全 文 ：第 32 卷 第 9 期
2013 年 9 月
分析测试学报
FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis)
Vol. 32 No. 9
1075 ～ 1080
收稿日期:2013 － 04 － 22;修回日期:2013 － 05 － 22
基金项目:国家“重大新药创制”科技重大专项(2011ZX09102 － 001 － 31);广东药学院师资队伍建设基金项目(52104109)
* 通讯作者:范华均，博士，教授，研究方向:药物提取分离及药物分析，Tel:020 － 39352135 ，E － mail:
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junhuafan@ 126. com
研究简报
聚焦微波辅助双水相萃取 /高效液相色谱法测定
农吉利中牡荆素与异牡荆素
朱 丹，何世玲，范华均* ，王李平，娄欣欣，万 强，臧林泉
(广东药学院 药科学院，广东 广州 510006)
摘 要:以乙醇 －硫酸铵双水相体系为萃取溶剂，采用聚焦微波辅助萃取法萃取农吉利中的牡荆素和异牡荆
素，HPLC测定，建立了微波辅助双水相萃取(FMAATPE)/HPLC 方法测定牡荆素和异牡荆素含量的分析方
法。利用单因素试验和正交试验设计方法优化了乙醇质量分数、微波功率、料液比、萃取时间等萃取条件以
及色谱分析条件。萃取优化条件为:双水相的组成:35%乙醇 － 16%硫酸铵，药材颗粒度:80 目，料液比:
1 ∶ 50，微波功率:140 W，萃取时间:20 min。以乙腈 － 0. 5%磷酸(14 ∶ 86)为流动相在 340 nm检测可较好
地分离目标组分。将该方法用于农吉利药材中牡荆素和异牡荆素的萃取测定，可获得满意结果，其回收率为
96. 9%～ 103. 8%，RSD为 1. 9%～ 2. 6%。
关键词:聚焦微波辅助萃取;双水相萃取;农吉利;牡荆素;异牡荆素
中图分类号:O657. 72;TQ460. 72 文献标识码:A 文章编号:1004 － 4957(2013)09 － 1075 － 06
doi:10. 3969 / j. issn. 1004 － 4957. 2013. 09. 008
Determination of Vitexin and Isovitexin in Crotalaria sessiliflora L． by Focused
Microwave-assisted Aqueous Two-phase Extraction Coupled with
High Performance Liquid Chromatography
ZHU Dan，HE Shi-ling，FAN Hua-jun* ，WANG Li-ping，LOU Xin-xin，WAN Qiang，ZANG Lin-quan
(College of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China)
Abstract:A new method for analysis of vitexin and isovitexin in Crotalaria sessiliflora L． was devel-
oped by focused microwave-assisted aqueous two-phase extraction(FMAATPE)coupled with high per-
formance liquid chromatography(HPLC)． The experimental factors，including ethanol concentration，
ratio of material to solvent，microwave power and extraction time were optimized based on the single
factor test and orthogonal test． The analysis was performed by HPLC with UV detection at 340 nm．
The mobile phase consisted of acetonitrile － water containing 0. 5% phosphoric acid(14 ∶ 86)． The
optimum extraction conditions were as follows:two-phase composition:35% ethanol － 16% ammoni-
um sulfate，ratio of material to solvent:1 ∶ 50，microwave power:140 W，extraction time:20
min． The method was applied in the determination of vitexin and isovitexin in Crotalaria sessiliflora
L．，with recoveries of 96. 9% －103. 8% and RSDs of 1. 9% －2. 6% ．
Key words:focused microwave-assisted extraction;aqueous two-phase extraction;Crotalaria sessil-
iflora L．;vitexin;isovitexin
农吉利(Crotalaria sessiliflora L．)是豆科猪屎豆属植物野百合的干燥全草，味淡，平，具有清热、
利湿、解毒等功能，可用于耳鸣、耳聋、头目眩晕及多种癌症(如皮肤癌、宫颈癌)等疾病的治疗。农
吉利中含有黄酮、生物碱、氨基酸等有效化学成分，其中黄酮类化合物具有抗炎、抗衰老和调节免疫
以及抗肿瘤等活性［1 － 2］。
双水相萃取(Aqueous two-phase system，ATPE)是利用两种聚合物(或一种聚合物与一种盐)之间的
分析测试学报 第 32 卷
不相溶性在水溶液中形成互不相溶的两相，基于被萃取物在两相中的分配能力差异而实现分离的一种
萃取技术［3］。该技术具有操作简单、不使用有毒试剂、萃取条件温和，以及易于连续化操作等特点，
广泛用于氨基酸［4 － 5］、蛋白质［6］、痕量元素［7 － 8］以及酶的萃取［9 － 10］。近年来随着乙醇等亲水溶剂 －盐
双水相体系的开发，使小分子物质尤其是天然药物中的有效成分也可以通过双水相体系得到快速萃取
分离［11 － 13］。
微波辅助萃取(Microwave-assisted extraction，MAE)是利用物质与微波相互作用产生的热效应和非
热效应快速、高效地萃取目标组分的技术，已广泛用于样品中有效成分的萃取和分离，主要包括密闭
微波辅助萃取 (PMAE)［14 － 15］、聚焦微波辅助萃取 (FMAE)［16］、微波辐射 － 溶剂回流萃取
(PMIRE)［16 － 18］等方式。与 PMAE的密闭高温、高压条件及样品处理量少相比，FMAE 可在常压下萃
取，设备简单、安全、处理量更大。笔者曾用甲醇和乙醇作为溶剂分别采用 PMIRE 和 PMAE 萃取农吉
利中的牡荆素和异牡荆素［19 － 20］，在此基础上本文以乙醇 －硫酸铵双水相体系作为萃取溶剂，基于该体
系可与微波发生较强的耦合作用，建立了聚焦微波辅助双水相萃取(FMAATPE)/HPLC 测定农吉利中
牡荆素和异牡荆素的方法，提高了萃取效率，同时利用 ATPE 的分相作用萃取除去杂质，实现了萃取
与样品净化一步完成，有利于后续分析测定，方法简单、快速、高效。
1 实验部分
1. 1 仪器与试剂
EXCEL全功能型微波化学工作平台(上海屹尧微波化学有限公司)，PJ21C － AN 微波炉(美的公
司)，Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，RE52CS － 1 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器
厂)，HH －6 恒温水浴锅(江苏金坛市宏华仪器厂)。
农吉利药材(产地:广西)，牡荆素标准品(中国药品生物制品检定所，批号:11687 － 200501)，
异牡荆素标准品(上海永恒生物科技有限公司，纯度 ＞ 98%)，(NH4)2SO4、无水乙醇为分析纯，乙腈、
甲醇为色谱纯。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 样品的萃取 称取 80 目药材 0. 4 g于圆底烧瓶中，加入 20 mL乙醇 －硫酸铵双水相萃取剂(乙
醇质量百分数为 35%，硫酸铵质量百分数为 16%)，置于微波炉中。在微波功率 140 W条件下萃取 20
min。静置，待萃取液分相后，取出上相在 60 ℃下旋蒸至干，残渣用甲醇溶解，定容至 10 mL，样品
液通过 0. 22 μm滤膜，用 HPLC分析。
1. 2. 2 HPLC分析 色谱柱(Phenomenon Gemini C18柱，4. 6 mm × 250 mm，5 μm);流动相:乙腈–
0. 5%磷酸(14 ∶ 86);检测波长:340 nm;流速:l mL /min;柱温:室温;进样量:10 μL。在此条件
下牡荆素和异牡荆素色谱峰的理论板数均在 10 000 以上。
2 结果与讨论
2. 1 单因素试验
2. 1. 1 双水相体系组成对萃取的影响 考察了双水相体系中乙醇质量百分数和硫酸铵质量百分数对牡
荆素和异牡荆素萃取的影响，结果如图1所示。由图 1可知，随乙醇质量百分数和硫酸铵质量百分数的增
大，牡荆素和异牡荆素萃取率先增大后减小。这是由于乙醇量增大会使萃取体系的极性减小，导致微波
与萃取溶剂作用减弱，不利于微波辅助萃取;而硫酸铵量的增大虽有利于提高萃取体系的极性，但会引
起上相体积(或相比 β)减小，目标物的萃取量有限。因此选择 33%乙醇 － 16%硫酸铵作为双水相体系，
以获得合适的相比 β和溶剂极性，以利于在微波作用下牡荆素和异牡荆素获得更高的萃取率。
2. 1. 2 药材颗粒度与料液比对萃取的影响 以质量百分数分别为 33%和 16%的乙醇 －硫酸铵双水相体
系作为萃取溶剂，分别试验了不同药材颗粒度和不同料液比对牡荆素和异牡荆素萃取的影响，结果如图 2
所示。由图 2可见，当药材颗粒度为 80目，料液比为 1 ∶ 50时，牡荆素和异牡荆素的萃取率达到最大。
2. 1. 3 微波辅助萃取条件对萃取的影响 分别考察了微波功率和萃取时间对牡荆素和异牡荆素萃取
的影响，结果显示，随着微波功率的增大，牡荆素和异牡荆素的萃取率逐渐减小。当微波功率为 140
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第 9 期 朱 丹等:聚焦微波辅助双水相萃取 /高效液相色谱法测定农吉利中牡荆素与异牡荆素
W，萃取时间为 15 min时，牡荆素和异牡荆素可达到较高的萃取率。
2. 2 正交试验优化萃取条件
根据单因素试验的结果，选择乙醇质量百分数、料液比、微波功率、萃取时间 4 个因素，以牡荆
素和异牡荆素的萃取率为指标，采用 L9(3
4)正交实验设计(表 1)试验，结果见表 2 ～ 3。
表 1 正交试验因素水平设计表
Table 1 The levels of the factor with orthogonal experimental design
Level
(水平)
Factor
A
Ethanol concentration (%)
B
Ratio of material to solvent (g ∶ mL)
C
Microwave power(W)
D
Extraction time (min)
1 30 1 ∶ 40 140 10
2 33 1 ∶ 50 280 15
3 35 1 ∶ 60 420 20
表 2 正交试验设计及测定结果
Table 2 Results of L9(3
4)orthogonal experiment
No．
Factor Yield w /(μg·g － 1)
A B C D Vitexin(牡荆素) Isovitexin (异牡荆素)
1 1 1 1 1 401. 2 246. 9
2 1 2 2 2 420. 4 252. 6
3 1 3 3 3 443. 3 262. 2
4 2 1 2 3 368. 8 228. 9
5 2 2 3 1 455. 9 271. 2
6 2 3 1 2 504. 7 309. 4
7 3 1 3 2 398. 2 235. 5
8 3 2 1 3 527. 3 319. 7
9 3 3 2 1 450. 5 269. 2
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分析测试学报 第 32 卷
(续表 2)
No．
Factor Yield w /(μg·g － 1)
A B C D Vitexin(牡荆素) Isovitexin (异牡荆素)
Vitexin K1 1 264. 9 1 168. 2 1 433. 2 1 307. 6
K2 1 329. 4 1 403. 6 1 239. 7 1 323. 3
K3 1 376 1 393. 5 1 297. 4 1 339. 4
R 111. 1 235. 4 193. 5 31. 8
Isovitexin K1 761. 7 711. 3 876 787. 3
K2 809. 5 843. 5 750. 7 797. 5
K3 824. 4 840. 8 768. 9 810. 8
R 62. 7 132. 2 125. 3 23. 5
表 3 方差分析结果
Table 3 Results of variance analysis
Source
Vitexin(牡荆素) Isovitexin(异牡荆素)
Sum of squares F value P value Sum of squares F value P value
A 2 075. 00 12. 31 ＞ 0. 05 715. 35 7. 73 ＞ 0. 05
B 12 053. 03 71. 51 ＜ 0. 05 3 806. 04 41. 11 ＜ 0. 05
C 6 579. 24 39. 03 ＜ 0. 05 3 055. 75 33. 01 ＜ 0. 05
Error(D) 168. 55 92. 58
从表 2 ～ 3 可以看出，影响牡荆素和异牡荆素萃取的因素大小顺序为:料液比 ＞微波功率 ＞乙醇质
量百分数 ＞ 萃取时间，其中以料液比和微波功率对目标物的萃取率影响显著。最佳萃取条件为
A3B2C1D3，即乙醇质量百分数为 35%，料液比为 1 ∶ 50，微波功率为 140 W，萃取时间为 20 min。
2. 3 萃取方法的比较
基于优化的萃取条件，以乙醇 －硫酸铵双水相体系作为萃取溶剂，分别采用聚焦微波辅助双水相
萃取(FMAATPE)、加热回流萃取(萃取温度:90 ℃，萃取时间:100 min)、超声萃取(室温，萃取时
间:60 min)、密闭微波辅助萃取(PMAE)(萃取温度:80 ℃，萃取时间 8 min)等方法，以及以乙醇和
水分别作为萃取溶剂在相同的聚焦微波辅助萃取(FMAE)条件(功率:140 W，萃取时间:20 min)下进
行萃取，结果如表 4。
表 4 不同方法萃取农吉利中牡荆素和异牡荆素的测定结果(n = 3)
Table 4 Results of determination of viteixn and isovitexin in Crotalaria
sessiliflora L． by different extraction methods
Extraction method Extraction solvent Extract feature
Vitexin(牡荆素) Isovitexin(异牡荆素)
Yield
w /(μg·g － 1)
RSD
sr /%
Yield
w /(μg·g － 1)
RSD
sr /%
FMAE Ethanol /(NH4)2 SO4 Dark brown / light brown 524. 8 1. 4 316. 5 0. 94
Reflux extraction Ethanol /(NH4)2 SO4 Dark brown / light brown 389. 2 1. 9 248. 1 1. 4
Ultrasonic extraction Ethanol /(NH4)2 SO4 Dark brown / light brown 365. 4 1. 8 232. 0 2. 3
PMAE Ethanol /(NH4)2 SO4 Dark brown / light brown 242. 4 2. 5 160. 4 1. 9
FMAE Ethanol Yellow green 153. 0 2. 0 106. 5 1. 1
FMAE Water Light brown 37. 35 2. 1 12. 18 1. 4
由表 4 可知，采用 FMAATPE法，牡荆素和异牡荆素的萃取率明显高于加热回流萃取、超声萃取
和 PMAE法;以乙醇 －硫酸铵双水相体系为萃取溶剂比乙醇和水单一溶剂的萃取效果更好，在同样的
聚焦微波辅助作用下具有更高的萃取率。结果表明，采用 FMAE 萃取方式，以乙醇 －硫酸铵双水相体
系为萃取溶剂更适合于农吉利药材中牡荆素和异牡荆素的萃取。
2. 4 HPLC分析
2. 4. 1 HPLC分析方法及系统适用性 采用 HPLC法对牡荆素和异牡荆素的混合标准品溶液和样品萃
取液进行分析，并对其实验条件进行优化。结果表明，以乙腈 － 0. 5%磷酸(14 ∶ 86)作为流动相，在
340 nm波长处检测时，牡荆素和异牡荆素可以得到较好的分离，其保留时间分别为 30. 66、34. 77 min，
分离度 R大于 1. 5，理论塔板数为28 162(以牡荆素计)。图 3 为优化条件下牡荆素和异牡荆素标准品
及样品萃取液的 HPLC色谱图。
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第 9 期 朱 丹等:聚焦微波辅助双水相萃取 /高效液相色谱法测定农吉利中牡荆素与异牡荆素
图 3 牡荆素和异牡荆素混合标准品溶液(A)和样品萃取液(B)的 HPLC色谱图
Fig. 3 HPLC chromatograms of vitexin and isovitexin mixed standard(A)and the solution extracted
from Crotalaria sessiliflora L． (B)
2. 4. 2 线性关系与检出限 在优化条件下，分别取一定量牡荆素和异牡荆素的标准溶液，配制成一
系列浓度的混合标准溶液，进样 10 μL，以峰面积(A)和质量浓度(C，mg·L －1)绘制标准曲线;按信
噪比 S /N = 3 计算检出限。结果表明，牡荆素和异牡荆素在 0. 208 ～ 20. 08 mg·L －1范围内均呈良好的线
性关系，其回归方程分别为 A = 51 414C + 6. 391 9(r = 0. 999 8)和 A = 49 077C + 6. 899 6(r = 0. 999 8)，
检出限分别为 0. 050 4、0. 041 1 mg·L －1。
2. 4. 3 精密度、稳定性及重复性 对样品溶液连续进样 5 次，得到牡荆素和异牡荆素的 RSD 分别为
0. 73%和 0. 81%，表明仪器精密度良好;取混合标准溶液配制 2、4、6、8、10、12 h 后分别进样，测
得牡荆素和异牡荆素的 RSD分别为 0. 64%和 1. 4%，表明萃取液中的 2 种黄酮化合物在 12 h内保持稳
定。取样品 6 份按本方法进行测定，测得牡荆素和异牡荆素的 RSD分别为 1. 4%和 0. 94%，表明方法
的重复性良好。
2. 4. 4 回收率实验 准确称取药材 0. 4 g各 5 份，分别加入一定量的牡荆素和异牡荆素混合标准品溶
液，按实验方法进行萃取和测定，计算牡荆素和异牡荆素的回收率，结果见表 5。牡荆素和异牡荆素
的回收率在 96. 9%～103. 8%之间，其 RSD分别为 2. 6%和 1. 9%，满足分析测定的要求。
表 5 牡荆素和异牡荆素加标回收试验结果
Table 5 Results of recovery test for vitexin and isovitexin
No．
Vitexin(牡荆素) Isovitexin(异牡荆素)
Content
w /(μg·g － 1)
Added
w /(μg·g － 1)
Found
w /(μg·g － 1)
Recovery
R /%
RSD
sr /%
Content
w /(μg·g － 1)
Added
w /(μg·g － 1)
Found
w /(μg·g － 1)
Recovery
R /%
RSD
sr /%
1 516. 86 530 1 066. 99 103. 8 2. 6 313. 55 318 633. 77 100. 7 1. 9
2 513. 25 530 1 052. 26 101. 7 311. 53 318 635. 26 101. 8
3 522. 05 530 1 045. 16 98. 7 317. 36 318 634. 09 99. 6
4 531. 06 530 1 068. 48 101. 4 318. 21 318 632. 40 98. 8
5 514. 21 530 1 029. 37 97. 2 312. 59 318 620. 74 96. 9
2. 5 实际样品分析
称取 0. 4 g 80 目的农吉利药材(产地广西，批号:20120926)3 份，分别加入 20 mL 萃取溶剂(乙
醇 －硫酸铵双水相体系，其质量百分数分别为 35%和 16%)，在 140 W微波功率下萃取 20 min，萃取
液按“1. 2. 1”方法处理后，用 HPLC法按“1. 2. 2”色谱条件测定。测得农吉利药材中牡荆素和异牡
荆素的萃取率分别为 528. 3 μg·g －1和 319. 8 μg·g －1，其相对标准偏差 RSD值分别为 1. 7%和 1. 0%。
该法准确、可靠，可直接用于农吉利药材中牡荆素和异牡荆素的测定。
3 结 论
本文将聚焦微波辅助萃取与双水相萃取技术结合，以乙醇 －硫酸铵双水相体系为萃取溶剂，通过
单因素试验和正交试验优化了聚焦微波辅助双水相萃取农吉利中牡荆素和异牡荆素的萃取条件，建立
了 FMAATPE /HPLC法测定农吉利中的牡荆素和异牡荆素的方法。该方法具有样品处理量大、设备简
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分析测试学报 第 32 卷
单、操作方便、萃取效率高、不使用有毒试剂等优点，用于农吉利药材中牡荆素和异牡荆素的萃取与
测定，结果满意。
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