全 文 ：双水相体系协同超声提取法分离定心藤总黄酮
李维峰1，王娅玲1，苏志龙2，罗银玲2* (1．云南农业大学热带作物学院，云南普洱 665000;2．普洱学院，云南普洱 665000)
摘要 ［目的］以定心藤为原料，研究超声耦合乙醇 －硫酸铵双水相体系提取定心藤总黄酮最佳工艺。［方法］通过单因素试验和正交
试验对影响定心藤的料液比、硫酸铵浓度、乙醇浓度和超声时间等因素进行探讨。［结果］影响定心藤总黄酮提取因素的主次顺序为乙
醇浓度 ＞超声时间 ＞硫酸铵浓度 ＞料液比，最优提取条件为乙醇浓度 80%、料液比 1∶ 50、超声时间 30 min、硫酸铵质量浓度为 0． 30
g /ml，在此条件下，定心藤总黄酮得率为 2． 02%。［结论］该研究可为定心藤总黄酮提取工艺的设计提供一定的理论依据。
关键词 双水相;定心藤;总黄酮;超声耦合
中图分类号 S567;Ｒ284 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2014)36 －12904 －03
Separation of Total Flavonoids from Mappianthus iodioides by Two-phase Aqueous System Synergism with Ultrasound Extraction
LI Wei-feng1，WANG Ya-ling1，SU Zhi-long2，LUO Yin-ling2* (1． College of Tropical Crops，Yunnan Agricultural University，Puer，
Yunnan 665000;2． Puer University，Puer，Yunnan 665000)
Abstract ［Objective］With Mappianthus iodioides as raw material，the research aimed to study the flavonoids extraction process from Mappi-
anthus iodioides by ultrasonic-assisted alcohol-ammonium sulphate aqueous two-phase system． ［Method］To determine the optimal extraction
conditions，the effect of the conditions，such as the ethanol concentration，the solid-liquid ratio，the amount of the ammonium sulfate，the ul-
trasonic time，were studied by the single factor experiment and the orthogonal test． ［Ｒesult］The results showed that the order of factor to af-
fect total flavones extraction was ethanol concentration ＞ ultrasonic time ＞ ammonium sulfate concentration ＞ material to extraction solution ra-
tion． The optimum extracting conditions were as follows:the volume fraction of alcohol 80%，solid to solution ratio of 1∶ 50，ultrasonic time 30
min，the ammonium sulfate 0． 3 g /ml． At the optimum conditions，the extraction rate of the flavonoids could reach 2． 02% ． ［Conclusion］The
study provides the theoretical basis for the flavonoids extraction process of Mappianthus iodioides．
Key words Aqueous two-phase;Mappianthus iodioides;Total flavones;Ultrasonic coupling
基金项目 云南省教育厅科学研究基金一般项目(2013Y536)。
作者简介 李维峰(1981 － )，男，山东沂南人，讲师，硕士，从事天然产
物化学研究。* 通讯作者，副教授，博士，从事植物生理生
态方面研究。
收稿日期 2014-11-11
傣族“雅解”药中定心藤称为邓嘿罕，是“雅解”药多种
单方或复方解药的重要药物之一，为茱萸科植物定心藤
Mappianthus iodioides Hand． -Mazz的干燥藤茎。据《傣药学》
记载，该药性凉、味甜，具有清火定心、利胆退黄、通气止痛的
功效，主治心慌心跳、烦热不安、头目胀痛、咽喉干痛、尿频尿
急、热涩疼痛、黄疸、跌打损伤、骨折、风湿热痹肢体关节红肿
热痛［1］。相关研究表明，定心藤中含有黄酮、生物碱、强心
苷、酚性成分、有机酸、皂苷、鞣质及氨基酸等类别的化学成
分［2 －5］，但关于定心藤中总黄酮化合物的提取研究报道较
少［6 －7］。
双水相提取技术始于 20世纪 60年代，是利用物质在互
不相容的两相中分配系数的不同来进行提取分离的方法［8］。
传统聚合物与无机盐形成的双水相体系因为聚合物粘度较
大，导致成本较高、提取物的后续处理比较困难等缺点，最近
发展由低级醇如乙醇、丙醇与盐组成双水相体系［9 －11］，该法
具有提取分离条件温和、过程易于应用于实际生产、生物适
应性广等优点，被广泛应用于生物提取、天然产物分离、食品
化工等行业［12 －15］。该研究拟采用超声耦合乙醇 －水 －硫酸
铵双水相提取定心藤总黄酮，并通过单因素试验和正交试验
对提取条件进行优化，为定心藤中总黄酮的提取开发利用提
供基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料 定心藤新鲜藤茎采自云南省普洱市柏枝
寺，经云南农业大学热带作物学院马晓老师鉴定为真品。样
本切片，于 60 ℃干燥后粉碎过 40目筛，冷藏备用。
1． 2 试验试剂 芦丁标准品，国家标准物质中心;其他试剂
均为国药集团分析纯试剂。
1． 3 主要仪器 FW-200 万能粉碎机;上海科导 SK5210HP
超声清洗仪;上海精科 UV759 紫外 －可见分光光度计;梅特
勒 AL204电子分析天平;上海一恒 DZF-6053真空干燥箱。
1． 4 试验方法
1． 4． 1 乙醇 －硫酸铵双水相体系制备。在一定浓度的硫酸
铵溶液中加入无水乙醇，利用硫酸铵的盐析作用形成双水相
体系，并通过改变乙醇的比例和硫酸铵的浓度控制双水相体
系的组成［16］。
1． 4． 2 标准曲线的绘制。总黄酮含量的测定采用分光光度
法，配制 0． 2 mg /ml 芦丁为标准溶液，分别取 1． 00、2． 00、
3. 00、4． 00、5． 00、6． 00、7． 00 ml 于 25 ml 比色管中，加入 1 ml
5%NaNO2 溶液，摇匀后放置 6 min，然后加入 1 ml 10%
Al(NO3)3溶液，摇匀后放置 6 min，再加入 6 ml 4% NaOH溶
液，用30%乙醇定容至刻度线［16］，摇匀，放置15 min后于510
nm波长处测定吸光度，以吸光度为横坐标、芦丁浓度为纵坐
标绘制标准曲线，得到回归方程 A =12． 559x + 0． 003 4，相关
系数 Ｒ2 = 0． 999 6。
1． 4． 3 样品总黄酮的提取。取 1 g定心藤干粉于 100 ml 圆
底烧瓶中，按照超声功率500 W、超声温度60 ℃［6］，分别研究
不同料液比(1∶ 10、1∶ 20、1∶ 30、1∶ 40、1∶ 50、1∶ 60)、不同硫酸铵
浓度(0． 15、0． 20、0． 25、0． 30、0． 35、0． 40 g /ml)、乙醇浓度
(50%、60%、70%、80%、90%)、不同超声时间(10、20、30、40、
50、60 min)对定心藤总黄酮提取率的影响。
1． 4． 4 正交试验设计。为了对提取工艺进行优化，在上述
责任编辑 黄小燕 责任校对 况玲玲安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2014，42(36):12904 － 12906
单因素试验基础上，选择浸提料液比、硫酸铵浓度、乙醇浓度
和超声时间 4 个因素按照 L9(3
4)设计四因素三水平试验
(表 1)。 表 1 正交试验因素水平
水平 A(料液比)
B(硫酸铵浓
度∥g /ml)
C(乙醇浓
度∥%)
D(超声时间
∥min)
1 1∶ 30 0． 25 60 20
2 1∶ 40 0． 30 70 30
3 1∶ 50 0． 35 80 40
1． 4． 5 样品总黄酮的分析。取 1 ml定心藤提取液，于 25 ml
比色管中，加入 1 ml 5%NaNO2 溶液，摇匀后放置 6 min，然后
加入 1 ml 10% Al(NO3)3 溶液，摇匀后放置 6 min，再加入 6
ml 4%NaOH溶液，用 30%乙醇定容至刻度线［15］，摇匀，放置
15 min后于 510 nm波长处测定吸光度，利用回归方程计算
样品中总黄酮含量，并按照下面公式计算总黄酮提取率，即
总黄酮得率(%)=(提取液中总黄酮质量 /原料质量)×
100%。
2 结果与分析
2． 1 单因素影响试验
2． 1． 1 料液比对提取的影响。从图 1 可以看出，料液比直
接影响定心藤总黄酮的得率，料液比过大或过小均不利于总
黄酮的提取，料液比过小，溶剂体积过少，黄酮类从样品中扩
散到溶剂中的速率低，且极易达到饱和状态;料液比过大，不
但会在加热过程中造成能力的浪费，更会因溶剂用量过多、
硫酸铵用量增大，影响双水相的稳定性，从而导致总黄酮的
得率下降，因此选用 1∶ 40(m/v)为最佳料液比。
图 1 料液比对总黄酮提取率的影响
2． 1． 2 硫酸铵浓度对提取的影响。从图 2 可以看出，随着
硫酸铵浓度的增加，总黄酮得率先上升后下降，在 0． 30 g /ml
时达到最大值，总黄酮得率为 1. 94%。究其原因，可能是因
为硫酸铵在 0． 30 g /ml时形成的双水相最为稳定，有利于黄
酮的溶出和扩散。
2． 1． 3 乙醇浓度对提取的影响。乙醇浓度会影响双水相的
组成及稳定性，进而对总黄酮得率产生影响。从图 3 可以看
出，乙醇浓度为 70%时，黄酮得率最高，达 1． 97%，过低的乙
醇浓度不利于黄酮类化合物从植物细胞中溶解出来，而过高
的乙醇浓度不易透过亲水性植物细胞壁。
2． 1． 4 超声时间对提取的影响。从图 4 可以看出，超声时
间 10 ～30 min范围内总黄酮得率随超声时间的延长而提高，
图 2 硫酸铵浓度对总黄酮提取率的影响
图 3 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响
在 30 min时达到最大值，之后继续超声提取得率会有所降
低，可能是超声时间过长，黄酮类化合物部分氧化降解，从而
导致提取得率下降，所以选定 30 min为最佳超声时间。
图 4 超声时间对总黄酮提取率的影响
2． 2 定心藤总黄酮提取工艺的正交试验结果 以定心藤总
黄酮得率为评价指标，使用正交设计助手Ⅱ进行数据统计分
析，从表 2可以看出，定心藤总黄酮的提取得率受到超声时
间、乙醇浓度、料液比、硫酸铵浓度 4 个因素的交叉影响，通
过极差 Ｒ值的比较可以看出，影响定心藤总黄酮提取率因素
的主次顺序为乙醇浓度 ＞超声时间 ＞硫酸铵浓度 ＞料液比，
定心藤总黄酮的超声辅助双水相提取最佳条件是
A3B2C3D2，即料液比为 1∶ 50(g /v)、硫酸铵浓度为 0． 30 g /ml、
乙醇浓度为 80%、超声提取时间为 30 min。
2． 3 最佳条件组合试验 根据正交试验优化条件，按照乙
醇浓度80%、硫酸铵浓度0． 30 g /ml配制双水相溶液，料液比
为 1∶ 50(g /v)，超声提取时间为 30 min，定心藤总黄酮进行 5
次平行提取试验，黄酮得率分别为 1． 97%、1． 96%、2． 11%、
5092142 卷 36 期 李维峰等 双水相体系协同超声提取法分离定心藤总黄酮
2． 04%、1． 96%，平均得率为 2． 02%，平均标准误(ＲSD)为
0. 03%。
表 2 L9(3
4)正交试验结果与极差分析
试验编号 A B C D 得率∥%
1 1 1 1 1 1． 734
2 1 2 2 2 1． 975
3 1 3 3 3 1． 866
4 2 1 2 3 1． 814
5 2 2 3 1 1． 879
6 2 3 1 2 1． 811
7 3 1 3 2 1． 972
8 3 2 1 3 1． 869
9 3 3 2 1 1． 855
K1 1． 858 1． 840 1． 805 1． 823
K2 1． 835 1． 908 1． 881 1． 919
K3 1． 899 1． 844 1． 906 1． 850
Ｒ 0． 064 0． 068 0． 105 0． 096
3 结论与讨论
超声波可以使细胞壁在超声空气化产生的巨大压力下
瞬间破碎，并通过聚能效应、微扰效应和界面效应等提高传
质速率和效果，从而对黄酮类化合物的提取起到很好地辅助
效果［17］。在乙醇 －硫酸铵双水相体系中，黄酮类分配于乙
醇上相，而其他水溶成分如多糖、氨基酸等分配于盐水下相，
从而很好地实现黄酮类化合物与其他杂质成分的分离，提高
黄酮类成分的纯度及提取效率。
笔者通过单因素试验和正交优化试验设计，将超声提取
与乙醇 －硫酸铵双水相分离技术耦合集成，研究了定心藤中
总黄酮的提取最佳工艺，并通过试验验证最佳工艺下总黄酮
的得率，发现在乙醇浓度80%、硫酸铵浓度0． 30 g /ml配制双
水相溶液、料液比 1∶ 50(g /v)、超声提取时间 30 min的条件
下，定心藤总黄酮平均得率可达 2． 02%，该工艺耗时短、提取
分离简单、得率较高，具有很高的实际生产应用价值。
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12448 －12449．
(上接第 12878页)
反而相对往年较小;2013 年 7 月温差较大，刺激菌丝扭结成
菌索;9月中下旬气温下降低于 15 ℃，野生榛蘑的生长发育
温度不足。
由表 4可知，每年 7 ～8月是雨季，降水较集中，2012年 9
月期间 13 d降水，其中中到大雨 4 d;2013 年 7 月期间 17 d
降水，其中中到大雨 7 d;2013年 8月期间 21 d降水，其中中
到大雨 4 d。2013年 7 ～8月降水时间比较长，空气相对湿度
较高，菌索形成大量原基，8 月中旬至 9 月中旬温度、湿度适
宜，榛蘑大量发生。
在一般情况下，每年 7 ～ 9月是榛蘑集中发生时期，夏季
榛蘑出现少量单生，经过雨季立秋后湿度和温度变得更加适
宜，自 8月中下旬开始榛蘑成片出现，有连续 20 ～ 30 d左右
的丰产期。每年 5 ～6月份温度适宜促进榛蘑菌丝体恢复和
生长发育，经过 7 月温差刺激，形成大量的菌索，适宜的温
度、恰如其分的温差、适宜的降水量是秋季野生榛蘑发生和
生长的必要条件。
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60921 安徽农业科学 2014 年