全 文 ：收稿日期:2013 － 11 － 08
基金项目:成都大学校基金资助项目(编号:2011 XJZ 18)。
作者简介:李 佳(1993 －) ，女，四川营山县人;研究方向:生物工程。
通讯作者:邬晓勇，E-mail:cduwxysyx@ 126． com。
双水相体系提取欧李种仁蛋白的初步研究
李 佳， 苟兰亭， 陈 俊， 邬晓勇， 苟小军
(成都大学药食同源植物资源开发重点实验室， 四川 成都 60106)
Primary Study on Extraction of Seed Protein from Prunus humilis by
Aqueous Two-phase System
LI Jia，GOU Lan-ting，Chen Jun，Wu Xiao-yong，GOU Xiao-jun
摘要:筛选优化了聚乙二醇(PEG)/硫酸铵双水相的质量分数、
分配系数、回收率等影响因素，得到了欧李种仁蛋白的最佳萃
取条件:在 30%硫酸铵、22%聚乙二醇条件下，分配系数最小，
达 0． 087 7，回收率为 95． 8%。并对此体系的最大萃取容量进
行测定。结果表明，双水相易于放大和进行连续性操作，适于
大规模生产蛋白。
关键词: 欧李;种仁蛋白;双水相萃取;优化;放大操作
中图分类号: S 662． 5 文献标志码: A
文章编号: 1001 － 4705(2014)03-0082-05
欧李 (Prunus humilis Bunge)为蔷薇科樱桃属落
叶小灌木，我国特有的果实和药用兼用的树种，其茎
叶、果实、根皮具有很高的经济及药用价值［1］，原生长
于北方边远山区等一些人口稀少的艰苦地区，其植株
外形较小，株高 0． 5 ～ 1． 0 m，叶芽密集，枝条细密，花
颜色白色或粉色。结实很早，果实和樱桃果实很相似，
味道和李子相似，酸甜合适，果实营养非常丰富，有核，
果实呈圆形，单个果实重 5 ～ 15 g，果实颜色呈黄色、红
色或紫红色，被称为“绿色天然钙粉”［2］，可以生食，也
可用于深加工。果实汁液深红色，出汁率高，是加工果
汁的优质材料。欧李种仁还可以药用，具有利尿、助消
化等功效，能治疗消化不良、水肿、肠胃停滞等疾
病［3］。欧李果实中含有丰富的矿物质、维生素、糖、蛋
白质、氨基酸等营养物质，蛋白的提取与分离通常采用
硫酸铵沉淀法，但过高浓度的盐离子容易破坏蛋白质
的活性及其构象;而双水相法利用聚乙二醇(PEG)/
无机盐体系的水溶液所形成的互不相容的双水相，通
过选择适宜的成相与分配条件，使蛋白质(酶)菌体
等生物大分子在两相中具有不同比例的分配，从而使
其得到分离与纯化［4］，这不仅为生物活性物质的提取
提供了温和的环境，使其活性及构象在提取时不易被
破坏，而且具有分离速度快、耗能小、成本低、回收率
高、易于放大和可连续化操作的特点［5，6］。
与其它常用的纯化蛋白的方法相比，双水相萃取
技术分离纯化蛋白质具有以下优势［7］:体系含水量
高，可达 80%以上;蛋白质在其中不易变性;界面张力
远远低于水，有机溶剂两相体系的界面张力，有助于强
化相际间的质量传递;分相时间短，一般只需 5 ～ 15
min;易于放大和进行连续性操作;萃取环境温和，生物
相容性高;聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用
等。正是由于双水相萃取技术的诸多优势，现已被广
泛用于蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等产品的分
离和纯化。
在蛋白质的分析研究方面，已做了大量的工作，蛋
白质的分离纯化方法比较完善，但国内对欧李蛋白质
分离提取工艺研究较少，所以应该对欧李蛋白质分离
提取工艺进行系统的研究并完善。本实验采用双水相
萃取技术通过筛选优化试验因素，建立了提取欧李种仁
蛋白的双水相体系对欧李种仁蛋白进行分离和纯化。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
挑选籽粒饱满、大小均匀成熟的欧李种子，手工剥
去外壳后，将种仁研磨成粉末，用石油醚脱脂风干后用
Tris-HCl缓冲溶液浸泡，离心得到蛋白质溶液，冷藏
备用。
1． 2 仪器与试剂
精密电子天平，UV-1 800 分光光度计，50 mL 滴定
管，移液管考马斯亮蓝 G-250，标准牛血清蛋白，PEG
4 000，硫酸铵，石油醚，乙醇，NaCl，95%乙醇，85%磷
酸，Tris-HCl缓冲溶液。
1． 3 方 法
1． 3． 1 试剂配制
考马斯亮蓝 G-250 溶液的配制:精确称取 100 mg
考马斯亮蓝 G-250，溶于盛有 50 mL 95% 乙醇的
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1 000 mL容量瓶中，并加入 100 mL 85%浓磷酸，然后，
用蒸馏水稀释并定容至刻度线。
牛血清蛋白溶液的配制:精确称取 0． 06 g 牛血清
蛋白，加入 0． 526 g NaCl，溶于含有少量蒸馏水的 500
mL容量瓶中，然后用蒸馏水稀释定容至刻度线，混匀，
即为 120 μg /mL的牛血清蛋白原液。
1． 3． 2 标准牛血清蛋白定制标准曲线
在 5 支试管中，分别精确吸取牛血清蛋白原液
0． 20 mL，0． 40 mL，0． 60 mL，0． 80 mL，1． 00 mL，用蒸馏
水全部稀释至 1． 0 mL，然后分别加入 5． 00 mL 考马斯
亮蓝溶液，混合均匀，于 25 ℃ 的恒温水浴中保温
10 min，冷水浴中冷却后，立即于蛋白质最大吸收波长
595 nm处比色测定。以 1． 00 mL 蒸馏水代替样品，加
入 5． 00 mL考马斯亮蓝溶液，其余操作同上，作空白对
照。以试管中标准蛋白的总含量为横坐标，相应的吸
光度值(A)为纵坐标作标准曲线图，并作线性回归，求
线性方程。
1． 3． 3 双水相体系的制备［8］
固定聚乙二醇 4 000 质量分数为 25%，不添加无
机盐，以不同质量分数的硫酸铵组成双水相体系，加入
2 mL稀释 1 000 倍的欧李种仁蛋白溶液，pH调至 7． 0，
4 ℃下萃取 4 h，测定双水相体系蛋白质的分配系数及
相比和萃取率，加样如表 1。
表 1 PEG /硫酸铵双水相体系 1 组成
PEG质量分数
(%)
硫酸铵质量分数(%)
1 2 3 4 5 6
25 20 25 26 28 30 35
固定硫酸铵质量分数为 30%，不添加无机盐，以
不同质量分数的聚乙二醇 4 000 组成双水相体系，加
入 2 mL稀释 1 000 倍的欧李种仁蛋白溶液，pH 调至
7． 0，4 ℃下萃取 4 h，测定各双水相体系蛋白质的分配
系数及相比和萃取率，加样如表 2。
表 2 PEG硫酸铵双水相体系 2 组成
硫酸铵质量分数
(%)
PEG质量分数(%)
1 2 3 4 5 6
30 20 22 24 25 30 35
双水相体系蛋白质的分配系数、回收率及相比计
算公式如下［9］:
分配系数 K = Ct /Cb;
相比 Ｒ = Vt /Vb;
回收率(%)Yt =上相蛋白质浓度 /上、下相总浓度
= CtVt /(CtVt + Cb、Vb) ;
Yb =下相蛋白质浓度 /上、下相总浓度
= CbVb /(CtVt + Cb、Vb)
式中:Ct、Cb分别代表上、下相蛋白质浓度;
Vt、Vb分别代表上、下相体积。
1． 3． 4 双水相体系相图的制备
配制质量分数 35%的硫酸铵溶液:精确称取硫酸
铵固体 35 g加入 65 g蒸馏水溶解，测定其密度。
精确称取 PEG 4 000 固体 3． 5 g溶解到 6． 5 g蒸馏
水中，用滴定管缓慢滴加已配好的硫酸铵溶液并不断
振荡使其混合均匀，观察溶液的澄清程度，直至试管内
溶液开始出现浑浊为止。记录硫酸铵溶液的加量
(mL)根据密度值求出质量(g)。然后加入 0． 5 mL 蒸
馏水，溶液澄清，继续向管中滴加硫酸铵溶液并不断混
匀，直至再次达到浑浊，如此反复操作。计算每次达到
浑浊时 PEG和硫酸铵在系统中的质量分数(g /g)。以
PEG的质量分数为纵坐标，硫酸铵的质量分数为横坐
标，即得到一条双节线的相图。
1． 3． 5 双水相体系中蛋白质最大萃取容量的测定
固定硫酸铵质量分数为 30%，以 22%质量分数的
聚乙二醇 4 000 组成双水相体系，缓慢滴加稀释 1 000
倍的欧李种仁蛋白溶液，不断反复操作，直至溶液由浑
浊变澄清记录滴加蛋白溶液的量，并计算出下相中蛋
白的含量。
2 结果与分析
2． 1 标准曲线及回归方程
由 1． 3． 2实验方法，通过分光光度计在波长 595 nm
条件下测得梯度浓度蛋白溶液的吸光度值记录如表 3。
表 3 595 nm波长下蛋白标准溶液的吸光度值
编号 0 1 2 3 4 5
标准蛋白(μ g ) 0 24 48 72 96 120
吸光度(A) 0． 000 0． 055 0． 144 0． 224 0． 323 0． 427
根据表中数据制作出标准曲线如图 1:
图 1 牛血清蛋白标准曲线
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问题探讨 李 佳 等:双水相体系提取欧李种仁蛋白的初步研究
表 4 PEG /硫酸铵双水相体系 1 数据
项目
体积(mL) 吸光度(A)
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
上液相 5 4． 5 4． 5 4 4 5 0． 232 0． 234 0． 260 0． 314 0． 250 0． 282
下液相 6 6． 5 8 8 9 7 0． 250 0． 265 0． 299 0． 355 0． 299 0． 320
表 5 PEG /硫酸铵双水相体系 2 数据
项目
体积(mL) 吸光度(A)
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
上液相 4 3． 5 3． 5 4 4． 5 5 0． 310 0． 270 0． 303 0． 289 0． 319 0． 271
下液相 7 7 7 7 7 7 0． 351 0． 316 0． 347 0． 333 0． 351 0． 284
根据标准曲线求得回归方程:
y = 0． 003 6 x － 0． 020 1;
式中:y 为吸光度;x 为蛋白质
量(μg)线性关系 Ｒ2 = 0． 991 9，可
见，蛋白含量在 0 ～ 120 μg 范围内
于 595 nm处吸光度关系良好。
2． 2 水相中分配系数、相比、回收
率的计算及最佳条件的确定
固定聚乙二醇 4 000 质量分数
为 25%，不添加无机盐，以不同质
量分数的硫酸铵组成双水相体系，通过分光光度计在
595 nm处测得溶液的吸光度值记录如表 4。
固定硫酸铵质量分数为 30%，不添加无机盐，以
不同质量分数的聚乙二醇 4 000 组成双水相体系，通
过分光光度计在 595 nm 处测得溶液的吸光度值记录
如表 5。
通过表 4 中溶液上下相的体积(mL)和吸光度
(A)计算出双水相体系 1 中蛋白的分配系数、相比、回
收率的数据记录如表 6。
通过表 5 中溶液上下相的体积(mL)和吸光度
(A)计算出双水相体系 2 中蛋白的分配系数、相比、回
收率的数据记录如表 7。
2． 2． 1 硫酸铵的质量分数对萃取的影响
当体系中只有聚乙二醇而没有硫酸铵时，体系不
形成双水相;当盐浓度增加到一定量后双水相形成对
总蛋白的分配来说，希望蛋白质尽量分配在下相中。
当 K达到最小值且小于 1 时，下相回收率最大时的双
水相体系为最佳提取条件［10］。
当 PEG 4 000 的质量分数量固定时(见表 6) ，分
配系数随着硫酸铵质量分数的增加而下降，当硫酸铵
浓度超过 30%时，K 又逐渐上升。在总体趋势中，相
比 Ｒ逐渐下降，Yb 先升高后降低。由此可知，硫酸铵
的用量可影响上、下相电位差，进而影响分配系数和萃
取率;高浓度硫酸铵不仅会破坏蛋白质表面的水化层，
使蛋白发生盐析，导致蛋白萃取率下降，而且还会扰
乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相体积
比［11］。在硫酸铵的质量分数为 30%时，分配系数最
小，为 0． 011，而下相回收率最大，达 94． 6%，由此可
知，最适提取条件的硫酸铵质量分数为 30%。
2． 2． 2 PEG的质量分数对萃取的影响
随着聚乙二醇质量分数的增加(见表 7) ，K 先下
降后上升且变化较大，Yb 先增大后减小，并在聚乙二
醇质量分数为 22． 0%时，K和 Yb都达到最佳值。总体
趋势下，相比 Ｒ 逐渐上升。从分配理论上解释，当聚
乙二醇用量较低时，硫酸铵的盐析作用起主要作用，使
蛋白质大多分布在下相。随着聚乙二醇质量分数的增
加，高黏度使相间分子转移能力变弱，相界面张力增
加，上、下相热力学特征差异增大，导致分配系数明显
变化［12］。由于在聚乙二醇质量分数 22%时，K 最小，
为 0． 087 7，Yb 达到最大，为 95． 8%，因此最佳提取条
件的聚乙二醇质量分数为 22%。
通过上述数据的分析可以确定该双相体系下最佳
条件为:硫酸铵的质量分数为 30%，PEG 的质量分数
为 22%。
表 6 双水相体系 1 中蛋白质 K、Ｒ、Y的数据
硫酸铵的质量分数
(%) K Ｒ
Yt
(%)
Yb
(%)
20 0． 646 0． 833 35 65
25 0． 373 0． 692 20． 5 79． 5
26 0． 226 0． 563 11． 3 88． 7
28 0． 172 0． 5 7． 9 92． 1
30 0． 011 0． 444 5． 4 94． 6
35 0． 241 0． 714 14． 7 85． 3
2． 3 PEG /硫酸铵双水相相图的制备
配制质量分数 35%的硫酸铵溶液:精确称取硫酸
铵固体 35 g 加入 65 g 蒸馏水溶解，测定其密度为
1． 236 g /mL。
表 7 双水相体系 2 蛋白质 K、Ｒ、Y的数据
PEG的质量分数(%) K Ｒ Yt(%) Yb(%)
20 0． 171 0． 571 8． 9 91． 1
22 0． 087 7 0． 5 4． 2 95． 8
24 0． 112 0． 5 5． 3 94． 7
25 0． 114 0． 571 6． 1 93． 9
30 0． 36 0． 643 18． 8 81． 2
35 0． 731 0． 714 34． 3 65． 7
通过反复操作，记录下加入硫酸铵溶液的体积
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(mL) ，计算出纯硫酸铵的累计量(g) ，PEG 和硫酸铵
的质量分数(%)记录如表 7。
表 8 双水相相图制作数据记录
硫酸铵
溶液加量
(mL) (g)
纯硫酸铵
累计量
(g)
溶液
累计总量
(g)
PEG质量
分数
(%)
硫酸铵
质量分数
(%)
1． 1 1． 36 0． 476 11． 36 30． 81 4． 19
0． 4 0． 494 0． 649 12． 354 28． 33 5． 25
0． 2 0． 247 0． 735 13． 101 26． 72 5． 61
0． 3 0． 371 0． 865 13． 972 25． 05 6． 19
0． 2 0． 247 0． 952 14． 719 23． 78 6． 47
0． 1 0． 124 0． 995 15． 343 22． 81 6． 49
0． 2 0． 247 1． 082 16． 09 21． 75 6． 72
0． 2 0． 247 1． 168 16． 837 20． 78 6． 94
0． 3 0． 371 1． 298 17． 708 19． 77 7． 33
0． 3 0． 371 1． 428 18． 579 18． 84 7． 68
0． 2 0． 247 1． 514 19． 326 18． 11 7． 83
0． 2 0． 247 1． 601 20． 073 17． 44 7． 97
通过表 8 中 PEG 和硫酸铵的质量分数的数据制
作出双水相相图如图 2。
图 2 双水相相图
2． 4 双水相体系最大萃取容量的确定
在确定了最佳双水相体系的组成后，利用 30%的
硫酸铵质量分数，PEG的质量分数为 22%组成双水相
体系。先测定体系的总体积为 9 mL，然后通过缓慢滴
加稀释的蛋白溶液，直至溶液由澄清变浑浊。反复操
作，记录滴加蛋白溶液的最大量为 11 mL。通过标准
曲线求得稀释蛋白溶液浓度 0． 095 mg /mL，因此在此
双水相体系下蛋白质的最大容量为 1． 045 mg。根据
表 6 和表 7 中 Yb 的值估算出下相中蛋白的量为
0． 995 mg。萃取率为:95． 2%。
3 结论与讨论
在 PEG /硫酸铵组成的双水相体系中，当 PEG
4 000的质量分数量固定时，通过改变硫酸铵的质量分
数，分配系数随着硫酸铵质量分数的增加而下降，当硫
酸铵浓度超过 30%时，K 又逐渐上升，K = 0． 011 时，
下相回收率最大，达 94． 6%;固定硫酸铵质量分数为
30%，改变 PEG 的质量分数，随着聚乙二醇质量分数
的增加，K先下降后上升且变化较大，Yb 先增大后减
小，并在聚乙二醇质量分数为 22． 0%时，K = 0． 087 7
和 Yb = 95． 8%都达到最佳值，确定蛋白萃取的最佳条
件:PEG质量分数为 22%，硫酸铵质量分数为 30%。
通过最佳条件的确定，使得下相回收率达到最佳
值为 95． 8%，具有减少蛋白流失、特异性强、有机试剂
用量少、不必脱盐处理的特点，从而简化了实验操作步
骤，更利于蛋白的分离纯化。PEG 和蛋白两者混合，
使得分离纯化蛋白时速度慢，消耗增加，同时还不易除
去 PEG;而在无机盐溶液中，很容易对蛋白质进行分
离纯化，从而得到纯化蛋白质。
在质量分数为 30%的硫酸铵和质量分数为 22%
的聚乙二醇4 000组成双水相体系中，体系体积为
9 mL，通过缓慢滴加稀释的蛋白溶液，直至溶液由澄清
变浑浊。反复操作，记录滴加蛋白溶液的量为 11 mL。
由此可以看出双水相体系与加入蛋白溶液的体积比接
近1 ∶ 1，易于放大和进行连续性操作，由实验室萃取蛋
白放大到工业生产中。
实验结果得出，PEG /硫酸铵萃取欧李种仁蛋白的
最佳条件:PEG 质量分数为 22%，硫酸铵质量分数为
30%，下相无机盐溶液中回收率最大为 95． 8%，能分
离纯化得到大量蛋白;最大萃取容量的测定得出双水
相体系与加入蛋白溶液的体积比接近1 ∶ 1，可以放大
到工业生产中，大规模分离纯化欧李种仁蛋白。
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收稿日期:2013 － 10 － 28
基金项目:国家自然科学基金(编号:NSFC 31060166)和云南省中青年学术技术带头人后备人才资助(编号:2012 HB 018)。
作者简介:刘 涛(1978 －) ，男，河南南阳人;博士，副教授，主要从事药用植物学研究。
通讯作者:赵银河(1967 －) ，女，副教授，主要从事发育遗传学研究。
大花蕙兰种子组织培养条件的探索
刘 涛， 张雪梅， 赵银河
(云南农业大学作物种质创新与可持续利用重点实验室， 昆明 650201)
The Study on Tissue Culture Conditions of Cyrnbidium hybridium Seed
LIU Tao，ZHANG Xue-mei，ZHAO Yin-he
摘要:对大花蕙兰种子组培和进一步进行原球茎增殖培养，种
子组织培养以 1 /2 MS 为基础培养基，分别在培养基中加不同
浓度的 6-BA和 NAA，分析大花蕙兰种子的萌发率和原球茎增
殖率。结果表明，随着 6-BA浓度的增加，萌发率增加，当 6-BA
浓度为 0． 5 mg /L 时达到最大，培养基配方为 1 /2 MS + 0． 5
mg /L 6-BA + 0． 2 mg /L NAA + 0． 02%活性炭和 10． 0 g /L琼脂的
培养基效果最好;在此基础上加入不同浓度的 NAA，得出原球
茎的增殖最佳培养基为 1 /2 MS + 0． 5 mg /L 6-BA + 0． 5 mg /L
NAA + 0． 02% 活性炭和 10． 0g /L 琼脂。生根培养基以
1 /2 MS + 0． 2 mg /L NAA + 10%香蕉汁 + 0． 02%活性炭和 10． 0
g /L琼脂为最佳。
关键词: 大花蕙兰;组织培养;萌发率;原球茎增殖率
中图分类号: S 682． 31 文献标志码: A
文章编号: 1001 － 4705(2014)03-0086-03
大花蕙兰(Cyrnbidium hybridium)为兰科兰属多年
生草本植物，是近几年在国际花卉市场上流行的高档
室内盆栽花卉及切花，因其花大，色泽鲜美，花期较长
(2 ～ 3 个月) ，且在冬春节日期间开放，所以具有极高
的观赏价值［1］。大花蕙兰是单子叶植物，为多年生草
本，附生、地生或腐生。大花蕙兰的组织培养始于 20
世纪 60 年代，Morel［2］采用大花蕙兰的茎尖，在含有细
胞分裂素的 KC 培养基上进行培养，茎尖分生组织膨
大形成类原球茎，并分化出根和叶，首次获得兰花无病
毒小植株。Wimber［3］对 Morel 的方法进行改进，采用
液体振荡培养的方法大大加快了原球茎的增殖速度，
短期内可以获得大量再生植株，此后组织培养技术在
兰花生产上得到了广泛的应用。
目前，兰花优良品种的获得主要以有性繁殖方式
获得种苗。因此，种子离体萌发技术的研究显得尤为
重要。兰花种子小，量多，绝大多数种类种子不具子叶
和胚乳，在自然条件下需要和真菌共生才能萌发。大
花蕙兰种子没有胚乳，传统繁殖方式为分株繁殖，繁殖
周期长，且繁殖率低，育种进展缓慢，难以满足规模化
生产的需要，现在繁殖方法一般为组织培养［4，5］。
刘晓青等［6］研究认为，以培养基 1 /2 MS + 2． 0
mg /L 6-BA + 0． 2 mg /L NAA + 100 ml /L 香蕉汁，增殖
效果最好，而李树和等［5］研究认为，1 /2 MS + NAA 0． 4
mg /L + 6-BA 1． 5 mg /L为最优的芽诱导培养基。兰种
子发芽萌发率达到较高的水平，加入香蕉汁则会对生
根起到促进作用，参入的活性炭对种子萌发和生根有
促进作用［7］。
本研究旨在为大花蕙兰种子的萌发、原球茎的增
殖和生根寻找最佳的培养条件。
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第 33 卷 第 3 期 2014 年 3 月 种 子 (Seed) Vol． 33 No． 3 Mar． 2014