全 文 ：第23卷第36期 中国现代医学杂志 Vol. 23 No.36
2013年12月 China Journal of Modern Medicine Dec. 2013
文章编号： 1005-8982（2013）36-0011-04
·论著·
地锦草水提液对H22荷鼠VEGF、
MMP-9蛋白表达的影响*
邹志坚 1，胡建新 1，王晓敏 2，高增光 2
（1.南昌大学第四附属医院 肿瘤科，江西 南昌 330003；2.江西
中医药大学 基础医学院，江西 南昌 330004）
摘要：目的 研究地锦草对 H22荷瘤小鼠的抑瘤作用并探讨其 VEGF、MMP-9蛋白表达的影响。方法
建立 H22肝癌皮下移植瘤模型, 随机分为模型对照组、地锦草高剂量组（265 mg/kg）、地锦草中剂量组（132
mg/kg）、地锦草低剂量组（66 mg/kg）、环磷酰胺组（50 mg/kg）。观察小鼠的一般状态和肿瘤生长情况，灌胃给药
14 d后处死小鼠，分别剥离瘤组织，测量肿瘤体积大小。免疫组化法观察各组肿瘤组织中 VEGF、MMP-9蛋白
表达情况。结果 地锦草治疗组小鼠一般情况良好，肿瘤体积明显缩小（P <0.05）；免疫组化结果显示：VEGF、
MMP-9阳性表达定位于细胞浆中，呈棕黄、棕褐及浅黄色，胞质染色。模型组 VEGF、MMP-9蛋白表达增强，
地锦草与环磷酰胺组 VEGF、MMP-9蛋白表达下降（P <0.05）；且 VEGF、MMP-9蛋白表达无直接相关性。结
论 地锦草能抑制荷瘤小鼠的肿瘤的生长。抑制荷瘤小鼠肿瘤组织的 VEGF、MMP-9蛋白的表达，从而减少
肿瘤的血管生成和基质的降解可能是其部分机制之一。
关键词：地锦草；VEGF；MMP-9；H22荷鼠
中图分类号：R-332 文献标识码：A
Effect of Euphorbiae humifusae herb on expressions of
VEGF, MMP-9 on H22 cells bearing Mice*
ZOU Zhi-jian1, HU Jian-xin1, WANG Xiao-min2, GAO Zeng-guang2
(1.Department of Oncology, the Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang,
Jiangxi 330002, P.R.China; 2.School of Basic Medical Sciences, Jiangxi University of Traditional
Chinese Medicine, Nanchang, Jiangxi 330004, P.R.China)
Abstract:【Objective】To study the effects of Euphorbiae humifusae herb(EHH) on antitumor and the expression
of vascular endothelial growth factor (VEGF), matrix metalloproteinases-9 (MMP-9) on H22 cells bearing mice.
【Methods】H22 liver cancer cells were inoculated in the right axilla to prepare solid tumor models. Five groups
were randomized in each batch, named model control group, a high-dose group, a middle dose group and a low-dose
group, a positive control group. Different doses of EHH (265, 132, 66 mg/kg) were ip administered to H22 cells
bearing mice once a day for continuous 14 d. The tumor was weighted, while histopathological morphology of the tu－
mor was observed under optical microscope. Using immunohistochemical method, the protein expression of VEGF
and MMP-9 in tumor tissues was determined. 【Results】The size of tumor in EHH treat groups was much smaller
than that in control group (P ＜0.05). The immunohistochemical results showed that the expressions of VEGF and
MMP-9 were decreased in EHH treat groups (P ＜0.05). 【Conclusion】EHH acts on the inhibition of H22 cells
bearing mice and its mechanism is probably related to decrease the expressions of VEGF and MMP-9 in H22 cells
bearing mice.
Key words: Euphorbiae humifusae herb; VEGF; MMP-9; H22 cells bearing mice
收稿日期：2013-03-18
*基金项目：江西省自然基金项目（No：2008GZY0018）；江西省卫生厅科技项目（No：20131104）
[通信作者] 王晓敏，E-mail：857520364@qq.com
11· ·
中国现代医学杂志 第23卷
地锦草为大戟科植物是常用清热解毒中药材之
一，味苦、平、无毒[1]。其化学成分主要含黄酮类，如槲
皮素及其单糖苷、异槲皮苷、黄芪苷等[2-3]。既往研究
发现，其有明显的体外抗肿瘤作用，且其作用机制是
多环节、多途径的[4]。本研究采用H22肝癌皮下移植
瘤小鼠模型进行体内抗肿瘤试验，探讨地锦草的体
内抗肿瘤作用及其可能的作用机制，为地锦草的进
一步开发利用提供理论依据。
1 材料和方法
1.1细胞株与实验动物
小鼠肝癌细胞株H22由江西中医药大学保存，
SPF级纯系 BALB/c小鼠，体质量 18~22 g，6~8 周
龄，雄性，购自江西中医药大学实验动物中心，实验
动物使用许可证号：合格2012-0006，实验室常规饲
养。
1.2 药物与试剂
地锦草购自安微毫州市永刚饮片厂有限公司。
环磷酰胺购自江苏恒瑞医药股份有限公司。RPMI
1640 培养基为美国 Gibco 公司产品，胎牛血清
（FCS）为杭州四季青生物工程公司产品。抗VEGF、
MMP-9抗体工作液（兔源多克隆抗体，购北京中杉
生物试剂公司）；SP 免疫组织化学检测试剂盒及
DAB显色盒（购自北京中杉生物试剂公司）。
1.3 主要仪器
NC202型电热恒温干燥箱（江西电热设备厂制
造），LH50A倒置相差显微镜（日本Olympus公司），
徕卡DFC420彩色数码CCD图像采集系统（德国徕
卡，500万像素）；Image–Pro Plus 6.0（美国冷泉）。
1.4 方法
1.4.1 H22荷鼠的建立 将接种H22瘤种7d的腹
水瘤小鼠以脱颈法处死，无菌条件下抽取腹水瘤细
胞悬液5mL经离心稀释，用生理盐水重新悬浮细
胞，细胞悬液浓度为1×106/mL。以每只0.2mL接种
于昆明种小鼠右腋下，建立H22荷鼠模型[4]。
1.4.2 小鼠肝癌 H22细胞的培养及传代 将腹水
型小鼠肝癌H22细胞，于37℃、5%二氧化碳培养
箱，用含10% FCS的RPMI 1640完全培养基悬浮
培养。取最佳生长状态的小鼠肝癌H22细胞，浓度
调为5×106/mL，以 0.2 mL/只（1×106个细胞 /只）
无菌注入BALB/c小鼠腹腔进行接种传代，于接种7
d左右，小鼠腹部膨隆，出现血性腹水，可用于小鼠
皮下移植瘤的接种。
1.4.3 分组及处理 小鼠皮下接种 H22 细胞 24 h
后称体质量，随机分为6组，每组15只，分别低、中、
高剂量组、环磷酰胺组和模型对照组。分别灌胃不同
剂量的地锦草低、中、高剂量组按照 66、132、 65
mg/（kg·d）剂量灌胃14d，环磷酰胺组按照50/mg
（kg·d）尾静脉注射1次。
1.4.4 H22 荷鼠生长和一般情况变化 每日观察
H22荷鼠的生长情况，并记录各组小鼠的精神状态、
一般活动、皮毛、饮食及粪便等情况。观察期间隔日
称体质量。处死后并于末次给药后次日，称体质量
后，剥取瘤组织，称质量，用游标卡尺测量皮下移植
瘤体的长径与宽径，计算肿瘤体积[8]（肿瘤体积=长
径×宽径2×1/2）绘制肿瘤生长曲线。
1.4.5 免疫组化法分析 VEGF和MMP-9蛋白表达
肿瘤组织标本常规石蜡包埋，切片，厚度约2μm。脱
蜡、水化后以 3% H2O2室温孵育10 min，消除内源
性过氧化物酶的活性，热修复抗原5min。滴加抗体
VEGF（1∶50）或MMP-9（1∶150）37℃孵育2h，
DAB室温下显色。苏木素复染，脱水、透明、中性树
胶封片。并设阳性对照和阴性对照，用已知的阳性切
片为阳性对照；以PBS代替一抗，作为阴性对照。
VEGF和MMP-9蛋白均在胞浆中表达，呈现不同程
度的黄色或棕褐色颗粒，每张切片选取5个400倍
视野，采用 Image-Pro Plus（IPP）6.0 图像分析系统
计算阳性区域内的光密度平均值（integrated optical
density，IOD）/阳性区域的面积（area）。
1.5 统计学方法
应用SPSS 13.0软件对所有数据进行统计学处
理，结果以均数±标准差（x±s）表示多组间进行单
因素方差分析，两两比较方差齐时LSD检验，方差
不齐时用Dunnett’s T3检验。采用Pearsaon相关分
析。
2 结果
2.1地锦草对H22荷鼠肿瘤生长的影响
于皮下接种瘤细胞后第4天，模型组小鼠可触
摸到颗粒状肿瘤，生长迅速，于实验后期由于肿瘤过
大而活动受限，个别出现瘤块坏死穿破皮肤现象，并
有3只小鼠死亡。地锦草剂量组和环磷酰胺组小鼠
皮下瘤块出现的时间普遍晚于模型组，于接种后第
6天或以后才出现肿瘤，且生长速度也较模型组明
显缓慢，部分小鼠瘤体较原来逐渐缩小。地锦草各剂
量组和环磷酰胺组小鼠外观、毛色、活动及进食、饮
12· ·
A B C D E
A：模型对照组；B：环磷酰胺组；C：高剂量组；D：中剂量组；E：低剂量组
图2 各组肿瘤组织的VEGF蛋白表达的变化（SP×400）
A B C D E
A：模型对照组；B：环磷酰胺组；C：高剂量组；D：中剂量组；E：低剂量组
图3 各组肿瘤组织的MMP-9蛋白表达的变化（SP×400）
第36期 邹志坚，等：地锦草水提液对H22荷鼠VEGF、MMP-9蛋白表达的影响
水、粪便等一般状态均比模型组小鼠良好，见图1。
2.2 地锦草对H22荷鼠肿瘤组织VEGF和MMP-
9蛋白表达的影响
VEGF和MMP-9蛋白表达均定位于细胞浆中，
呈棕黄、棕褐及浅黄色。给药组的VEGF蛋白表达均
下降。高剂量组VEGF蛋白表达下降，与对照组比较
差异有显著性（P<0.1），且与环磷酰胺组比较，差
异也有显著性（P<0.5）。但中、低剂量组与模型对
照组比较，差异无显著性（P>0.5）。给药组的
MMP-9蛋白均下降，与对照组比较差异有显著性（P
<0.1），各剂量组之间差异无显著性（P>0.5）。见附
表和图2、3。
附表 地锦草对H22荷鼠组织VEGF和MMP-9蛋白表达
的影响 （n=10，x±s））
注：1）与模型组比较有显著差异，P<0.05；2）与环磷酰胺组比较
有显著差异，P<0.05
2.4各组VEGF和MMP-9蛋白表达的相关性
Pearsaon 相关分析 VEGF 和 MMP-9 蛋白表达
水平相关系数 R=0.105，P=0.641，表明 VEGF 和
MMP-3蛋白表达水平存在正相关，但相关关系并不
密切。
组别 VEGF（IOD/Area） MMP-9（IOD/Area）
模型对照组 0.261±0.028 0.4283±0.0 82
环磷酰胺组 0.244±0.026 0.2940±0.02291）2
高剂量组 0.155±0.0171）2） 0.3095±0.02971）2
中剂量组 0.227±0.045 0.3099±0. 3791）2
低剂量组 0.214±0.0571）2 0.3220± .05001）2
图1 地锦草对肿瘤生长的影响
6
5
4
3
2
1
0
肿
瘤
体
积
/
m
m3
模型组
环磷酰胺组
高剂量组
中剂量组
低剂量组
6d 9d 12d 15d
3 讨论
动物移植性肿瘤模型是目前抗癌药物研究的重
要方法之一。本研究采用选用 BALB/c 小鼠肝癌
H22皮下移植瘤模型。模型组出现肿瘤时间早，瘤体
增长快，且与周围组织粘连，难剥离，瘤组织血管丰
富，实验过程并有3只小鼠死亡。地锦草剂量组和环
磷酰胺组小鼠皮下瘤块出现的时间普遍晚于模型
组，且生长速度也较模型组明显缓慢，部分小鼠瘤体
较原来逐渐缩小，且未见小鼠死亡情况。地锦草各剂
量组和环磷酰胺组小鼠外观、毛色、进食等一般情况
均比模型组小鼠良好，说明地锦草有良好体内抗肿
瘤作用。
新血管的形成（angiogenesis）是肿瘤生长和转移
的一种基本病理生理过程，抑制肿瘤组织内血管生
长成为肿瘤防治重要手段之一[5]。血管内皮生长因
子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是作用
最强的血管生成促进因子，促进体内血管内皮细胞
13· ·
中国现代医学杂志 第23卷
有丝分裂和迁移，引起内皮细胞分裂增殖并诱导血
管生成。VEGF还可以增强毛细血管的通透性，促使
血管内的蛋白质出胞构建血管外基质，支持内皮细
胞和成纤维细胞内向移动[6]。在肿瘤组织可以大量
分泌VEGF，肿瘤组织内的血管内皮细胞表达VEG-
FR明显高于正常内皮细胞[7]。VEGF促进肿瘤血管
生成的作用与多种肿瘤的生长、转移和预后密切相
关。肿瘤血管形成早期VEGF可诱导内皮细胞产生
组织因子和基质金属蛋白酶，使凝血酶原转化成凝
血酶，从而激活明胶酶原A降解原来的基膜，促进
内皮细胞增殖。还能通过诱导产生蛋白水解酶、间质
胶原酶和组织因子来促进血管生成，进而为新生毛
细血管网的建立、肿瘤浸润及转移提供基础[8]。本研
究模型组肿瘤组织中VEGF蛋白表达水平增高，地
锦草高、低剂量组和环磷酰胺组则明显降低VEGF
蛋白表达水平，提示其可能通过抑制肿瘤组织分泌
VEGF，从而减少肿瘤组织的血管生成。
基质金属蛋白酶 （matrix metallproteinases，
MMPs）降解胞外基质中蛋白质以及纤维黏连蛋白、
层黏连蛋白等胞外基质成分，是水解胞外基质的最
主要的酶类[9]。其中MMP-9是MMPs中分子量最大
的酶，降解ECM中的v型胶原和明胶，将胞外基质
水解形成孔道，便于肿瘤细胞向周围组织侵袭或发
生转移[10]。研究表明VEGF通过诱导内皮细胞产生
MMPs或通过调控其抑制物的平衡，激活基质降解
的一系列反应，使肿瘤细胞穿透性增强，引起肿瘤的
浸润、转移[11-12]。本研究结果提示模型组MMPs蛋白
表达升高，地锦草组MMPs蛋白表达明显下降，且
VEGF蛋白表达水平也降低，经Pearsaon相关性统
计结果两者呈正相关，但无直接相关，可能地锦草对
肝癌H22皮下移植瘤的生长和转移受多种因素的
调控。本研究结果表明地锦草的抗肿瘤作用机制可
能减少血管生成和抑制基质酶类活性来抑制肿瘤生
长，达到抗肿瘤作用。为地锦草作为抗肿瘤药物的开
发奠定了基础，但其具体起作用的有效成分和确切
的分子机制尚有待更深入地研究探讨。
参 考 文 献：
[1] 徐良波,欧阳松山,王跃华.地锦颗粒长期毒性实验[J].中国中西医
结合消化杂志,2008,16(6):393-395.
[1] XU LB, OUYANG SS, WANG YH. Kam particles long-term
toxicity experiment[J]. Chinese Journal Integrate Tradition West
Medical Digest, 2008, 16(6): 393-395. Chinese
[2] 王婷婷,文今福,金松南.地锦草的化学成分及药理作用研究进展
[J].泰山医学院学报,2012,33(8):629-632.
[2] WANG TT, WEN JF, JIN SN. The chemical components and
pharmacological effects of euphorbia humifusa research progress
[J]. Journal of TaiShan Medical College, 2012, 33 (8): 629-632.
Chinese
[3] 姚松学,李春华,蔡高玉,等.地锦草的药理作用研究[J].亚太传统医
药,2010,6(9):144-145.
[3] YAO SX, LI CH, CAI GY, et al. The Pharmacological effect of
euphorbia humifusa willd (EHW) [J]. Asia-Pacific Traditional
Medicine, 2010, 6(9): 144-145. Chinese
[4] 玮 罕,耿果霞,李青旺,等.地锦草抗宫颈癌活性研究[J].中国畜牧
兽医,2010,37(3):192-194.
[4] WEI H, GENG GX, LI QW, et al. Grass dissolving activity a-
gainst cervical cancer[J]. China Animal Husbandry & Veterinary
Medicine, 2010, 37(3): 192-194. Chinese
[5] 张 静,杨 光,单保恩,等.杠柳苷对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及
其机制研究[J].中草药,2010,41(8):1307-1310.
[5] ZHANG J, YANG G, SHAN BE, et al. Antitumor effect of
periplocin from Periplocae Cortexon H22 tumor-bearing mice and
its mechanism[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2010,
41(8): 1307-1310. Chinese
[6] BIRK DM, BARBATO J, MUREEBE L, et al. Current insight on
the biology and clinical aspects of VEGF regulation[J]. Vasc En-
dovascular Surg, 2008, 42(6): 517-530.
[7] TAKAHASHI H, SHIBUYA M. The vascular endothelial growth
factor (VEGF)/VEGF receptor system and its role under physio-
logical and pathological conditions[J]. Clin Sci, 2005, 109(3): 227-
241.
[8] FANG J, ZHOU Q, LIU LZ, et al. Apigenin inhibits tumor an-
giogenesis through decreasing HIF-1alpha and VEGF expression
[J]. Carcinogenesis, 2007, 28(4): 858-864.
[9] KABASHIMA A, MAEHARA Y, KAKEJI Y, et al. Clinicopatho-
logical features and overexpression of matrix metalloproteinases in
intramucosal gastric carcinoma with lymph node metastasis[J].
Clinical Cancer Research, 2000, 6(9): 3581-3584.
[10] RYDLOVA M, HOLUBEC L JR, LUDVIKOVA M JR, et al.
Biological activity and clinical implications of the matrix metal-
loproteinases[J]. Anticancer Research, 2008, 28(2B): 1389-1397.
[11] DURLIK M, GARDIAN K. Metalloproteinase 2 and 9 activity in
thedevelopment of pancreatic cancer[J]. Pol Przegl Chir, 2012,
84(8): 377-382.
[12] JOBIM FC, SCHWARTSMANN G, XAVIER NL, et al. Expres-
sion of MMP-9 and VEGF in breast cancer:correlation with
other prognostic indicators[J]. Rev Bras Ginecol Obste, 2008, 30
(6): 287-293.
14· ·