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HPLC切换波长法同时测定白蔹中没食子酸、原儿茶醛、
儿茶素和白藜芦醇的含量
张小燕，杭佳，叶晓川* ，刘焱文
(湖北中医药大学药学院，武汉 430065)
摘要 目的:采用反相高效液相色谱切换波长法建立同时测定白蔹中没食子酸、原儿茶醛、儿茶素、白藜芦醇 4 个成分含量的
方法。方法:采用 Agilent Zorbax Eclipse plus 色谱柱(4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ;流动相为乙腈 － 0. 1%磷酸水溶液，梯度洗脱;
流速:1. 0 mL·min －1;检测波长:270 nm(0 ～ 27 min) ，360 nm(27. 01 ～ 36 min) ，306 nm(36. 01 ～ 40 min) ;柱温:30 ℃。结果:
没食子酸、原儿茶醛、儿茶素、白藜芦醇的进样量分别在 0. 0522 ～ 1. 044 μg(r = 0. 9993)、0. 0548 ～ 1. 096 μg (r = 0. 9992)、
0. 4004 ～ 8. 008 μg(r = 0. 9990)和 0. 0086 ～ 0. 172 μg (r = 0. 9993)范围内，与色谱峰峰面积呈良好线性响应;平均回收率分别
为 100. 5%、98. 16%、99. 60%、99. 80%(n = 6)。结论:该方法经方法学验证可用于白蔹的质量控制。
关键词:白蔹;没食子酸;原儿茶醛;儿茶素;白藜芦醇;高效液相色谱法;波长切换;中药材含量测定;方法验证
中图分类号:Ｒ917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2014)03 － 0428 － 04
Simultaneous determination of contents of gallic acid，protocatechuic
aldehyde，catechin and resveratrol in Ampelopsis japonica
by HPLC wavelength switching method
ZHANG Xiao － yan，HANG Jia，YE Xiao － chuan* ，LIU Yan － wen
(College of Pharmacy of Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China)
Abstract Objective:To establish a wavelength switching method for simultaneous determination of gallic acid，
protocatechuic aldehyde，catechin，and resveratrol in Ampelopsis japonica root．Methods:The Agilent Zorbax Eclipse
plus chromatographic column (4. 6 mm × 250 mm，5 μm)was adopted． The mobile phase was acetonitrile(A)－
0. 1% phosphoric acid solution(B)with gradient elution at a flow rate of 1. 0 mL·min －1 ． The detection wave-
length was 270 nm (0 － 27 min，for gallic acid，protocatechuic aldehyde，and catechin)，360 nm (27. 1 － 36 min)
and 306 nm (36. 01 － 40 min，for resveratrol)． The column temperature was 30 ℃ ． Ｒesults:The method achieved a
good linearity in the ranges of 0. 0522 － 1. 044 μg (r = 0. 9993)for gallic acid，0. 0548 － 1. 096 μg (r = 0. 9992)
for protocatechuic aldehyde，0. 4004 － 8. 008 μg (r = 0. 9990)for catechin，and 0. 0086 － 0. 172 μg(r = 0. 9993)
for resveratrol． The average recoveries of gallic acid，protocatechuic aldehyde，catechin and resveratrol were
100. 5%，98. 16%，99. 60%，99. 80% (n = 6) ，respectively． Conclusion:This method can be used to control the
quality of Ampelopsis japonica root by methodology validation．
Key words:Ampelopsis japonica;gallic acid;protocatechuic aldehyde;catechin;resveratrol;HPLC;wavelength
switching;content determination;methodology validation
中药白蔹为葡萄科蛇葡萄属植物白蔹(Ampe-
lopsis japonica(Thumb．)Makino)的干燥块根，始载
于《神农本草经》。其味苦、辛，微寒，具有清热解
毒、消痈散结、敛疮生肌等功效，临床上多用于治疗
痈疽发背，疔疮，瘰疬，烧烫伤等症状。现代药理学
研究发现，该药具有抗菌、抗肿瘤、免疫调节及抑制
毛发生长等作用［1 － 4］。文献报道［5 － 7］，白蔹含有多
酚类、三萜类、蒽醌类等化学成分。中国药典 2010
—824— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(3)
DOI:10.16155/j.0254-1793.2014.03.012
年版(一部)白蔹项下没有含量测定项，目前仅有对
白蔹中大黄素含量测定的相关报道［8］，但其他各种
成分如没食子酸、原儿茶醛、白藜芦醇等亦为白蔹的
活性成分。本实验室前期研究显示［9］，从白蔹中分
离得到的没食子酸、白藜芦醇对人肝癌细胞株
HepG2 均有显著抑制作用，没食子酸的作用机制是
通过降低肿瘤细胞的线粒体膜电位，最终诱导
HepG2 细胞的凋亡。因此，本文建立了高效液相色
谱波长切换法同时测定没食子酸、原儿茶醛、儿茶素
和白藜芦醇 4 个成分，为更好地控制白蔹的内在质
量奠定基础。
1 仪器与试药
Agilent 1100 型高效液相色谱仪，配置四元梯度
泵、在线脱气机、VWD 检测器;AL204 电子天平(梅
特勒托利多科学仪器有限公司)，BP211D 电子天平
(赛多利斯科学仪器有限公司) ，SK250HP 超声仪
(上海利导超声仪器有限公司)。
对照品儿茶素(批号 877 － 200001)、原儿茶醛
(批号 0810 － 200004)、白藜芦醇(批号 111535 －
200502)和没食子酸(批号 110831 － 200302)均为
中国食品药品检定研究院提供，纯度为 98%。甲
醇、乙腈均为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为
分析纯。
2 方法与结果
2. 1 溶液的制备
2. 1. 1 对照品储备液 分别取没食子酸、原儿茶
醛、儿茶素、白藜芦醇的对照品适量，精密称定，加
75%甲醇配成没食子酸 0. 261 mg·mL －1、原儿茶醛
0. 274 mg·mL －1、儿茶素 2. 002 mg·mL －1、白藜芦
醇 0. 043 mg·mL －1的单一成分的溶液，即得。
2. 1. 2 混合对照品储备液 精密吸取“2. 1. 1”项
下没食子酸、原儿茶醛、儿茶素、白藜芦醇的对照品
储备液各 5 mL，置同一 25 mL 量瓶中，加 75%甲醇
制成每 1 mL 含没食子酸 0. 0522 mg、原儿茶醛
0. 0548 mg、儿茶素 0. 4004 mg、白藜芦醇 0. 0086 mg
的混合溶液，即得。
2. 1. 3 供试品溶液的制备 取白蔹粉末(过 60 目
筛)约 1. 0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入
75% 甲醇 20 mL，用锡箔纸避光摇匀，密塞，称定重
量，超声处理(功率 250 W，频率 53 kHz)1 h，放冷，
再称定重量，用 75% 甲醇补足损失的重量，摇匀，用
0. 25 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2. 2 色谱条件
采用 Agilent Zorbax Eclipse plus(4. 6 mm × 250
mm，5 μm)色谱柱，以乙腈(A)－ 0. 1% 磷酸水(B)
溶液为流动相，梯度洗脱(0 ～ 18 min，3% A→10%
A;18 ～ 40 min，10%A→40%A)，检测波长为 270 nm
(0 ～ 27 min)、360 nm(27. 01 ～ 36 min)、306 nm
(36. 01 ～ 40 min) ，柱温 30 ℃，流速 1. 0 mL·min －1，
进样量 20 μL。在上述色谱条件下，没食子酸、原儿
茶醛、儿茶素和白藜芦醇 4 个成分的色谱峰达到较
为理想的分离结果，理论塔板数按被测成分色谱峰
计算均大于 2000。对照品及样品色谱图见图 1。
图 1 混合对照品(A)和样品(B)色谱图
Fig 1 HPLC chromatograms of a mixture of standards (A)and sample
(B)
1．没食子酸(gallic acid) 2．原儿茶醛(protocatechuic aldehyde) 3．儿
茶素(catechin) 4．白藜芦醇(resveratrol)
2. 3 线性关系考察
分别精密吸取“2. 1. 2”项下的混合对照品储备
液 0. 5、1、2、4、6、8、10 mL置 10 mL量瓶中，加 75%
甲醇至刻度，摇匀，在“2. 2”项色谱条件下进样测
定。以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X，μg)为横
坐标，计算回归方程，结果见表 1。
表 1 线性关系
Tab 1 Linear relationship
成分
(component)
标准曲线方程
(regression equation)
r
线性范围
(linear range)/μg
没食子酸(gallic acid) Y =2. 140 × 103X +29. 75 0. 9993 0. 0522 － 1. 044
原儿茶醛
(protocatechuic aldehyde)
Y =2. 828 × 103X +45. 77 0. 9992 0. 0548 － 1. 096
儿茶素(catechin) Y =357. 2X +59. 85 0. 9990 0. 4004 － 8. 008
白藜芦醇(resveratrol) Y =5. 898 × 103X +13. 94 0. 9993 0. 0086 － 0. 172
2. 4 精密度试验
精密吸取“2. 1. 2”项下混合对照品储备溶液 20
μL，连续进样 5 次，测得没食子酸、原儿茶醛、儿茶
—924—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(3)
素、白藜芦醇峰面积的 ＲSD 分别为 1. 2%、1. 3%、
1. 3%、1. 5%，结果表明，仪器精密度良好。
2. 5 重复性试验
精密称取样品粉末 6 份，每份约 1. 0 g，精密称
定，按“2. 1. 3”项下方法平行制备成供试品溶液，
分别进样 20 μL 进行测定。结果没食子酸、原儿茶
醛、儿茶素、白藜芦醇含量平均值(n = 6)分别为
0. 033%、0. 013%、0. 462%、0. 002%，ＲSD 分别为
1. 2%、0. 44%、0. 8%、3. 07%，表明本法的重复
性好。
2. 6 稳定性试验
精密吸取供试品溶液 20 μL，分别在 0、1、2、4、
8、12 h 进样，测得没食子酸、原儿茶醛、儿茶素、白
藜芦醇峰面积的 ＲSD 分别为 0. 89%、0. 79%、
0. 53%、1. 9%，结果表明供试品溶液中上述 4 个成
分在 12 h 内稳定性良好。
2. 7 加样回收试验
取已知含量(没食子酸 0. 033%、原儿茶醛
0. 013%、儿茶醛 0. 462%、白藜芦醇 0. 002%)的白
蔹粉末 6 份，每份约 0. 5 g，精密称定，分别置具塞锥
形瓶中，分别精密加入没食子酸、原儿茶醛、儿茶素、
白藜芦醇对照品储备液 0. 232、0. 668、1. 82、0. 014
μg·mL －1，对照品溶液各 1 mL，按“2. 1. 3”项下方
法操作，制备供试溶液。在“2. 2”项色谱条件下分
别进样 20 μL 进行测定，计算回收率，结果没食子
酸、原儿茶醛、儿茶素、白藜芦醇的平均回收率(n =
6)分别为 100. 5%、98. 16%、99. 60%、99. 80%，ＲSD
分别为 1. 6%、1. 5%、2. 5%、2. 6%。
2. 8 检测限与定量限
在选定的色谱条件下，当信噪比为 3 时，测得没
食子酸、原儿茶醛、儿茶素、白藜芦醇的检测限分别
为 0. 0028 μg、0. 0020 μg、0. 0156 μg、0. 0010 μg;当
信噪比为 10 时测得没食子酸、原儿茶醛、白藜芦醇
的定量限为 0. 0094 μg、0. 0070 μg、0. 0520 μg、
0. 0034 μg。
2. 9 样品含量测定
取所收集的市售白蔹粉末约 1 g，精密称定，按
“2. 1. 3”项下的方法制备供试品溶液，在“2. 2”项色
谱条件下分别进样 20 μL 进行测定，以外标法计算
样品中 4 个成分的含量。结果见表 2。
3 讨论
3. 1 供试品溶液的制备
在溶剂选择上，对 50%甲醇、75%甲醇、100%
甲醇及 50%乙醇、75%乙醇、100%乙醇进行比较，
表 2 样品含量测定结果(%，n =3)
Tab 2 Ｒesults of content determination of samples
来源
(source)
没食子酸
(gallic
acid)
原儿茶醛
(protocatech-
uic aldehyde)
儿茶素
(catechin)
白藜芦醇
(resveratrol)
湖北金贵中药饮片有限公司
(Hubei Jingui Chinese Tradition-
al Medicine Electuary Co．，Ltd．)
0． 033 0. 013 0. 462 0. 002
湖北中医药大学国医堂
(Guoyitang of Hubei University
of Chinese Medicine)
0. 014 0. 084 0. 348 0. 016
金新龙中药饮片公司
(Jinxinlong Chinese Traditional
Medicine Company)
0. 026 0. 087 0. 416 0. 002
显示 75%甲醇提取效率高。相关文献报道［10 － 11］，
白藜芦醇对光和热不稳定，故在提取时对比了避光
与不避光操作，结果显示白藜芦醇需在避光条件下
提取，故在供试品溶液制备过程中采用锡箔纸避光。
在超声提取时间的选择上对 15、30、45、60、90 min
进行比较，显示样品在超声 60 min 后提取效率最
高。最终结果表明各指标性成分在避光条件下用
75%甲醇超声 60 min 提取效果最佳。
3. 2 流动相系统的选择
本实验分别考察了甲醇 － 0. 1%磷酸、乙腈 －
0. 01%磷酸、乙腈 － 0. 1%磷酸 3 个流动相系统。结
果表明:采用乙腈 －磷酸系统为流动相所得到的色
谱图基线平稳，4 个化合物的分离效果好，而使用乙
腈 － 0. 01%磷酸为流动相时则峰形较宽些，故选用
乙腈 － 0. 1%磷酸为流动相系统。
3. 3 检测波长的选择
没食子酸、原儿茶醛、儿茶素和白藜芦醇 4 个成
分的最大吸收波长分别为 270 nm、280 nm、285 nm、
306 nm，本实验利用可变波长紫外检测器波长切换
功能，对 4 个成分同时进行检测。在同时检测没食
子酸、原儿茶醛、儿茶素时，多用 280 nm作为检测波
长［12］。由于白蔹中没食子酸在 3 个成分中含量较
低，故在波长选择上优先考虑没食子酸的最大吸收，
没食子酸、原儿茶醛和儿茶素选择 270 nm为检测波
长;在切换波长时儿茶素之后有很多杂质峰影响基
线，故首先选择 360 nm 避免杂质峰，然后转换为
306 nm检测白藜芦醇，最终达到了检测灵敏度高，
干扰小的目的。
3. 4 小结
本文对不同市售的白蔹药材进行含量测定比
—034— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(3)
较，结果显示 4 个成分含量差异较大，可能与白蔹来
源于不同产地有关，同时也说明仅用 1 个或 2 个指
标不能完全控制样品质量。
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(本文于 2013 年 6 月 24 日收到)
—134—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(3)