全 文 ：玫瑰茄培养细胞中花色苷积累的代谢调节
杜金华　郭勇
(华南理工大学生物工程研究所 ,广州 510641)　　
张开利
(山东泰安市啤酒厂 ,泰安 271000)
摘　　要
　　调整培养基组成是提高玫瑰茄 ( Hibiscus sabdari f f a L. )培养细胞花色苷产量的
有效途径之一。改变 B5培养基中钙、锰、铜等离子的浓度 ,增加了培养细胞花色苷的
积累量 ,其中又以锰离子最为有效 ,其浓度为 6× 10- 4mo l /L时 ,花色苷产量达 0. 341
g /L,是对照的 2. 82倍。培养基中铜离了含量为 10- 4mol /L时 ,培养细胞生长受抑或
死亡。高浓度的钙使培养细胞结团现象严重。外加维生素 C使悬浮培养的玫瑰茄细
胞产花苷能力下降。
关键词: 玫瑰茄 ;　细胞培养 ;　花色苷 ;　代谢调节
第一作者简介: 杜金华 ,女 , 1963年生 ,博士。
　　近年来 ,用植物细胞培养技术生产次生
物质已经成了人们持续深入研究的主题。 该
技术被广泛地用于研究生产具有商业价值的
药品及食品添加剂 ,后者包括食用色素、风味
剂、甜味剂以及具有刺激性的食品添加
剂 [1～ 4 ]。从安全性考虑 ,人们更喜欢使用无毒
的、天然的食品添加剂。花色苷类能够在很宽
的颜色范围内呈色 (桔红至蓝色 ) ,颜色自然
逼真 ,既可用作食品、饮料及化妆品的着色
剂 ,也可以入药 ,用于治疗心脏与神经系统疾
病。天然的花色苷类在制药、食品等工业上有
着广阔的开发应用前景。
用植物细胞培养技术生产花色苷的研究
始于 50年代的德国。 迄今 ,在培养细胞中产
花色苷的植物已多达 50余种 ,除以前的报道
外 [5 ] ,还有土当归 ( Aralia cordata ) [6 ]、商陆
( Phytolaca amerieaca ) [7 ]、筋骨草属 ( Ajuga
reptans )
[8 ]、菊属 (Chrysanthemum coronari-
um )
[9 ]、 Prunus× yedoenis Matsum 杂交细
胞 [10 ]、薄荷科 ( Peril la f rutescens var crispa )
( Labia tea )
[ 11 ]、紫草 ( Perilla f rutescens ) [12 ]
等。
玫瑰茄 ( Hibiscus sabdari f f a L )培养细
胞合成的红色素属花色苷类。花色苷为次生
物质 ,鉴于真核生物基因表达调控的复杂性 ,
改变环境因素如光、培养方法、培养基组成、
外加刺激剂、添加前体物质及中间产物等均
能有效地提高花色苷的产量 [14～ 23 ]。本文报道
了锰离子、钙离子、铜离子及维生素 C对玫
瑰茄培养细胞积累花色苷的影响。
1　材料与方法
1. 1　试验材料
本研究所 1992年诱导的玫瑰茄愈伤组
织。
1. 2　培养基
采用 B5培养基 [23 ] , 2, 4-D 1 mg /L, KT
( Kinetin) 0. 2 mg /L, pH值 5. 8。用于细胞培
养时 ,蔗糖浓度为 20 g /L;用于花色苷生产
时 ,蔗糖浓度为 30 g /L。愈伤组织培养琼脂
浓度为 7. 5 g /L。
1. 3　培养方法
1. 3. 1　愈伤组织培养: 接 2 g愈伤组织于盛
有 50 ml固体培养基的 100 m l三角瓶中 ,于
—25—1998年　第 28卷　第 4期 工 业 微 生 物　　　　　　　　　　　　
25℃ ,光照 27. 3μmo l /s. m2、 16 h /d的条件
下培养 17 d,收获或继代培养。
1. 3. 2　悬浮培养: 将 8 g愈伤组织悬浮于装
有 70 ml生长培养基的 250 m l三角瓶中 ,于
25℃ ,光照 27. 3μmol /s. m2、 16 h /d, 106 r /
min条件下旋转振荡培养 8～ 10 d,各取一接
种匙悬浮于 20 ml待试培养基中 ,培养条件
同前 , 15 d收获。
1. 4　培养物产量、花色苷含量及产量的测定
愈伤组织或悬浮细胞收获 ,低于 40℃干
燥至恒重 ,以培养物产量代表其生长 ,愈伤组
织单位为 g ( dw. ) /f lask,悬浮细胞单位为 g
( dw . ) /L。取 1 g湿细胞 ,用 1% HCl甲醇溶
液于 4℃浸提过夜 ,花色苷含量测定与
Mizukami等 [13 ]的相同 ,将色素含量乘以培
养物产量即得花色苷产量 ,愈伤组织单位为
mg /flask,悬浮细胞单位为 g /L。文中结果均
为四次重复试验的平均值。
2　结果与讨论
2. 1　锰离子的影响
锰离了在细胞中主要是参与酶的组成 ,
为多种氧化还原酶的激活剂 ,它能够刺激胡
萝卜培养细胞积累花色苷。于 B5培养基中添
加不同剂量的锰离子 ,做单因子试验 ,悬浮培
养玫瑰茄愈伤组织。结果如图 1所示。在所
试锰离子浓度范围内 ,细胞产量变化不大 ,花
色苷含量与产量变化显著 ,当锰离子浓度为
6× 10- 4mo l /L时 ,花色苷产量高达 0. 341 g /
L,是对照 ( 0. 121 g /L )的 2. 82倍。其余四个
浓度梯度也都不同程度地提高了花色苷的产
量。
图 1　锰离子对玫瑰茄细胞悬浮培养的影响
2. 2　铜离子的影响
铜离子可以激活次级代谢中的某些酶系
统。适宜浓度的铜离子能显著地促进某些次
生物质如生物碱、小蘖碱及紫草色素的积
累 [24～ 26 ]。 不同剂量的硫酸铜加入 B5培养基
中 ,进行单因子试验 ,培养玫瑰茄愈伤组织和
悬浮细胞。 当铜离子浓度不低于 10- 4mol /L
时 ,悬浮培养及愈伤组织培养的细胞生长受
抑或死亡 ,细胞及培养液呈现黄绿色。随着培
养基中铜离子浓度的降低 ,细胞生长受抑现象
解除 ,在 0～ 10- 5mol /L浓度变化区间内 ,愈
伤组织培养和悬浮培养细胞的生物量变化不
大 (图 2、图 3) ,培养基中铜离子浓度为 0时 ,
培养细胞的产量与对照无明显差异 ,可能是因
为接种细胞中存在的铜离子足以满足细胞生
长的缘故 ,即极微量的铜就能满足玫瑰茄细胞
的生长需求。 愈伤组织在铜离子浓度为 10- 7
mol /L时 ,花色苷产量最高 ,为 6. 447 mg /
flask; 10- 8 mo l /L时 ,花色苷产量为 5. 428
mg / flask,两者相差 1 mg左右 ( 12% )。 悬浮
培养的玫瑰茄细胞在含铜量为 10- 8mol /L的
B5培养基中获得了高达 0. 229 g /L的花色苷
产量 ,比对照 ( 10- 7 mo l /L, 0. 206 g /L )高
11%。 其余几个浓度梯度的产量都很低。
2. 3　钙离子的影响
钙离子参与植物细胞细胞壁的组成 ,在
调节细胞膜通透性方面起着重要作用 ,当介
质中缺钙时 ,细胞膜渗漏并丧失其作为离子
—26— 　　　　　　　　　　　　工 业 微 生 物 1998年　第 28卷　第 4期
自由扩散屏障的作用。 Helper的研究表明 ,
钙离子参与植物细胞有丝分裂的代谢调节。
钙离子能够大大地提高胡萝卜培养细胞花色
苷及红花培养细胞红色素的产量。钙离子对
玫瑰茄悬浮细胞及愈伤组织产花色苷能力的
影响见图 4、图 5。钙离子对玫瑰茄悬浮培养
图 2　铜离子对玫瑰茄愈伤组织培养的影响
图 3　铜离子对玫瑰茄细胞悬浮培养的影响
图 4　钙离子对玫瑰茄细胞悬浮培养的影响
图 5　钙离子对玫瑰茄愈伤组织培养的影响
—27—1998年　第 28卷　第 4期 工 业 微 生 物　　　　　　　　　　　　
细胞产量的影响不明显。 当钙离子含量为 2
× 10- 3mol /L时 ,花色苷的产量处于最低谷 ,
仅为 0. 159 g /L;浓度为 4× 10- 3mol /L时 ,
获最高花色苷产量 0. 234 g /L。 略高于对照
( 10- 3mol /L, 0. 219 g /L)。进行愈伤组织培
养时 ,在 2× 10- 3mo l /L的钙含量时获得最
高细胞产量、最高色素含量及产量 ,分别为
0. 656 g /f lask、 1. 32% ( g /g. dw )及 8. 555
mg /f lask。钙离子浓度为 3× 10- 3mol /L时 ,
花色苷的含量及产量最低。另外 ,在愈伤组织
培养与悬浮培养中均发现 ,随着培养基中钙
浓度的提高 ,细胞结团现象严重 ,愈伤组织结
构紧密。愈伤组织培养时 ,细胞花色苷达最高
产量时所需钙浓度低于 4× 10- 3mol /L,而高
于 10- 3mo l /L,可能培养基液固状态不同而
引起的传质差异与细胞结团现象有关。考虑
到高钙时细胞的结团现象 ,不利于以后的扩
大生产 ,笔者认为 ,生产花色苷时 , B5培养基
中钙离子浓度以 10- 3mol /L为宜。
2. 4　维生素 C的影响
维生素 C被广泛地用作食品、饮料及某
些酒类等的抗氧剂 ,具有还原性 ,参与细胞内
氧化还原反应。 维生素 C与花色苷反应 ,两
者均发生降解 ,其机制尚不清楚 ,可能与维生
素 C降解所形成的中间过氧化物有关。维生
素 C对植物培养细胞积累花色苷的影响 ,目
前尚未见报道。 本试验以 0～ 10- 4mol /L的
维生素 C加入到 B5培养基中 ,做单因子试
验 ,悬浮培养的结果见图 6。研究结果表明 ,
维生素 C不能促进悬浮培养的玫瑰茄细胞
图 6　维生素 C对玫瑰细胞悬浮培养的影响
积累花色苷 ,相反 ,它的存在 ,使得花色苷产
量下降。培养细胞生物量的变化波动不大。资
料显示 ,当有铜、铁离子存在时 ,维生素 C与
花色苷的降解反应加剧。铜、铁离子对玫瑰茄
培养细胞产花色苷能力的影响有待于进一步
研究。
2. 5　结论
综上所述 ,对用玫瑰茄培养细胞生产花
色苷而言 , B5悬浮培养基中适宜的钙、锰、铜
离子浓度分别为 10- 3mol /L、 6× 10- 4mol /L
及 10- 8mo l /L; B5愈伤组织培养基中适宜的
钙和铜离子浓度分别为 2× 10- 3 mol /L和
10
- 7
mol /L。
调整培养基组成分是促进玫瑰茄培养细
胞积累花色苷的有效途径之一。改变 B5培养
基中钙、锰、铜离子的含量均能不同程度地提
高玫瑰茄培养细胞花色苷的产量 ,其中又以
锰离子的作用最为显著。培养基中添加维生
素 C使花色苷产量下降。
参 考 文 献
[ 1 ] Whitaker J. R. Evans D. A. Food Tech no l. ,
1987, 41: 86-101
[ 2] Sudhake r T. J. et al. Plant Sci, 1990, 70: 223-229
[ 3] Ilker R. Food Tech. , 1987, 41( 4): 70-72
[ 4 ] Sw anson S. M . et al. Plant Cell Tissue Organ
Cult. , 1992, 28: 151-157
[ 5]李树敏 ,朱蔚华 .天然产物研究与开发 , 1992, 4
( 4): 58-72
—28— 　　　　　　　　　　　　工 业 微 生 物 1998年　第 28卷　第 4期
[ 6 ] Sakamota K. et al. J. Jpn. Soc Food Sci. Tech-
no l. , 1994, 40( 9): 647-655
[ 7 ] Hiro se Masanori. et al. Plant Cell Ph ysio l. ,
1990, 31( 2): 270-271
[ 8 ] Callebaut A. et al. Bio techno l. Lett. , 1990, 12
( 3): 215-218
[ 9 ] Dougall D. K. and Fra zie r G. C. Plant Cell Tis-
sue Organ Cult. , 1989, 18( 1): 95-104
[ 10 ] Ishikura Na riguki, et al. Bo t. Mag . , 1989, 102
( 1068): 547-560
[ 11 ] Taura Hiro to shii, et a l. Tech. Bull Fac. Arg.
Kagaw a Univ. , 1994, 46( 2): 135-140
[ 12 ] Zhong Jian Jiang , et a l. Biotechnol. Bio eng . ,
1991, 38( 6): 653-658
[ 13 ] Mizukami Hajime, e t al. Plant Cell Rep, 1988,
7: 553-556
[ 14 ] Hanagato , Nobutaka , Ito, Akihide, et a l. J.
Biotechnol. 1994, 34( 2): 213-216
[ 15] Park, Hyung Hwan, Kang , Shin Kwon, et al.
Sanop M isaengmul Hakboechi, 1989, 17 ( 3):
257-262
[16] Suva rna la the G. , Ra jendran L. et al. Biotech-
nol. Lett. , 1994, 16( 2): 1275-1280
[ 17 ] Zw ayyed S. K. , Fra zier G. C. et al. Biotechnol.
Prog . 1991, 7( 3): 288-290
[ 18 ] Do Chi Bao, Co rmier Francois. Plant Cell
Rep. , 1991, 9( 9): 500-504
[ 19 ] Suvarna la tha G. , Rajendran L. et al. Appl. M i-
crobiol. Bio techno l. , 1994, 42: 227-231
[ 20 ] Dougall D. K. Plant Sci. , 1989, 62( 2): 259-262
[ 21 ] Gletz Johannes, Schnitzler Jo erg-Peter et al.
Planta, 1991, 184( 3): 362-367
[ 22] Tsuka sa Mo ri, M iei Sakurai, et al. J. Sci. Food
Ag ri. , 1994, 66: 381-388
[ 23]杜金华 ,郭　勇 .工业微生物 , 1997, 27( 2): 29-
33
[ 24 ] Tso T. C. et al. Plant Ph ysio log y , 1973, 51( 4):
805-816
[ 25 ] Mo rimoto . T. Ag ricultur al and Bio lo gica l
Chemistr y, 1988, 52( 7): 1835-1836
[ 26]周立刚 ;郑光植等 .生物工程学报 , 1992, 8( 4):
353-356
(收稿日期: 1998-01-12)
Metabolic Regulation of Anthocyanin Accumulation in Cultured
Cells of Roselle (Hibiscus sabdariffa L. )
Du Jinhua, Guo Yong
( Biotech nology Insiti tute of Sou th China Tech nology University, Guang zhou 510641)
Zhang Kaili
( Sh and ong Taian Brewery, Taian 271000)
Abstract
　　 Regulation o f medium composition w as one of ef fectiv e w ays of enhancing anthocyanin
accumulation in cul tured cells of rosel le ( Hibiscus sabdari f f a L. ) . Anthocyanin production of
cultured cells wa s increased by regulating the contents of manganese ion, copper ion and
calcium ion respectiv ely in B5 medium. Among th e metal ions tested, the manganese ion w as
most effectiv e. The anthocyanin production w as 0. 341 g /L, w hich was 2. 82 folds of tha t of
the contro l when 10
- 4
mo l /L manganese ion w as added into the medium. The cells w as dead
o r thei r g row th w as inhibited i f copper ion content reached 10
- 4
mo l /L. High concentra tion of
calcium made cul tured cells seriously agg rega te. Anthocyanin accumulation was decreased
when asco rbic acid w as added into the cul tured bro th.
Key words: Ro selle ( Hibiscus sabdari f f a L. ) ; Cell Cul ture; Anthocyanin; Metabolic
regula tion
—29—1998年　第 28卷　第 4期 工 业 微 生 物