全 文 ：基金项目：国家自然科学基金资助项目（编号：２１６６００９）；海南省省级
创新训练项目（编号：２０１３１１６５８０）；海口市应用技术研究
与开发项目（编号：２０１４－９０）；海南师范大学大学生科研项
目（编号：ＸＳＫＹ２０１５１２）
作者简介：马艺丹 （１９９０—），女，海南师范大学在读硕士研究生。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｍ１８７８９１９５５３５＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者：刘红
收稿日期：２０１５－０７－０９
第３１卷第６期
２ ０ １ ５年１ １月
Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．６
Ｎｏｖ．２ ０ １ ５
ＤＯＩ：１０．１３６５２／ｊ．ｉｓｓｎ．１００３－５７８８．２０１５．０６．０４１
神秘果种子多酚超声双水相复合提取工艺及
其抗氧化活性
Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｔｗｏ－ｐｈａｓｅ ａｑｕｅｏｕｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｏｆ Ｓｙｎｅｓｐａｌｕｍ ｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍ
马艺丹１
ＭＡ Ｙｉ－ｄａｎ１
刘 红１，２
ＬＩＵ Ｈｏｎｇ１，２
廖小伟１
ＬＩＡＯ Ｘｉａｏ－ｗｅｉ１
闫瑞昕１
ＹＡＮ Ｒｕｉ－ｘｉｎ１
戚金玲１
ＱＩ Ｊｉｎ－ｌｉｎｇ１
（１．海南师范大学化学与化工学院，海南 海口 ５７１１２７；２．热带特色药食同源植物
研究与开发重点实验室，海南 海口 ５７１１２７）
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈａｉｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｉｋｏｕ，Ｈａｉｎａｎ５７１１２７，Ｃｈｉｎａ；２．Ｋｅｙ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｎ Ｔｏｐｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｅｄｉｂｌｅ Ｐｌａｎｔ，Ｈａｉｋｏｕ，Ｈａｉｎａｎ５７１１２７，Ｃｈｉｎａ）
摘要：利用超声波与双水相体系复合提取神秘果种子多酚，
研究不同条件下提取的多酚的抗氧化能力。分别考察丙酮
浓度、硫酸铵用量、超声波温度、超声波时间、料液比对神秘
果种子多酚提取率的影响；采用单因素试验及响应面设计，
优化神秘果种子多酚提取工艺。结果表明，最佳提取工艺条
件为：丙酮浓度５０％、硫酸铵用量０．２２ｇ、超声波温度６０℃、
超声波时间１００ｍｉｎ、液料比１∶２０（ｍ∶Ｖ），多酚理论提取率
为１１．５４％。该条件下神秘果种子多酚的平均提取率为
１１．５６％。该体系提取的多酚纯度为８７．８５％，优于单独采用
超声波提取，可实现初步纯化。抗氧化性试验结果表明，神
秘果种子多酚提取物对ＤＰＰＨ·的清除能力和还原能力较
强，且还原力和ＤＰＰＨ·清除率与总多酚含量呈正比关系；
其抗氧化活性强于抗坏血酸。
关键词：神秘果种子；多酚；超声波提取；双水相；抗氧化性
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｏｆ Ｓｙｎｅｓｐａｌｕｍ ｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍ ｗａｓ ｕｎｔｒａｓｏｎｉｆｉｅｄ ｉｎ
ｔｈｅ ａｃｅｔｏｎｅ－（ＮＨ４）２ＳＯ４ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ－ｐｈａｓｅ ｓｙｅｔｅｍ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｏｔａｌ
ｐｏｌｙｐｈｅｎｉｌｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ａｎ－
ｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ａｃｅｔｏｎｅ ｗａｓ ｃｈｏｓｅｎ ａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｅ ａｃｅｔｏｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ａ－
ｍｏｕｎｔ ｏｆ ｔｈｅ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｔｈｅ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａ－
ｔｕｒｅ，ｒａｔｉｏ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｔｏ ｓｏｌｉｄ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒ－
ｉｍｅｎｔ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ：ｔｈｅ ｃｏｎ－
ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｏｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５０％，ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ １００ｍｉｎ ａｎｄ ｅｘ－
ｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ６０℃，ｒａｔｉｏ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｔｏ ｓｏｌｉｄ ２０∶１（Ｖ∶ｍ）．
Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｐｏｌｙｐｈｅｎｉｌｓ ｗａｓ １１．５４％ｉｎ
ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｕ－
ｐｌｉｃａｔｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｗａｓ １１．５６％，ｉｔ ｉｎｄｉｃａ－
ｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｗａｓ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｓｔａｂｌｅ．Ｔｈｅ
ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｓ ８７．８５％，ｓｕｐｅｒｉｏｒ
ｔｏ ｏｎｌｙ ｕｓｅ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ，ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃａｎ ｂｅ ｒｅａｌｉｚｅｄ．Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｈａｓ ｓｔｒｏｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ
ｒｅｍｏｖｉｎｇ ＤＰＰＨ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐｏｗｅｒ ａｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｈｅ－
ｎｏｌ ｃｏｎｔｅｎｔ．Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ＤＰＰＨ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｒａｔｅ ｂｙ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ
ｗａｓ ｕｐ ｔｏ ６２％，ｈｉｇｈｅｒ ｔｈｅｎ ｔｈａｔ ｂｙ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｙｎｓｅｐａｌｕｍ ｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍｓｅｅｄ；ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ；ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｅｘ－
ｔｒａｃｔｉｏｎ；ｔｗｏ－ｐｈａｓｅ ａｑｕｅｏｕｓ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ
神秘果（Ｓｙｎｓｅｐａｌｕｍ ｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍ）为山榄科神秘果属，四
季常绿的植物。原产于西非热带地区，如今在中国海南、云
南、广西等省份也有大面积种植［１］。神秘果含有一种变味蛋
白酶（又称神秘果素），吃过任何酸的食物再吃神秘果都会变
甜，可以作为天然且安全的食品。研究［２］表明，神秘果除了
具有能改变味觉功能外，其种子还可以促进胰岛素分泌，是
用于治疗糖尿病、高血压的天然药物。神秘果中含有大量多
酚，具有较好的抗氧化性［３］。因此，可作为抗氧化药物的潜
在资源，在制药与食品工业中具有良好的应用前景。植物多
酚在抗氧化、抗辐射、抑菌、抗癌和预防心脑血管疾病等方面
具有显著功效［４］。因此，受到越来越多人的关注和研究［５］。
常用于提取多酚的方法有：溶剂浸提法、微波辅助提取
法、超临界流体萃取法、超声波提取法等［６］。其中超声波提
３７１
取法是最常用的，其主要是利用超声波的空化效应，可以在
较短的时间内，使所提取的物质大量溶出且不会破坏其活
性［７］，从而大大增加了提取率。双水相萃取技术是目前一种
较为先进的分离技术，它的特点是设备简单、反应条件温和、
可以在短时间内使目标成分的提取率达到最高［８］。目前，此
技术已广泛应用于食品、化工，以及天然产物活性成分的
分离。
研究［９］表明，醇—无机盐型双水相体系优于传统聚合
物—盐双水相体系，其优点是价廉、溶剂易回收及后续处理
简单，且体系极性较大，适用于极性物质的提取与分离。但
尚未见此法用于提取神秘果种子多酚的相关报道。因此，本
试验拟通过丙酮—硫酸铵双水相体系与超声波复合提取神
秘果种子多酚，并在单因素试验的基础上，采用多元二次回
归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程
的分析，确定最佳提取工艺参数，同时研究不同条件下提取
的神秘果种子多酚对ＤＰＰＨ的清除能力和还原力，为深度开
发利用神秘果种子资源提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料与仪器
１．１．１ 材料与试剂
神秘果种子：采摘于海南省保亭县；
没食子酸标准品：分析纯，上海金穗生物科技有限公司；
福林酚试剂：分析纯，美国Ｓｉｇｍａ公司；
无水碳酸钠、丙酮、石油醚：分析纯，国药集团化学试剂
有限公司。
１．１．２ 主要仪器设备
超声波清洗仪：ＸＯ－５２００ＤＴＳ型，南京先欧仪器制造有
限公司；
双光束紫外可见分光光度计：ｉ８型，济南海能仪器股份
有限公司；
实验室纯水机：Ｕｎｉｑｕｅ－Ｒ１０（ＵＶ＋ＵＦ）型，厦门锐思捷
科学仪器有限公司；
电子天平：ＴＰ－２１４型，丹佛仪器北京有限公司；
数显恒温水浴锅：ＨＨ－１型，江苏智博瑞仪器制造有限
公司。
１．２ 方法
１．２．１ 神秘果种子多酚提取工艺
神秘果种子→粉碎过筛（６０目）→石油醚脱脂→双水相
体系一次超声浸提→静置分层→上层为浸提液→经Ｘ－５大
孔吸附树脂纯化→冷冻干燥→神秘果种子多酚粉末
１．２．２ 神秘果种子的脱脂预处理 将充分干燥的神秘果种
子粉碎，过６０目筛，加入３倍体积的石油醚超声脱脂３次，
每次５０ｍｉｎ，抽滤后挥干石油醚。脱脂后的种子粉末４０℃
烘干至恒重，置于干燥器中备用。
１．２．３ 多酚标准曲线的建立 参照文献［１０］，并根据实际
情况摸索后调整如下：精密称取没食子酸对照品０．１ｇ，用蒸
馏水溶解，配制１００μｇ／ｍＬ 的标准液。准确量取０．００，
０．０５，０．１０，０．１５，０．２０，０．２５，０．３０，０．３５ｍＬ于８个１０ｍＬ
容量瓶，分别精确移取２ ０００，１ ９５０，１ ９００，１ ８５０，１ ８００，
１ ７５０，１ ７００，１ ６５０μＬ蒸馏水于８个容量瓶中，摇匀，分别加
２ｍｏｌ／Ｌ福林试剂１．０ｍＬ，静置６ｍｉｎ后分别加入１０％的碳
酸钠溶液１．０ｍＬ，置于２５℃水浴中避光静置２ｈ，测定溶液
在７６５ｎｍ处的吸光值（Ａ７６５）。
１．２．４ 提取溶剂的选择 精确称取４份１．０ｇ神秘果种子
粉末于带塞锥形瓶中，在超声波功率为２００Ｗ，超声时间为
１００ｍｉｎ，超声波槽内温度为６０℃，料液比为１∶２０（ｍ∶Ｖ）
的条件下，分别加入（５０％甲醇、５０％乙醇、５０％丙酮、超纯
水）进行提取，提取１次，提取液离心１５ｍｉｎ。取上清液
３０μＬ按照标准曲线操作，测定７６５ｎｍ 吸光值，并计算总多
酚含量以及提取率。比较不同溶剂对神秘果种子多酚提取
率的影响。
１．２．５ 丙酮—硫酸铵双水相体系 在带塞锥形瓶中加入浓
度分别为４０％，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％的丙酮溶液，并
控制硫酸铵用量为０．１０，０．１２，０．１４，０．１６，０．１８，０．２０，０．２２，
０．２４，０．２８ｇ使之形成双水相体系［１１］。
１．２．６ 神秘果种子多酚的提取及提取率测定 精确称取
１．０ｇ预处理好的神秘果种子样品，置于１００ｍＬ带塞锥形瓶
中，按不同的料液比加入不同浓度的丙酮和硫酸铵形成双水
相体系，浸泡３０ｍｉｎ，按不同的超声时间和提取温度提取
１次，超声波功率为２００Ｗ，趁热抽滤，滤液于分液漏斗中静
置分层，取上层丙酮相３０μＬ按照１．２．３的操作，在７６５ｎｍ
波长下测定吸光值，根据回归方程计算提取液中多酚的含
量，并按式（１）计算神秘果种子总多酚提取率。
Ｒ＝ｍ１ｍ２×
１００％ （１）
式中：
Ｒ———神秘果种子多酚的提取率（以没食子酸计），％；
ｍ１———提取的多酚的质量，ｇ；
ｍ２———神秘果种子的质量，ｇ。
１．２．７ 单因素试验设计
（１）丙酮浓度和硫酸铵的比例对多酚提取率的影响：固
定料液比为１∶２０（ｍ∶Ｖ），超声波时间为４０ｍｉｎ，超声波槽
内温度为５０ ℃。考察不同浓度（４０％，５０％，６０％，７０％，
８０％，９０％）的丙酮溶液和不同质量（０．１０，０．１２，０．１４，０．１６，
０．１８，０．２０，０．２２，０．２４，０．２８ｇ）的硫酸铵形成双水相体系时
的比例对多酚提取率的影响。
（２）超声波温度对多酚提取率的影响：固定丙酮浓度为
５０％和硫酸铵用量为０．２２ｇ，料液比为１∶２０（ｍ∶Ｖ），超声
时间为４０ｍｉｎ。考察不同温度（３０，４０，５０，６０，７０，８０℃）对多
酚的提取率的影响。
（３）超声波时间对多酚提取率的影响：固定丙酮浓度为
５０％和硫酸铵用量为０．２２ｇ，超声波温度为６０℃，料液比为
１∶２０（ｍ∶Ｖ）。考察不同超声波时间（４０，６０，８０，１００，１２０，
１４０ｍｉｎ）对多酚的提取率的影响。
（４）料液比对多酚提取率的影响：固定丙酮浓度为５０％
和硫酸铵用量为０．２２ｇ，超声波温度为６０℃，超声波时间为
１００ｍｉｎ，考察不同料液比（１∶１０，１∶２０，１∶３０，１∶４０，１∶
４７１
提取与活性 ２０１５年第６期
５０，１∶６０，ｍ∶Ｖ）对多酚的提取率的影响。
１．２．８ 响应曲面法试验设计 以单因素试验的结果为基
础，采用统计分析软件Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔ ８．０根据Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ
中心组合设计原理设立响应面试验，以丙酮浓度、超声温度、
超声时间３个因素为试验因子，以神秘果种子多酚提取率为
评价指标，建立３因素３水平的响应面分析法，进行二次多
项回归方程拟合及其优化分析。
１．２．９ 神秘果种子多酚的纯化及纯度的测定 采用最佳提
取工艺提取神秘果种子多酚类成分，经过大孔树脂Ｘ－５柱层
析进一步纯化，用７０％的乙醇洗脱，将洗脱液减压旋转蒸发，
浓缩液用冷冻干燥机真空冻干，得神秘果种子多酚样品粉
末，备用。分别称取一定量的未经大孔树脂纯化的粗多酚粉
末和纯化后的多酚粉末，配制成水溶液，采用Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ
法［１２］测定多酚含量，并按式（２）计算多酚的纯度。
Ｐ＝ｍ３ｍ４×
１００％ （２）
式中：
Ｐ———多酚的纯度（以没食子酸计），％；
ｍ３———多酚的质量，ｇ；
ｍ４———多酚粉末的质量，ｇ。
１．２．１０ 神秘果种子多酚抗氧化性
（１）清除ＤＰＰＨ·能力测定：参照文献［１３］修改如下：精
确称量 ＤＰＰＨ· 粉末，避光，用乙醇溶液配制，浓度为
１．０１４ ４×１０－４ ｍｏｌ／Ｌ。以抗坏血酸为对照，经试验测得抗坏
血酸的半数抑制浓度为０．２３ｍｇ／ｇ。不同提取条件下的提
取液浓缩冷冻干燥成粉末后，加蒸馏水配制成浓度均为
０．２３ｍｇ／ｇ的样液。分别向试管中加入各样品１ｍＬ及３ｍＬ
ＤＰＰＨ·的乙醇溶液，混合均匀后于室温下避光放置３０ｍｉｎ，
以１ｍＬ丙酮和３ｍＬ乙醇的混合液作为参比测定５１７ｎｍ
处测定吸光值，记为Ａ１样品；同法，用等体积的无水乙醇代
替提取液，测定吸光值，记为Ａ２对照；以及１ｍＬ不同条件提
取液与３ｍＬ无水乙醇混合液，测定吸光值，记为Ａ０空白。
平行试验３次，取平均值。ＤＰＰＨ·清除率（ｙＤＰＰＨ）按式（３）
计算：
ｙＤＰＰＨ＝１－Ａ１－Ａ２Ａ０
×１００％ （３）
（２）还原能力的测定：采用铁氰化钾法［１４］。取１０ｍＬ洁
净干燥的试管，先分别加入１ｍＬ提取液，再加入０．２ｍｏｌ／Ｌ
的磷酸盐缓冲溶液（ｐＨ ６．６）和１％（ｍ／Ｖ）Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６各
２．５ｍＬ。混合后，于５０℃恒温水浴避光反应２０ｍｉｎ，之后加
入２．５ｍＬ １０％（ｍ／Ｖ）的三氯乙酸，１ ０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。
取２．５ｍＬ上清液，加入２．５ｍＬ蒸馏水和０．５ｍＬ ０．１％（ｍ／
Ｖ）ＦｅＣｌ３，充分混合后于７００ｎｍ处测定吸光值Ａ。
２ 结果与分析
２．１ 多酚标准曲线的确定
通过对不同质量浓度的没食子酸吸光值的测定，得到没
食子酸质量浓度（Ｘ，μｇ／ｍＬ）与吸光值Ｙ 之间的线性回归方
程为Ｙ＝０．０１３ ９２ Ｘ＋０．０３６ ９２（Ｒ２＝０．９９９ ５），说明线性关
系较好。
２．２ 溶剂的选择
采用中等浓度的溶剂提取，测定时会减少脂类物质的干
扰，便于比较和筛选最佳溶剂。因此，分别以浓度５０％的甲
醇、乙醇、丙酮溶液以及超纯水进行超声波辅助提取试验，提
取率依次为丙酮（１１．５６％）、乙醇（１０．４０％）、甲醇 （９．８１％）、
超纯水（５．３５％）。故本试验以丙酮为溶剂提取神秘果种子
多酚。同时，丙酮浓度对提取率也会有所影响，且不同浓度
的丙酮与硫酸铵形成的最佳双水相体系时硫酸铵的用量也
不同。因此，将同时考虑丙酮浓度和硫酸铵用量对多酚提取
率的影响。
２．３ 单因素试验结果分析
２．３．１ 丙酮浓度和硫酸铵用量对多酚提取率的影响 由
图１可知，在不同浓度的丙酮与硫酸铵形成的双水相体系
中，多酚的提取率均随着硫酸铵用量的增大呈先上升后下降
的趋势。同时不同浓度的丙酮形成的双水相对多酚提取率
的影响很大，这是由于浓度过大，使亲脂性物质大量溶出，从
而使通透性下降，干扰因素也随之增大。虽然６０％丙酮和
０．１８ｇ硫酸铵体系的提取率也较高，但会造成有机溶剂的浪
费。因此，选择５０％的丙酮作为提取溶剂，并加０．２２ｇ硫酸
铵使多酚提取率达到最大。
图１ 丙酮浓度和硫酸铵用量对多酚提取率的影响
Ｆｉｇｕｒｅ １ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｅｔｏｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ
（ＮＨ４）２ＳＯ４ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄ
２．３．２ 超声温度对多酚提取率的影响 由图２可知，多酚
的提取率随超声温度的升高呈先增大后减小的趋势。在
６０℃时，提取率达到最大值为８．９２％。这可能是由于在一
定温度范围内，升高温度使传速率增大从而使多酚更容易浸
出；若温度过高，多酚易发生降解和部分氧化。因此，选择超
声温度为６０℃。
图２ 超声温度对多酚提取率的影响
Ｆｉｇｕｒｅ ２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄ
５７１
第３１卷第６期 马艺丹等：神秘果种子多酚超声双水相复合提取工艺及其抗氧化活性
２．３．３ 超声时间对多酚提取率的影响 由图３可知，超声
时间在４０～１００ｍｉｎ时，随着时间延长多酚提取率也随之增
加；当超声时间为 １００ ｍｉｎ时，多酚提取率达到最大为
１１．４９％；继续延长超声时间，多酚提取率反而减少。这是由
于开始时多酚含量较大，延长时间多酚很容易溶出且速率较
快。延长超声时间，总多酚含量越来越少，且更多的多酚被
氧化，导致多酚提取率降低［１５］。因此，选择超声时间为
１００ｍｉｎ。
图３ 超声时间对多酚提取率的影响
Ｆｉｇｕｒｅ ３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄ
２．３．４ 液料比对多酚提取率的影响 由图４可知，料液比
在１∶１０～１∶２０（ｍ∶Ｖ）时，随着液料比增大，提取率随之增
大；当液料比达到１∶２０（ｍ∶Ｖ）时，多酚提取率达到最大；继
续加大液料比，多酚提取率基本保持平缓且略有下降。这是
由于提取过程中，溶液用量越大相应的传质动力就越大，酚
类物质更易溶出。但是，在产生相同热量的同时，增大溶剂
的用量使提取温度相对降低，固相和液相之间的平衡降低，
导致提取率的降低。综合考虑经济因素，选择料液比为１∶
２０（ｍ∶Ｖ）。
图４ 料液比对多酚提取率的影响
Ｆｉｇｕｒｅ ４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｏｎ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄ
２．４ 响应面法优化试验结果与分析
２．４．１ 响应面法优化方案设计与试验结果 在单因素试验
中，料液比过高或过低对提取率变化不明显。因此，将其固
定为１∶２０（ｍ∶Ｖ）。其它因素与水平设计见表１。
２．４．２ 响应曲面模型的建立与分析 通过Ｄｅｓｉｇｎ ｅｘｐｅｒｔ软
件对表２数据进行多次线性拟合，建立神秘果种子多酚提取
率与丙酮浓度、提取温度、超声时间３个因素的二次多项回
归模型方程：
Ｙ＝１１．４９８ ００＋０．２６２ ５０Ｘ１－０．０３５ ００Ｘ２－０．０３２ ５０Ｘ３＋
０．０７２ ５０ Ｘ１Ｘ２ －０．０３２ ５０ Ｘ１Ｘ３ ＋０．０８２ ５０ Ｘ２Ｘ３ －
０．４１２ ７５ Ｘ２１－１．２７７ ７５ Ｘ２２－０．２９７ ７５ Ｘ２３ （４）
表１ 试验因素与水平设计
Ｔａｂｌｅ １ Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
水平 Ｘ１丙酮浓度／％ Ｘ２提取温度／℃ Ｘ３超声时间／ｍｉｎ
－１ ４０ ５０ ８０
０ ５０ ６０ １００
１ ６０ ７０ １２０
由表３可知，该模型极显著（Ｐ＜０．０００ １），失拟项不显
著（Ｐ＞０．０５），Ｒ２＝０．９９５ ６，ＲＡｄｊ＝０．９８９ ９，说明该模型拟合
度较好，可用以分析并预测试验结果。因此，可以采用此二
次回归模型确定神秘果种子多酚的最佳提取工艺。
表２ Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ试验设计和结果分析
Ｔａｂｌｅ ２ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ
编号 Ｘ１ Ｘ２ Ｘ３ 提取率
１ １ １ ０ １０．０９
２ １ ０ －１ １１．１９
３ ０ １ －１ ９．７８
４ ０ ０ ０ １１．５４
５ ０ ０ ０ １１．４５
６ ０ ０ ０ １１．５６
７ ０ ０ ０ １１．４８
８ ０ －１ －１ １０．０１
９ １ ０ １ １０．９４
１０ －１ ０ －１ １０．５７
１１ －１ １ ０ ９．４５
１２ １ －１ ０ １０．０２
１３ ０ ０ ０ １１．４６
１４ －１ －１ ０ ９．６７
１５ ０ －１ １ ９．９０
１６ ０ １ １ １０．００
１７ －１ ０ １ １０．４５
表３ 二次响应面回归模型方差分析
Ｔａｂｌｅ ３ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅａｎ ｓｑｕａｒｅ
方差来源 平方和 自由度 均方 Ｆ值 Ｐ值 显著性
模型 ９．１２０ ９ １．０１０ １７５．８６ ＜０．０００ １ ＊＊
Ｘ１ ０．５５０ １ ０．５５０ ９５．６８ ＜０．０００ １ ＊＊
Ｘ２ ９．８×１０－３ １ ９．８×１０－３ １．７０ ０．２３３ ４
Ｘ３ ８．４５×１０－３ １ ８．４５×１０－３ １．４７ ０．２６５ ２
Ｘ１Ｘ２ ０．０２１ １ ０．０２１ ３．６５ ０．０９７ ７
Ｘ１Ｘ３ ４．２２５×１０－３ １ ４．２２５×１０－３ ０．７３ ０．４２０ ２
Ｘ２Ｘ３ ０．０２７ １ ０．０２７ ４．７３ ０．０６６ ２
Ｘ２１ ０．７２０ １ ０．７２０ １２４．５０ ＜０．０００ １ ＊＊
Ｘ２２ ６．８７０ １ ６．８７０ １ １９３．１６ ＜０．０００ １ ＊＊
Ｘ２３ ０．３７０ １ ０．３７０ ６４．７９ ＜０．０００ １ ＊＊
残差 ９．６８０×１０－３ ７ ５．７６１×１０
－３
失拟项 ０．０３１ ３ ３ ０．０１０ ４．２２ ０．０９８ ９不显著
纯误差 ９．６８０×１０－３ ４ ２．４２０×１０－３
＊＊表示０．０１水平上显著。
６７１
提取与活性 ２０１５年第６期
由表３还可知，二次回归模型中Ｘ１、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３对提取效
果的曲面效应极显著（Ｐ＜０．０００ １）；各因素对神秘果种子多
酚提取率的影响程度，从大到小依次为：丙酮浓度＞提取温
度＞超声时间。
２．４．３ 各因素交互作用分析 图５可以直观地看出，Ｘ１Ｘ２和
Ｘ２Ｘ３交互作用的曲面较为陡峭，Ｘ１Ｘ３交互作用的曲面较为平
滑。结合表３中Ｐ值可知，Ｘ１Ｘ２、Ｘ２Ｘ３和Ｘ１Ｘ３的交互作用均
不显著（Ｐ＞０．０１），两因素交互作用对神秘果种子多酚提取率
的影响程度，从大到小依次为：Ｘ２Ｘ３＞Ｘ１Ｘ２＞Ｘ１Ｘ３。
２．４．４ 验证实验 将优化后的模型通过Ｄｅｓｉｇｎ ｅｘｐｅｒｔ软件
分析得到的最佳工艺条件：丙酮浓度５０．３２％与０．２２ｇ硫酸
铵形成 的 双 水 相 体 系，提 取 温 度 ５９．９９ ℃，超 声 时 间
９９．９３ｍｉｎ。此时的预测提取率为１１．５４％。为简化操作，选
丙酮浓度５０％，提取温度６０℃，超声时间１００ｍｉｎ，平行实验
验证３次，多酚提取率分别为１１．５７％，１１．５８％，１１．５３％，平
图５ 两因素交互作用对神秘果种子总多酚
提取率的响应曲面图
Ｆｉｇｕｒｅ ５ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌｏｔｓ ｆｏｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ
ｏｎ ｔｏｔａｌ ｙｉｅｌｄ ｆｒｏｍＳｙｎｅｓｐａｌｕｍ ｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍｓｅｅｄ
均值为１１．５６％，与模型预测值相差极小，重复性高，进一步
验证了该数学模型的合理性。
２．５ 大孔树脂纯化前后多酚纯度的测定
采用福林酚法测得超声波辅助丙酮—双水相体系提取
多酚纯度为８７．８５％，再经Ｘ－５大孔树脂纯化后神秘果种子
多酚纯度为９２．４２％，前期试验以丙酮为溶剂超声波提取得
到的多酚纯度为７４．４３％。因此，采用双水相体系可实现初
步纯化，其效果优于单独采用超声波提取。
２．６ 不同提取条件下神秘果种子多酚抗氧化性比较
２．６．１ 不同浓度丙酮提取的多酚 ＤＰＰＨ·清除率和还原能
力的比较 由图６可知，随着丙酮浓度的增大，对ＤＰＰＨ·
的清除率和还原能力均呈先增大后减小的趋势，当丙酮浓度
为５０％和６０％时，对ＤＰＰＨ·清除率分别达到５９％和５５％。
经试验，ＶＣ 对ＤＰＰＨ·的半数抑制浓度为０．２３ｍｇ／ｇ（即清
除率为５０％时所需ＶＣ的浓度），且试验时均以此浓度多酚为
样品。说明当丙酮浓度为５０％和６０％时，神秘果种子多酚
化合物的ＤＰＰＨ·清除率优于抗坏血酸。同时由于提取剂
浓度的高低不同，导致提取液中各有效成分的含量差异对
ＤＰＰＨ·的清除能力的影响很大［１６］，而不仅仅与总多酚含量
有关。
２．６．２ 不同提取温度提取的多酚 ＤＰＰＨ·清除率和还原力
的比较 由图７可知，当温度为６０℃时，ＤＰＰＨ·清除能力
和还原力同时达到最强。温度过高或过低丙酮提取物清除
ＤＰＰＨ·的能力和还原能力很差。这是因为温度过低，酚类
图６ 不同浓度丙酮提取的多酚 ＤＰＰＨ·清除率和
还原能力的比较
Ｆｉｇｕｒｅ ６ ＤＰＰＨ·ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｒａｔｅ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐｏｗｅｒ
ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｃｅｔｏｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
图７ 不同温度提取的多酚 ＤＰＰＨ·清除率和
还原能力的比较
Ｆｉｇｕｒｅ ７ ＤＰＰＨ·ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｒａｔｅ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐｏｗｅｒ ｆｏｒ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
７７１
第３１卷第６期 马艺丹等：神秘果种子多酚超声双水相复合提取工艺及其抗氧化活性
化合物不能完全溶出，导致多酚含量很低，不能充分发挥清
除ＤＰＰＨ·能力和还原力。而温度过高部分多酚化合物发
生分解，使多酚含量大大降低，同时清除ＤＰＰＨ·的能力和
还原力也随之大幅度下降。
２．６．３ 不同提取时间提取的多酚 ＤＰＰＨ·清除率和还原力
的比较 由图８可知，随着时间的延长，ＤＰＰＨ·的清除率呈
先增加后减少的趋势，在１００ｍｉｎ时，清除率达到最大为
６２％，同时，还原力也表现为同样的趋势。进一步说明，神秘
果种子多酚具有一定的清除ＤＰＰＨ·能力和还原力的。
图８ 不同时间提取的多酚 ＤＰＰＨ·清除率和
还原能力的比较
Ｆｉｇｕｒｅ ８ ＤＰＰＨ·ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｒａｔｅ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐｏｗｅｒ
ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ
２．６．４ 不同料液比提取的多酚ＤＰＰＨ·清除率和还原力的
比较 由图９可知，料液比为１∶１０（ｍ∶Ｖ）时，清除ＤＰＰＨ·
的能力和还原能力都较差；１∶２０（ｍ∶Ｖ）时，ＤＰＰＨ·清除率
和还原力同时达到最强，继续加大料液比，ＤＰＰＨ·清除率
先大幅度下降后慢慢降低。还原力也基本保持与ＤＰＰＨ·
清除率同样的趋势。
图９ 不同料液比提取的多酚 ＤＰＰＨ·清除率和
还原能力的比较
Ｆｉｇｕｒｅ ９ ＤＰＰＨ·ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｒａｔｅ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐｏｗｅｒ
ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ
３ 结论
（１）本试验采用超声波与双水相复合提取神秘果种子
多酚，多酚存在于丙酮—硫酸铵双水相体系的丙酮相中，水
溶性杂质则分配到盐相中，得到的多酚纯度为８７．８５％。前
期试验以丙酮为溶剂超声波提取 得 到 的 多 酚 纯 度 为
７４．４３％。说明此双水相体系初步实现了多酚与杂质分离，
进而大大提高了多酚的纯度。响应面法优化神秘果种子多
酚最佳提取工艺为：丙酮浓度５０％与０．２２ｇ硫酸铵形成双
水相体系，提取温度６０℃，超声时间１００ｍｉｎ。实际提取率
为１１．５６％与预测理论数值（１１．５４％）接近，说明该模型可以
为神秘果种子多酚提取提供预测和理论依据。
（２）抗氧化性试验表明，神秘果种子多酚具有较强的抗
氧化性和还原能力，且还原能力和ＤＰＰＨ·清除率与单因素
试验中多酚提取率具有相同趋势，说明其还原能力与对
ＤＰＰＨ·清除能力总多酚的含量呈正相关。当总多酚含量
相同时，不同条件提取物对ＤＰＰＨ·清除能力相差较大，可
能是酚类化合物具有多样性且与提取物中其他的抗氧化组
分协同作用，而不同条件提取物中各有效成分含量存在差
异。因此，下一步将对不同提取条件下提取的多酚化合物的
分子结构和含量进行深入研究。
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