全 文 ：5 6 6中国 药理 学通报 Chi e ne sP ha rme ao log i c a lBu l le ti 二 20 03Jn u;9 1(6 ): 65 6一9
扁葫藤素对急性实验性炎症的作用及其机制研究
惠 斌 吴勇杰 王 鸿 ` 田 暄 `
(兰州 医学院 药理学教研室 · 甘肃省 中药新药 临床前研究重点实验 室 , 兰 州 7 3 0 0 0 0 )
中国 图书分类号 R 2 s 2 . 7 1 ; R 3 6 4 . 5 ; R g z l . l
文献标识码 A 文章编号 1 0 0 1一 1 9 7 8 ( 2 0 0 3 ) 0 6一 0 6 5 6一 0 4
摘要 目的 研究扁葫藤素对急性实验性 炎症 的作用及其
机制 。 方法 用巴豆油致小 鼠耳 肿 , 角 叉菜胶致小鼠足肿 ,
醋酸诱发小鼠毛细血管通透性增高 , 角叉菜胶致大鼠腹膜炎
模型 , 观察扁茹藤素对小鼠耳肿 、 足肿 、毛细血管通透性增高
以及对大鼠腹膜炎渗出液 中的白细胞计数 、 蛋白质含量 、 一
氧化氮 ( N O )含量 、 日一 N 一乙酞氨基葡萄糖昔酶 ( N A G )释放 、
丙二醛 ( M D A ) 生成 、 超氧化物歧化酶 ( SO D ) 和过 氧化氢酶
( C A T ) 活性的影 响 。 结果 扁葫藤素 ip 0 . 1 5 6一 0 . 6 2 5 m g
·
k g 一 ’或 im l一 4 m g · k g 一 ’ 明显抑制小鼠耳肿 和足肿 (尸 <
。 . 0 5 ) ; i m Z一 4 m g · k g 一 ’ 明显抑制小鼠毛细血管通透性增
高 ( 尸< 。 . 0 5 ) ; im l 一 Z m g · k g ’ `抑制大鼠腹膜炎白细胞渗
出 、 蛋 白质渗出及 N A G 释放 , 降低 N O 含量 , 抑制 M D A 生
成 , 增强 S O D 及 C A T 活性 。 结论 扁葫藤素有 明显 的抗炎
作用 ;抗炎作用可能与其抑制 N O 生成 、 清除氧自由基 、 抗脂
质过 氧化 、 稳定溶酶体膜有关 。
心提供 。
O O C H
F ig 1 T h e s t r u e t u r e o f P r i s t i m e r in
关键词 扁茹藤素 ;炎症 ; 自由基
卫矛科粉背南蛇藤 ( e e l a s z r u s h夕户 o l e u c u s o l iw
w a r b
, a p u d l o e s ) 在我国分布广泛 , 民间用于治疗风
湿筋骨疼痛巨’ 〕 。 扁葫藤素 ( p r i s t im e r i n )是我们从该
植物中首次提取的醒甲基三菇类的单体化合物 ( iF g
1 )
,含量较高 ,纯度 > 98 % 。 目前国内外对其药理作
用研究少且仅限于体外 。 体外实验中发现扁葫藤素
抑制鼠巨噬细胞表达 N O川 ,其结 构类似物南蛇藤
素在体外有抗脂质过氧化作用川 ,但是 ,扁茹藤素的
抗炎作用尚未见文献报道 。 本文用在体急性实验性
炎症模型 ,研究了其抗炎作用并初步探讨 了抗炎机
制 , 以期为进一步研究开发扁葫藤素提供实验依据 。
1 材料与方法
1
.
1 材料
1
.
1
.
1 动 物 昆明种小 鼠 , ( 18 士 2 2) 9 , 早舍各半 ,
由卫生部兰州生物制 品研究所提供 ; W i s t a r 大 鼠 ,
( 1 8 3 士 1 6 ) g , 早舍各半 , 由兰州医学院实验动物 中
20 0 2 一 0 1 一 2 5 收稿 , 2 0 0 3 一 0 1 一 3 0 修 回
L 兰州大学应用有机化学国家重点实验室 , 兰州 7 3 0 0 0 0
作者简介 : 惠 斌 , 男 , 28 岁 ,博士生 ;
昊勇杰 , 男 , 46 岁 ,教授 。 研究方 向 : 抗炎药理 。 T el : 0 9 3 1 -
8 6 23 5 73
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.
12
.
9 5
.
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1
.
1
.
2 主要试剂 扁茹藤素由兰州大学有机化学
国家重点实验室提供 (纯度 > 98 % ) , 临用前以体积
分数 5% 二 甲基亚矾加体积分数 4% 无水乙醇溶
解 。 角叉菜胶购 自辽宁省药物研究所 , 临用前用生
理盐水混悬 。 考马斯亮蓝 G 一2 50 , 1 , 1 , 3 , 3一四 乙氧
基丙烷 ( T E P ) , lF u k a 产 品 。 日一N 一乙酞氨基葡萄糖
昔酶 ( N A G ) 、 一氧化氮 ( N O ) 、 过氧化氢酶 ( C A T ) 、
超氧化物歧化酶 ( S O D )测定试剂盒 , 购 自南京建成
生物工程研究所 。
1
.
2 方法
1
.
2
.
1 巴豆 油致小 鼠耳肿模型川 小 鼠 50 只 ,随
机分为 5 组 ( T a b l ) 。 分 2 次给药 , 间隔 1 2 h 。 对照
组 im 等量溶媒 (含体积分数 5% 二甲基亚矾与体积
分数 4 %无水 乙醇 ) , 阳性对照组 im 地塞米松注射
液 ( D e x , 2 m g · k g 一 ` ) , 受试组 im 扁茹藤 素 1 、 2 、 4
m g
·
k g
一 ` 。 第 2 次给药后 l h , 右侧耳壳正反面均
匀涂抹 2 % 巴豆油合剂 ( 由 2% 巴 豆油 、 73 % 乙 醚 、
20 肠无水乙醇与 5%蒸馏水混合而成 )。 . 1 m l , 左耳
作为对照 。 致炎 4 h 后处死小 鼠 , 沿耳廓基线剪下
双耳 ,于两耳相同部位用 内径 6 . 5 m m 打孔器 冲下
耳片 ,称重 , 以左右耳片重量差为肿胀度 ,计算抑制
率 。
另取小鼠 50 只 , 分 5 组 ( T a b l ) , i p 给药 (给药
次数及间隔同前 ) 。 用同样方法对 巴豆油所致小 鼠
耳肿进行测定 。
中国 药理 学通报 hC i n e s e P人a r m a ` 0 10 9 1`二 2 B u z z e zi n 2 0 0 3 J u n ; i , ( 6 ) 6 5 7
1
.
2
.
2 角叉菜胶 致 小 鼠足肿模 型川 取 小 鼠 50
只 ,分组及 im 给药方式 同上 。 第 2 次给药 l h 后 ,
于右足踌 sc l % 角叉菜胶 40 川 · 只 一 ` 。 致 炎 4 h
后处死小鼠 , 从躁关节处对称剪下 鼠足 , 称重 , 以左
右足重之差作为肿胀度 ,计算抑制率 。
另取小鼠 50 只 , 分组同上 , i p 给药 (给药次数及
间隔同前 ) 。 用同法对角叉菜胶所致小 鼠足肿进行
测定 。
1
.
2
.
3 醋酸致 小 鼠腹腔 毛细 血管通 透性增 高模
型仁6习 小 鼠 5 0 只 , 分 5 组 ( T a b l ) 。 im 给药 ( 给药
方式同上 ) , 第 2 次 给药后 l h , 小 鼠 iv 体 积分数
0
.
5 % 伊文斯蓝生理盐水 10 m l · k g 一 ` , 随即 i p 体
积分数 0 . 7% 醋酸 2 0 m l · k g 一 ` , 3 0 rn i n 后处死小
鼠 。 用 5 m l 生理盐水分 2 一 3 次洗出腹腔渗 出物 ,
收集渗出液 , 3 0 0 o r · m in 一 `离心 15 m in , 取上清液
于 5 9 0 n m 波长处测吸光度 , 以吸光度值 表示 毛细
血管通透性 的高低 。
1
.
2
.
4 角又菜胶致大 鼠腹膜 炎模 型川 W i st a r 大
鼠 5。 只 , 随机分为 5 组 ( T a b 2) 。 空白对照组 , 模型
对照组分别 im 等量溶媒 (5 %二甲基亚矾加 4%无
水乙醇 ) , 地塞米松组 im 地塞米松注 射液 Z m g ·
k g
一 ` , 扁葫藤素组分别 im 扁葫藤素 1 m g · k g 一 `与
Z m g
·
k g
一 ` ,
12 h 后重复给药 1 次 。 第 2 次给药 1
h 后 ,除空白对照组外 ,其余各组均 i p l % 角叉菜胶
20 m g
·
k g
一 ` 。 致炎 s h 后断头放血处死大鼠 ,大鼠
腹腔注射 5 m l D 一 H a n k S 液 , 腹部按摩 2 m i n , 然后
将液体全部吸出 , 2 s o o r · m i n 一 ` 离心 5 m i n , 上清
部分一 20 C贮存 , 用于测定蛋 白质 、 N O 、 M D A 含量
及 S O D 、 C A T 与 N A G 的活 性 。 沉 淀 部分 用 D -
H a n k S 液重 复洗 1 次 , 然 后用等体 积的 D 一 H an ks
液悬浮 ,作白细胞 ( N e u) 计数 。 T y p a n 蓝染色法鉴
定活细胞数 占细胞总数 的 98 % 以上 。
1
.
3 测定方法
1
.
3
.
1 大鼠腹腔渗 出液蛋白含量测 定 用考 马斯
亮蓝染色法困 。 腹腔渗 出液离心后取上清液 10 川 ,
加 D 一 H a n k S 液至 0 . 1 m l ,然后加入 5 m l 蛋 白试剂 ,
充分振荡混合 2 m in 后以 。 . l m l 双蒸水加 5 m l 蛋
白试剂作为空白对照 , 于 59 5 n m 测定光吸收值 ,并
以牛血清白蛋白作标准品 , 从标准曲线求 出蛋 白含
量 , 结果以 g · I才 一 `表示 。
1
.
3
.
2 大 鼠腹腔渗 出液 N O 含量测 定 N O 化学
性质 活泼 , 在 体 内很 快 转 化 为 N O歹 和 N O歹 , 而
N O歹又可进一步转化为 N O矛 , 利用硝酸还原酶特
异性将 N O歹还原为 N O于 ,通过测定 N O牙浓度来反
应 N O 的含量 。 腹腔 渗出液离 心后取 上清液 。 . 8
m l
, 按照试 剂盒说 明测定 大 鼠腹 腔渗 出液 N O 含
旦乳 。
1
.
3
.
3 大 鼠腹腔渗 出液 N A G 活性测 定 用对硝
基酚显色法 ,底物在 N A G 作用下水解 ,释放 出游离
的对硝基酚 ,加人碱性溶液停止反应 ,并使对硝基酚
显色 , 测定 4 0 0 n m 处 吸光度 , 即可计算酶 活力单
位 。 腹腔渗出液离心后取上清液 0 . 4 m l , 按照试剂
盒测定大鼠腹腔渗出液 N A G 活性 。
1
.
3
.
4 大 鼠腹腔渗 出液 M D A 含量测 定 腹腔渗
出液离心后取上清液 。 . s m l , 按文献川用荧光分光
光度法 , 以 入e 、 一 5 2 0 n m , 入e m = 5 4 6 n m 测定各管荧
光强度 , 以 1 , 1 , 3 , 3一四乙 氧基 丙烷 ( T E P ) 作标准
品 ,计算 M D A 含量 。
1
.
3
.
5 大 鼠腹腔渗 出液 S O D 及 C A T 活性刚 定
腹腔渗 出液中 S O D 及 C A T 活性均按 试剂盒说 明
书分别用轻胺法及紫外分光光度法测定 。
1
.
4 统计学分 析 数据 以 王士 、 表示 , 用 S P S S 统
计软件 ,作 D u n n e t一 t 检验 。
2 结果
2
.
1 扁茹藤素对 巴豆油致小鼠耳肿 、 角叉菜胶致小
鼠足肿以及醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的
影响 扁葫藤 素 i p ( 0 . 1 5 6 一 0 . 6 2 5 m g · k g 一 ` ) 或
im (1 一 4 m g · k g 一 ` ) 明显抑制巴豆油致小 鼠耳肿 以
及角叉菜胶致小 鼠足肿 ( 尸 < 0 . 05 ) , 且量效关系 明
显 ; im Z一 4 m g · k g 一 `抑制醋酸致小 鼠腹腔毛细血
管通透性增高 (尸 < 。 . 05 ) , 与对 照组相 比抑制率达
3 3
.
3 % ( T a b l )
。
2
.
2 扁茹藤素对大鼠腹膜炎渗出液中白细胞数 、 蛋
白质与 N O 含量 、 N A G 活性的影 响 大 鼠经角叉菜
胶致炎后 ,模型组腹腔渗出液中白细胞数 、 蛋白质及
N O 含量 、 N A G 活性 ,与空 白对照组相比升高 (尸 <
0
.
01 )
, 而扁葫藤素 im l 、 2 m g · k g 一 `可显著抑制 白
细胞游走 , 降低渗 出液 中蛋 白质 、 N O 含量 及 N A G
活性 ,作用呈剂量依赖性 ( T a b Z ) 。
2
.
3 扁茹藤素对大鼠腹膜炎渗 出液中 M D A 含且 、
S O D 及 C A T 活性的影响 模型组大 鼠腹腔渗 出液
M D A 含量与空 白对照组 相 比升 高 ( 尸 < 0 . 0 1 ) , 而
SO D
、
C A T 的活性则降低 (尸 < 。 . 0 1 ) 。 扁茹藤素 1 、
Z m g
·
k g
一 `
im 可 以降低渗出液 中 M D A 含量 ,升高
SO D 及 C A T 的活性 , 而 D e x 对 M D A 含量 , SO D
及 C A T 的活性无影响 (尸> 0 . 05 , T ab 3 ) 。
6 58中国 药理 学通报 Ch i n e、 e Ph a r m a c o l og i c a l Bu l l et i n 20 0 3 Ju n ; 19 (6)
T a b 1I nh i i bt o r y e fe fet o fP ri st i m e ri ni P o ri m o n e a r e d e m a
,
h i n d P a w s w e l l i n g a n d e l e v a t i o n o f e a P i l l a r y p e r m e a b i l i t y i n m i c e ( J 士 , , n = 10 )
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书 苍
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3 讨论
粉背南蛇藤在我国广泛分布 , 民间有治疗风湿
筋骨疼痛等功效川 , 而 目前对该植物的化学成分及
药理作用均缺乏深人了解 。 我们以中医药理论为依
据 ,应用现代化学方法从该植物根 中首次提取到含
量较高的单体化合物扁葫藤素 。 本研究结果表明 ,
扁葫藤素 i p 0 . 1 5 6 ~ 0 . 6 2 5 m g · k g 一 ` 或 im l ~ 4
m g
·
k g
一 `对巴豆油致小鼠耳肿与角叉 菜胶致小 鼠
足肿均有明显的抑制作用 ; im Z一 4 m g · k g 一 ` 抑制
醋酸诱导的小鼠腹腔毛细血管通透性增加 ; im l ~ 2
m g’ k g 一 `显著抑制大 鼠腹膜炎渗出液中 白细胞游
走以及蛋白质渗出 , 表明该化合物具有较强的抑制
急性炎症的作用 。 这一作用与粉背南蛇藤的传统功
效相似 ,提示扁葫藤素可能是该植物抗炎的活性成
分之一 。
在炎症 中 N O 作为一种细胞间信息传递的调节
因子 ,与多种炎症介质相互作用 ,在许多环节上参与
炎症反应 10[ 」。 在本实验中扁葫藤素能降低腹膜炎
渗出液中 N O 含量 , 这与文献川 报道在体外抑制鼠
巨噬细胞生成 N O 的作用一致 , 表 明抑制 N O 生成
可能扁葫藤素的抗炎作用机制之一 。 而抑制 N O 生
成的作用可能与其抑制 N F 一 ` B 活性 、 降低 iN O S 的
表达有关川 。
多种致炎因素可损伤溶酶体膜 , 导致膜 内大量
溶酶体酶释放 ,造成细胞损伤 ,加重炎症反应 。 扁葫
藤素可降低 N A G 活性 ,表 明扁茹藤素可能通过稳
定溶酶体膜 , 抑制膜 内活性物质释放而发挥抗炎作
用 。
氧 自由基与炎症关系密切 ,是炎症发生 、 发展的
重要病理机制之一口 `〕 。 氧 自由基 可攻击生物膜磷
脂 中的多聚不饱和脂肪酸 , 引起脂质过氧化 , 造成
生物膜损伤 , 尤其是脂质过氧化产物 M D A 毒性更
强 , 能进一步加重炎症反应 。 体内氧 自由基清除剂
如 SO D 、 C A T 可通过清除氧 自由基 , 抑制脂质过氧
中国药理学通报 C h i n e s 。 p 入a : m a c o zo g i c a z B u z z e t i、 2 0 0 3 J u n ; l , ( 6 ) 6 5 9
化 。 本实验证实 ,扁葫藤素能抑 制大 鼠腹膜炎渗 出
液脂 质过 氧化产 物 M D A 的生 成 , 同时 又能升 高
S O D 及 C A T 的活性 , 表明扁葫藤素 的抗炎作用可
能是通过 增强体 内抗氧 化酶 ( S O D 及 C A T ) 的活
性 , 清除氧 自由基 、 抗脂质过氧化而产生的 。 值得一
提的是 ,其结构类似物南蛇藤素在体外也具有抗脂
质过氧化的作用仁3〕 ,提示这一类化合物抗脂质过 氧
化的作用可能与其化学结构有关 。
综上所述 , 扁葫藤素在体内有明显的抗炎作用 ,
抗炎作用可能是通过抑制 N O 生成 , 清除氧 自由基 、
抗脂质过氧化 ,稳定溶酶体膜而产生的 ,而进一步的
作用机制还有待于深人研究 。
参考文献
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B a o
1 9 9 9 ; 3 0 ( 6 )
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.
A
刀 a l B z o c h e m , 1 9 7 6 ; 7 2 : 2 4 8一 5 4
张建新 . 荧光法测定血清脂质过氧化物的最佳反应条件 . 中华
预防 医学杂志 , 1 9 9 8 ; 3 2 ( 1 ) : 4 0一 2
昊宇 群 , 刘 耕 陶 . 一 氧化 氮 与前 列 腺 素 . 中 国 药 理 学通 报 ,
1 9 9 7 ; 13 ( 5 )
: 3 8 5一 8
M
a e d a H
,
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.
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r . B Zo 〔去 召阴 z s t r夕 ( M o s 〔 ) , 19 9 8 ; 6 3
( 7 )
: 8 54一 64
E f f e e t o f P r i s t im e r i n o n e x P e r im e n t a l i n f l a m m a t i o n i n m i c e a n d r a t s
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p h o t o m e t r y
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b y f l u o r e s e e n e e m e t h o d i n p e r i t o n e a l e x u d a t e i n
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m e a b i l i t y i n m i e e
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r i n im l 一 2 m g · k g 一 ` r e -
d u e e d n e u t r o p h i l e o u n t s
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e o n t e n t
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e r e a s e d N A G a e t iv i t y
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a n d C A T a e t i v i t y i n e x u d a t e
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