藤;总黄酮;抗凝血
中图分类号:Ｒ965 文献标志码:A 文章编号:1006-8783(2016)02-0210-04
DOI:10．16809 / j．cnki．1006-8783．2015120903
收稿日期:2015-12-09
作者简介:夏俊伟(1990—)，男，2013级硕士研究生，Email:3640693669@ 163．com;通信作者:周毅生(1957—)，男，教授，主要
从事药物新剂型与新技术研究，Email:yishzhou@ aliyun．com。
网络出版时间:2016-03-29 10:26 网络出版地址:http:/ /www．cnki．net /kcms /detail /44．1413．Ｒ．20160329．1026．005．html
Anticoagulation effect of total flavonoids derived from Bauhinia championi Benth．
XIA Junwei，ZHOU Yisheng，YANG Junteng，WU Xiaomin
(School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China)
Abstract:Objective To observe the anticoagulation effect of total flavonoids derived from Bauhinia
championi (Benth．)Benth． Methods The effect of total flavonoids on the bleeding time and the clotting
time in mice were measured by glass capillary procedure and cutting tail procedure，respectively． The tube
method was used to measure the effect of total flavonoids on the clotting time in vitro and the re-calcium
time (ＲT)in mice． Ｒesults Total flavonoids derived from Bauhinia championi (Benth．)Benth． prolonged
the clotting time in vivo and in vitro，and the bleeding time in a certain degree，which also improved the re-
calcium time in mice． Conclusion Bauhinia championi (Benth．)Benth． displays a strong anticoagulation
effect．
Key words:Bauhinia championi (Benth．)Benth．;total flavonoids;anticoagulation
龙须藤 Bauhinia championi(Benth．)Benth．为豆
科羊蹄甲属植物龙须藤的干燥藤茎，是一种针对痹
症治疗的特色药，其性平、苦涩、无毒，具有祛风除
湿、行气活血的功效，临床用于治疗风湿性关节炎、
腰腿疼、跌打损伤等症［1］。现代药理研究表明，龙
须藤提取物具有较强的抗炎镇痛、抗风湿性关节炎、
抗血小板凝集［2-4］等活性，主要含有黄酮类、多糖、挥
发油等成分［5-8］。文献报道，龙须藤提取物具有对抗
血小板聚集的活性［9］，但尚未见有关龙须藤单体或
总黄酮抗凝血作用的报道，本文使用反复硅胶柱层
析方法分离得到龙须藤总黄酮，通过测定其体内凝
血时间、出血时间、血浆复钙时间等指标对龙须藤总
黄酮进行抗凝血作用的研究。
1 实验材料
1．1 实验动物
清洁级昆明小鼠，体质量 18 ～ 22 g，雌雄兼用，
购于广州中医药大学实验动物中心，生产许可证号:
SCXK(粤)2013-0020。
1．2 药品及试剂
龙须藤药材购买于广东清平药材市场，经广东
广东药学院学报
Journal of Guangdong Pharmaceutical University Apr． 2016，32(2)
药学院中药学院李书渊教授鉴定为豆科苏木亚科羊
蹄甲属植物龙须藤的干燥藤茎;5，7，3，4，5-五甲
氧基黄酮(购买于中国药品生物制品检定所，批号:
111765);5，6，7，3，4，5-六甲氧基黄酮(自制，面积
归一化法测得质量分数≥98．0%);华法林钠片(上
海信宜药厂有限公司);枸橼酸钠(上海远慕生物科
技有限公司);CaCl2(上海远慕生物科技有限公司);
水为屈臣氏蒸馏水，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分
析纯。
1．3 主要仪器
Prominence 高效液相色谱仪(日本岛津);
BP211D 分析天平(德国赛多利斯有限公司，d = 0．01
mg);AY120 分析天平(日本岛津，d = 0．1 mg);ＲE-
52A 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SB-100D
超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司);
501超级恒温水浴槽(江苏金坛市宏华仪器厂);
H1650-W型台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器
开发有限公司)。
2 方法
2．1 龙须藤总黄酮的分离
取干燥的龙须藤药材 10 kg，粉碎，根据林丽微
等［10］提取方法进行提取，得到龙须藤乙醇提取浸
膏。将浸膏用水分散后依次使用石油醚、乙酸乙酯、
正丁醇溶液萃取，并减压回收各部位的溶剂，得到乙
酸乙酯部位的浸膏 720 g。取 207 g 乙酸乙酯部位
的浸膏与 300 g 的硅胶拌样作为上样样品，空白硅
胶为 2 300 g，进行硅胶柱层析分离。采用溶剂系统
为二氯甲烷 /乙酸乙酯(8 ∶1)等度洗脱，TLC 跟踪分
析，合并相同的部位，得到4．7 g 黄酮类成分。再取该
黄酮类成分作为上样样品，上样量与空白硅胶比例
是(1 ∶30)，进行硅胶柱层析分离。采用溶剂系统为
二氯甲烷 /乙酸乙酯(8 ∶ 1)等度洗脱，TLC 跟踪分
析，合并相同的部位，最终分离得到龙须藤总黄酮
2．2 g(经 HPLC 测定，龙须藤总黄酮中 5，7，3，4，
5-五甲氧基黄酮含量为 42．7%，5，6，7，3，4，5-六
甲氧基黄酮含量为 25． 5%，两者的总含量达
68．2%)。
2．2 剂量设计与动物分组
取昆明小鼠 50只，雌雄各半，随机分为 5 组，每
组 10 只。分别是空白对照组、华法林钠阳性组、龙
须藤总黄酮低、中、高剂量组。参考广东省药品检验
所的龙须藤药材质量标准［11］，龙须藤提取物按人体
日食推荐量 15 g /人(成人按每人 70 kg体质量计)，
按照提取率折算出龙须藤总黄酮的用量来设计动物
实验剂量，并通过预实验考察证明可行，低、中、高剂
量分别为 25 mg /kg、50 mg /kg、100 mg /kg，空白对照
组给予 20 mL /kg羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，阳性
对照组给予 20 mL /kg华法林钠，其剂量根据人体体
表面积(成人按每人 70 kg体质量计)是小鼠体表面
积(20 g)的 387． 9 倍来计算出小鼠的剂量为 0． 5
mg /kg。
2．3 龙须藤总黄酮对小鼠凝血时间的影响(毛细玻
管法)
取健康小鼠 50 只，分组及给药剂量同“2．2”。
连续灌胃 7 d，末次给药 1 h后，用内径为 1 mm的毛
细玻璃管插入小鼠眼内眦球后静脉丛取血。毛细玻
管内血柱达 5 cm后，每隔 30 s 折断一小段，检查有
无出现血凝丝。计算从毛细玻管采血到出现血凝丝
的时间，即为凝血时间(clotting time，CT)。
2．4 龙须藤总黄酮对小鼠出血时间的影响(断尾
法)
取健康小鼠 50 只，分组及给药剂量同“2．2”。
连续灌胃 7 d，末次灌胃 1 h后，固定小鼠，以毫米尺
测量鼠尾长度并标记，然后以利剪在小鼠尾尖 3 mm
处横断，待血液自行溢出时开始计时，每隔 30 s 用
滤纸吸取血液 1 次，直至血液自然停止(滤纸吸时
无血)为止，即为出血时间(bleeding time，BT)。
2．5 龙须藤总黄酮对小鼠血浆复钙时间的影响
取健康小鼠 50 只，分组及给药剂量同“2．2”。
在去 Ca2+血浆中重新加入适量 Ca2+，内源凝血过程
得以重新恢复，所需要的时间就是血浆复钙时
间［12］。小鼠眼内眦球后静脉丛取血 0．5 mL 与装有
4%(ρ)枸橼酸钠的 2 mL EP 管中(血液 ∶抗凝剂 =
9 ∶1)，3 000 r /min离心 10 min，分离血浆(上清液)。
取 100 μL分离好的血浆于 37 ℃预热的 25 mmol /L
的 CaCl2 溶液 100 μL，立刻计时。在 37 ℃水浴中观
察，出现纤维蛋白丝时立刻停止计时，该时间即为血
浆复钙时间(re-calcium time，ＲT)。
2．6 体外凝血时间测定
取健康小鼠 50 只，分组及给药剂量按“2．2”折
算成浓度分别是华法林钠为 0．025 mg /mL，龙须藤
总黄酮低、中、高剂量分别为 1．25、2．5、5 mg /mL，取
龙须藤总黄酮(低、中、高)、CMC-Na(空白)、华法林
钠(阳性)各 0．1 mL，分别置于 10 支试管中，取小鼠
摘眼球采血，将血液直接滴入刻度试管中至约
0．7 mL，轻轻混匀并计时，每隔 5 s倾斜试管 1次，观
察表层血液是否沿试管移动，至凝固时停止计时，为
112第 2期 夏俊伟，等．龙须藤总黄酮抗凝血的作用
体外凝血时间。
2．7 统计学处理
采用 SPSS17．0统计软件，实验数据均以 珋x±s 表
示，采用单因素方差分析，P＜0．05 为差异有统计学
意义。
3 结果
3．1 龙须藤总黄酮对小鼠 CT的影响
结果见表 1。华法林钠组、龙须藤总黄酮中、高
剂量组与空白对照组比较，CT 均延长，差异有统计
学意义(P＜0．01)。这说明龙须藤总黄酮能抑制小
鼠的凝血功能。且随着龙须藤总黄酮剂量增大，作
用更明显。
3．2 龙须藤总黄酮对小鼠 BT的影响
结果见表 1。龙须藤总黄酮低、中、高剂量组的
出血时间均明显长于空白对照组，差异有统计学意
义(P＜0．01)。提示龙须藤总黄酮能抑制小鼠的血
小板凝集功能，增强其抗凝血功能，且低、中、高剂量
组之间呈剂量依赖关系。
3．3 龙须藤总黄酮对小鼠 ＲT的影响
结果见表 1。龙须藤总黄酮低、中、高剂量组与
空白对照组比较，均明显延长了小鼠的血浆复钙时
间，差异有统计学意义(P＜0．01)。
表 1 龙须藤总黄酮对小鼠 CT、BT、ＲT的影响
Table 1 Effect of total flavonoids derived from Bauhinia championi Benth． on the clotting time，the bleeding time and the re-calcium
time in mice(珋x±s，n= 10)
组别 剂量 /(mg·kg－1) CT /s BT /s ＲT /s
空白对照组 － 113．40±32．91 344．20±84．32 167．20±38．07
华法林钠组 0．5 327．70±50．54* 1013．10±122．14* 388．30±61．17*
龙须藤总黄酮
低剂量组 25 147．20±35．01△ 579．50±108．21＊△ 297．70±51．30＊△
中剂量组 50 257．90±55．16＊△ 809．50±117．11＊△ 543．80±90．98＊△△
高剂量组 100 214．60±32．93＊△ 1059．80±143．79* 423．20±101．17*
与空白对照组比较:* P＜0．01;与华法林钠组比较:△P＜0．05，△△P＜0．01。
3．4 龙须藤总黄酮对小鼠体外 BT的影响
龙须藤总黄酮各剂量组小鼠体外凝血时间均高
于空白对照组，差异有统计学意义 (P＜0．01)，表明
龙须藤总黄酮能够延长小鼠体外凝血时间。龙须藤
总黄酮各剂量组的小鼠体外凝血时间均比华法林钠
组缩短，其中高剂量组与华法林钠组比较差异无统
计学意义。见表 2。
表 2 龙须藤总黄酮对小鼠体外 BT的影响
Table 2 Effect of total flavonoids derived from Bauhinia
championi Benth． on mice clotting time in vitro (珋x±s，n=10)
组别
剂量 /
(mg·mL－1)
BT /s
空白对照组 － 21．20±6．70
华法林钠组 0．025 141．60±25．28*
龙须藤总黄酮
低剂量组 1．25 26．60±5．78△
中剂量组 2．5 70．70±9．29＊△
高剂量组 5 132．40±9．48*
与空白对照组比较:* P＜0．01;与华法林钠组比较:△P＜0．01。
4 讨论
人体内凝血系统和抗凝系统处于一个动态平衡
的状态，既不能造成血液过渡凝固，也不能过渡抗凝
造成大出血。但是这种平衡一旦失调，就会出现凝
血异常导致心肌梗死、脑血栓等严重疾病。注射肝
素和口服香豆素类药品进行抗凝治疗已在临床应用
多年，但是这些药物自身存在的毒副作用一直是临
床治疗中无法解决的问题［12］。因此，开发研制新型
抗凝剂，确保临床治疗安全一直是值得研究的课题。
本研究就是在这样背景下，采用副作用较少的龙须
藤植物，通过提取分离等手段获得总黄酮成分，并对
其抗凝血药效及抗凝血机理进行探讨，为日后开发
研制出“用量少、效果佳、不良反应少”的新型抗凝
剂提供重要依据。
文献报道，龙须藤提取物具有对抗血小板聚集
的活性［9］，但这毕竟是体外实验，药物通过消化、吸
收后是否有效需要作进一步研究。本研究通过测定
其体内 BT、CT、ＲT等指标对龙须藤总黄酮进行抗凝
血作用的研究。
212 广东药学院学报 第 32卷
BT是指血液自离体至凝固所需时间，血液接触
异物后，激活了内源性凝血途径，内源性凝血途径相
关的凝血因子相继被激活，其长短反映血液中参与
凝血的各种凝血因子的含量及其功能。CT 是血管
受到损伤后，自出血至自然止血所需的时间。损伤
的内皮细胞释放组织因子(TF)，激活外源性凝血途
径，相关因子相继被激活［13］;在去 Ca2+血浆中重新
加入适量 Ca2+，内源凝血过程得以重新恢复，所需要
的时间就是 ＲT［13］。ＲT 的测定是检验内源性凝血
系统功能的简便方法。血液的凝固有内源性和外源
性两条凝血途径。它们均可使可溶性的纤维蛋白原
最终转变为不溶性的纤维蛋白，继而包裹被激活后
形成的血小板血栓，进而形成血栓而凝血［14］。本研
究结果显示，龙须藤总黄酮能够明显延长小鼠体内
BT、CT、ＲT以及体外 BT，表明其抗凝血作用主要通
过影响内源性凝血系统起作用，从而抑制凝血活酶
的形成，因此初步认为龙须藤总黄酮具有较强的抗
凝血作用。
综上所述，龙须藤总黄酮中含有具抗凝血活性的
有效成分，但其化学本质及其作用机制不明确，有待
于进一步研究。下一步将对龙须藤总黄酮里的单体
成分进行抗凝血药效学研究，并对其机制深入探讨。
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(责任编辑:幸建华)
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(来源:美国 FDA政府公告，2016-03-30 夏训明 编译)
312第 2期 夏俊伟，等．龙须藤总黄酮抗凝血的作用